专利名称：一种反硝化细菌直接倍比稀释pcr快速定量检测方法
技术领域：
本发明涉及一种反硝化细菌的检测方法。
背景技术：
以往检测反硝化细菌(DNB)主要依据杜氏小管中是否有N2生成，利用格利斯试剂I、格利斯试剂II、二苯胺试剂、浓硫酸是否检测到有NO-2生成和NH3的存在，或是采用气相色谱检测法检测。但以往检测反硝化细菌的方法烦琐，不能定量检测，整个检测过程需要25-29天，对生产和科学研究无法提供有效和即时的数据，而且检测费用高。
发明内容
本发明的目的是为了解决以往检测反硝化细菌的方法烦琐，不能定量检测，检测时间长，无法为生产和科学研究提供有效和即时的数据，检测费用高的问题，而提供的一种反硝化细菌直接倍比稀释PCR快速定量检测方法。本发明通过以下步骤实现(一)菌体的制备；(二)将制备的菌体在冰上进行倍比稀释；(三)倍比稀释液在冰上进行PCR操作；(四)采用三管或五管平行法；(五)PCR扩增；(六)1.0％的琼脂糖电泳检测；(七)观察结果，记数、查表计算得出结论；所述的步骤(三)中PCR的反应体系为20μL由2μL Buffer(10×)，2μL dNTP，1μL 0.1μmol/L的特意引物I DNBF5’-GC[T/C][C/T]ACCAAG[G/C]CGACGATC-3’共19bp、1μL 0.1μmol/L的特意引物IIDNBR5’-ACCAGG GTATCTAATCCTG-3’共19bp、0.3U rTaq酶、11.7μL去离子水和2μL经梯度稀释的样品组成。本发明用已倍比稀释的反硝化细菌菌体作为模板直接进行PCR扩增检测，方法简单，可定量检测，检测时间短，检测费用低，并且可以即时、准确的提供数据用于生产和科学研究。
本发明中使用的器材、药品、试剂和酶均可通过生物制品公司购买得到，药品、试剂和酶按产品说明保存。特意引物I和特意引物II的基因序列由发明人自己设计，生物制品公司合成，-20℃低温保存。
图1是本发明用含有高纯氮气的厌氧管取回的油田污水作检测样，经1.0％的琼脂糖电泳后第1至第4稀释梯度的结果，图2是本发明用含有高纯氮气的厌氧管取回的反应器污水作检测样，经1.0％的琼脂糖电泳后第5至第6稀释梯度的结果，附图上端数字表示稀释梯度。
具体实施例方式
具体实施方式
一本实施方式通过以下述步骤进行(一)菌体的制备取1mL检测样注入到已灭菌的1.5mL的离心管中，在震荡器上充分震荡3-5min，之后在13000r/min下离心1min，离心后弃上清液0.9mL，再向剩余的0.1mL检测样中加入菌体前处理缓冲液0.9mL，然后将离心管置于震荡器上充分震荡5min，再在13000r/min下离心2min，离心后弃上清液0.98mL，再次充分震荡2min即制备完成，短时间保存采用4℃，长时间保存采用-20℃；(二)将制备的菌体在冰上进行倍比稀释吸取2μL菌体加入到PCR管中，再加入18μL的去离子水，用移液枪将其吸打混匀；然后依次从上一稀释梯度的PCR管中吸取菌体2μL加入到下一稀释梯度的PCR管中，加入18μL的去离子水吸打混匀，直到稀释的倍数为103-1012，保留3-7个稀释梯度；(三)在冰上进行PCR操作，PCR反应体系为20μL由2μL Buffer(10×)、2μLdNTP、1μL 0.1μmol/L的特意引物I DNBF5’-GC[T/C][C/T]ACCAAG[G/C]CGACGATC-3’共19bp、1μL 0.1μmol/L的特意引物II DNBR5’-ACCAGGGTATCTAATCCTG-3’共19bp、0.3U rTaq酶、11.7μL去离子水和2μL经梯度稀释的样品组成；(四)采用三管或五管平行法，保留的3-7个稀释梯度，每个稀释梯度作3或5平行样；(五)PCR扩增，扩增程序为94℃预热5min，94℃变性30s，55.9℃复性45s，72℃延伸90s，循环30次，最后72℃延伸10min；(六)1.0％的琼脂糖电泳检测；(七)观察结果，记数、查表计算得出结论。
本实施方式操作在超净工作台下完成，操作前超净工作台需紫外线灭菌20-40min。本实施方式中菌体前处理缓冲母液由70g NaCi、2g KCi、12g Na2HPO4、2g KH2PO4、1‰SDS和1L去离子水组成，将菌体前处理缓冲母液稀释10倍制成工作液，工作液用NaOH调pH值为7.5，在121℃条件下灭菌15-30min后使用。
本实施方式整个过程需要3.5-4h，检测菌落数量级比以往的方法高102，真实的反应了检测样中实际DNB菌的数量，对生产和科学研究有指导性意义，而且费用低廉。
具体实施方式
二本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤(四)采用三管平行法，保留的3-7个稀释梯度，每个稀释梯度作3平行样。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一、二的不同点是步骤(四)采用五管平行法，保留的3-7个稀释梯度，每个稀释梯度作5平行样。
本实施方式步骤(七)反硝化细菌的查表计算方法是选择后三个连续稀释梯度(10x、10x+1、10x+2)，将有菌体DNA条带出现的管数按稀释梯度由小到大的顺序排列成一个三位数称之为条带近似值(abc)。其中，第一个稀释梯度(10x)是最后一个5个试管中都有菌体DNA条带出现的稀释梯度，如果第三个稀释梯度(10x+2)再往下的梯度稀释管仍有菌体DNA条带出现，可将此管数加到第三个稀释梯度(10x+2)上。然后查阅哈尔滨工业大学出版社2002年出版的《污染控制微生物学实验》32-38页“每毫升稀释液的细菌近似值表”得出对应数值，计算出1mL检测样中反硝化细菌的总数。计算公式如下1mL检测样中反硝化细菌的总数(个)＝条带近似值(abc)表中对应数值×三个稀释梯度中第一个稀释梯度的稀释倍数(10x)×10×102％；本实施方式结果表明，三管平行法记录的结果无论在检测样浓度低或高的情况下，数量级上与五管平行法无差别。本实施方式采用五管平行法在于五管平行法可以精确到一个菌体，更加准确，置信度大于99％。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
三的不同点是用含有高纯氮气的厌氧管取回的油田污水作检测样，1.0％的琼脂糖电泳检测结果如图1、图2所示。
本实施方式选择104、105、106三个稀释梯度，条带近似值(540)，查阅哈尔滨工业大学出版社2002年出版的《污染控制微生物学实验》32-38页“每毫升稀释液的细菌近似值表”得出其对应数值13。
从而得出本实施方式中1mL检测样中反硝化细菌的总数(个)＝条带近似值(540)×104×10×102％＝13×104×10×102％＝1.326×106(个)
序列表(1)特意引物I的信息(a)序列特征长度19bp类型核酸链性单链拓扑结构线性(b)分子类型rDNA(c)序列描述特意引物I DNBFGC[T/C][C/T]ACCAAG[G/C]CGACGATC(2)特意引物II的信息(a)序列特征长度19bp类型核酸链性单链拓扑结构线性(b)分子类型rDNA(c)序列描述特意引物II DNBRACCAGGGTATCTAATCCTG
权利要求
1.一种反硝化细菌直接倍比稀释PCR快速定量检测方法，其特征是它通过以下步骤实现(一)菌体的制备；(二)将制备的菌体在冰上进行倍比稀释；(三)倍比稀释液在冰上进行PCR操作；(四)采用三管或五管平行法；(五)PCR扩增；(六)1.0％的琼脂糖电泳检测；(七)观察结果，记数、查表计算得出结论；所述的步骤(三)中PCR的反应体系为20μL由2μL Buffer(10×)，2μL dNTP，1μL 0.1μmol/L的特意引物I DNBF5’-GC[T/C][C/T]ACCAAG[G/C]CGACGATC-3’共19bp、1μL 0.1μmol/L的特意引物II DNBR5’-ACCAGGGTATCTAATCCTG-3’共19bp、0.3U rTaq酶、11.7μL去离子水和2μL经梯度稀释的样品组成。
2.根据权利要求1所述的反硝化细菌直接倍比稀释PCR快速定量检测方法，其特征在于整个操作在超净工作台下完成，操作前超净工作台紫外线灭菌20-40min。
3.根据权利要求1所述的反硝化细菌直接倍比稀释PCR快速定量检测方法，其特征在于步骤(一)菌体的制备方法如下取1mL检测样注入到已灭菌的1.5mL的离心管中，在震荡器上充分震荡3-5min，之后在13000r/min下离心1min，离心后弃上清液0.9mL，再向剩余的0.1mL检测样中加入菌体前处理缓冲液0.9mL，然后将离心管置于震荡器上充分震荡5min，再在13000r/min下离心2min，离心后弃上清液0.98mL，再次充分震荡2min即制备完成，短时间保存采用4℃，长时间保存采用-20℃。
4.根据权利要求3所述的反硝化细菌直接倍比稀释PCR快速定量检测方法，其特征在于菌体前处理缓冲母液由70g NaCi、2g KCi、12g Na2HPO4、2gKH2PO4、1‰SDS和11去离子水组成，将菌体前处理缓冲母液稀释10倍制成工作液，工作液用NaOH调pH值为7.5，在121℃条件下灭菌15-30min后使用。
5.根据权利要求1所述的反硝化细菌直接倍比稀释PCR快速定量检测方法，其特征是步骤(二)中菌体在冰上进行倍比稀释的方法如下吸取2μL菌体加入到PCR管中，再加入18μL的去离子水，用移液枪将其吸打混匀；然后依次从上一稀释梯度的PCR管中吸取菌体2μL加入到下一稀释梯度的PCR管中，加入18μL的去离子水吸打混匀，直到稀释的倍数为103-1012，保留3-7个稀释梯度。
6.根据权利要求1所述的反硝化细菌直接倍比稀释PCR快速定量检测方法，其特征在于步骤(四)采用三管或五管平行法，保留的3-7个稀释梯度，每个稀释梯度作3或5个平行样。
7.根据权利要求1所述的反硝化细菌直接倍比稀释PCR快速定量检测方法，其特征在于步骤(五)PCR扩增的扩增程序为94℃预热5min，94℃变性30s，55.9℃复性45s，72℃延伸90s，循环30次，最后72℃延伸10min。
全文摘要
一种反硝化细菌直接倍比稀释PCR快速定量检测方法，它涉及一种反硝化细菌的检测方法。它解决了以往检测反硝化细菌的方法繁琐，不能定量检测，检测时间长，无法为生产和科学研究提供有效和即时的数据，检测费用高的问题。它通过以下步骤实现(一)菌体的制备；(二)将制备的菌体在冰上进行倍比稀释；(三)倍比稀释液在冰上进行PCR操作；(四)采用三管或五管平行法；(五)PCR扩增；(六)1.0％的琼脂糖电泳检测；(七)观察结果，记数、查表计算得出结论。本发明中经倍比稀释的反硝化细菌直接进行PCR检测，方法简单，可定量检测，检测时间短，检测费用低，并且可以即时、准确的提供数据用于生产和科学研究。
文档编号C12Q1/04GK1769471SQ20051001045
公开日2006年5月10日 申请日期2005年10月21日 优先权日2005年10月21日
发明者马放, 魏利 申请人:哈尔滨工业大学