一种海水硝酸盐氮氧稳定同位素测定的方法
【专利摘要】本发明属于水体硝酸盐污染治理与控制【技术领域】，具体的说是一种海水硝酸盐氮氧稳定同位素测定的方法。利用无N2O还原酶活性的反硝化细菌将待测海水中硝酸盐进行离线处理后转化为氧化亚氮气体，使用痕量气体预浓缩装置(Precon)-气相色谱(GC)-同位素比质谱仪(MS)联机进行氮氧稳定同位素的在线连续测定。本发明优化了反硝化细菌培养方法，改进培养基配方，不再添加硝酸盐,培养效果更佳，细菌生长稳定，无需检验富集培养后的培养基是否残留硝酸盐，不会对后续样品处理造成污染；该培养基细菌富集效果好，细菌培养周期短、效率高，并且降低了培养成本。
【专利说明】
一种海水硝酸盐氮氧稳定同位素测定的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于水体硝酸盐污染治理与控制【技术领域】，具体的说是一种海水硝酸盐氮氧稳定同位素测定的方法。
【背景技术】
[0002]近几十年来，随着社会经济的迅速发展和人类活动的加剧，工业、生活、农业活动产生的大量污染物进入近岸海域，导致我国近海海域氮营养盐浓度严重超标，海域富营养化程度逐年严重，赤潮频繁发生。因此，控制近海海域的氮污染，研究水体中氮的来源以及生物地球化学循环显得尤为重要。
[0003]稳定同位素方法作为一门新兴技术，已被广泛应用于海洋学的研究。在海洋氮循环和海洋生物地球化学研究中，氮同位素有着不可替代的独特作用。稳定氮同位素组成的变化可以示踪氮的来源，判断氮的生物地球化学过程，还可以作为河口海域富营养化程度的指示参数。因此，利用稳定氮同位素方法来研究海水体系中氮的迁移、转化等环境生物地球化学过程，揭示其环境行为，具有重要的科学意义和现实意义。
[0004]为满足质谱仪进样要求，硝酸盐氮氧同位素测定前需要对硝酸盐进行预处理，目前常用的预处理方法有:高温燃烧法、叠氮化钠法、细菌反硝化法。高温燃烧法利用阴离子交换树脂吸附和富集no3_，不适用于成分复杂的海水样品的预处理。叠氮化钠法利用叠氮化物将N03_转化为N2O,具有一定爆炸危险性。细菌反硝化法利用缺乏N2O还原酶的反硝化细菌将N03_转化为N2O,通过质谱仪分析N2O的δ15Ν和δ180，前处理简单易行、操作时间短、分析成本低、所需样品量小，适用于海水样品的硝酸盐氮氧同位素测定。细菌反硝化法已在国外广泛应用，目前国内反硝化法测定硝酸盐氮氧同位素的应用很少，影响该方法在国内广泛推广的原因主要有:(I)反硝化细菌培养条件要求较为苛刻，培养不连续、不稳定均会影响样品预处理结果；(2)国内外常用的反硝化细菌培养配方中添加了硝酸盐，若细菌富集培养过程未消耗净添加的硝酸盐，会污染样品，对样品测定造成误差。(3)N2O气体的在线连续测定一般常用Tracegas或Gasbench进行气体的预浓缩和分离,这些仪器价格较为昂贵，国内已购置这些仪器的单位较少，限制了该方法在国内的应用。
【发明内容】
[0005]本发明针对现有技术的不足，提供一种海水硝酸盐氮氧稳定同位素测定的方法。
[0006]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:一种海水硝酸盐氮氧稳定同位素测定的方法，利用无N2O还原酶活性的反硝化细菌将待测海水中硝酸盐进行离线处理后转化为氧化亚氮气体，使用痕量气体预浓缩装置(Precon)-气相色谱(GC)-同位素比质谱仪(MS)联机进行氮氧稳定同位素的在线连续测定。
[0007]所述离线处理是将无N2O还原酶活性的反硝化细菌接种到牛肉膏蛋白胨培养液中，恒温震荡(30°C，120rpm)富集培养5_10天，待细菌生长旺盛后，将菌液离心，使得菌液浓度浓缩至富集培养后菌液浓度的10-20倍，震荡混匀后加入抑泡剂(Sigma)，待用。
[0008]将上述离线处理后所得浓缩菌液置于样品瓶中，样品瓶倒置连接到曝气装置上，并通氦气吹扫菌液及样品瓶顶空气3h，而后注入待测水样使样品中硝酸盐氮含量为
0.2-20 μ g，倒置放于恒温摇床20-30°C震荡过夜培养，培养后离心并使用Precon-GC-MS联机测定，得出N2O氮氧稳定同位素值。
[0009]另，将上述测定的氮氧同位素测试结果进行校正，使用多点校正法，取国际原子能标准品USGS32、USGS34以及USGS32和USGS34混合配制后的标准品共五个标准品，标准品与样品一起进行同样的离线处理并同一批次测定，使用五个标准品的测量值和真值建立标准曲线，对样品测定结果进行校正。
[0010]所述无N2O还原酶活性的反硝化细菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，分类学命名为pseudomonas.chlororaphis subsp Aureofaciens (绿针假单胞菌金色亚种)，保藏编号为CGMCC1.3351。
[0011]所述固体牛肉膏蛋白胨培养基的配方为:2.5-3.5g牛肉膏，9.5-10.5g蛋白胨，
4.5-5.5g氯化钠，14.5-15.5g琼脂，1.0L去离子水；液体牛肉膏蛋白胨培养液的配方为:
2.5-3.5g牛肉膏，9.5-10.5g蛋白胨，4.5-5.5g氯化钠，1.0L去离子水。
[0012]相对于现有技术，本发明具有以下优点:
[0013]1.本发明优化了反硝化细菌培养方法，改进培养基配方，不再添加硝酸盐，培养效果更佳，细菌生长稳定，无需检验富集培养后的培养基是否残留硝酸盐，不会对后续样品处理造成污染；该培养基细菌富集效果好，细菌培养周期短、效率高，并且降低了培养成本。
[0014]2.本发明首次针对Precon进行改造，实现了硝酸盐氮氧稳定同位素的在线连续检测。较国内外常用的tracegas和Gasbench的反硝化组件，Precon价格更低廉，降低了测试成本，推动了国内水体中硝酸盐氮氧同位素测定方法的发展。
[0015]3.本发明提供的检测方式可在线连续的测定，包括反硝化细菌的培养、样品的预处理、样品的在线连续检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为本发明实施例提供的加长进样针。
[0017]图2为本发明实施例提供的20mL顶空瓶进样架。
[0018]图3为本发明实施例提供的40mL顶空瓶进样架。
[0019]图4A和图4B为本发明实施例1提供的硝酸盐氮、氧稳定同位素的标准曲线。
[0020]图5A和图5B为本发明实施例2提供的硝酸盐氮、氧稳定同位素的标准曲线。
【具体实施方式】
[0021]实施例1
[0022]1.反硝化细菌的富集培养
[0023]固体牛肉膏蛋白胨培养基的配方为:3.0g牛肉膏，10.0g蛋白胨，5.0g氯化钠，15.0g琼脂，1.0L去离子水。液体牛肉膏蛋白胨培养液的配方为:3.0g牛肉膏，10.0g蛋白胨，5.0g氯化钠，1.0L去离子水。
[0024]配置固体牛肉膏蛋白胨培养基，高温高压灭菌制备固体平板。划线接种无N2O还原酶活性的反硝化细菌，培养三天后，取单菌落接种至已灭菌的5mL液体牛肉膏蛋白胨培养液中，在摇床上30°C, 120rpm下继续培养一天后,转接至600mL已灭菌的液体牛肉膏蛋白胨培养液中30°C，120rpm下富集培养。
[0025]所述无N2O还原酶活性的反硝化细菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，分类学命名为pseudomonas.chlororaphis subsp Aureofaciens (绿针假单胞菌金色亚种)，保藏编号为CGMCC1.3351。
[0026]2.反硝化细菌的浓缩
[0027]将上述富集培养五天后的菌液于低温离心机中18°C、7500g离心10分钟。移除上层清液后，将离心后底层沉淀细菌加入至一定体积的新鲜已灭菌的牛肉膏蛋白胨培养液，使得配置后菌液浓度为富集培养后菌液浓度十倍，而后菌体震荡混匀，加入约0.5mL抑泡剂(Antiform B Emuls1n, Sigma)备用。
[0028]3.反硝化细菌及样品瓶的净化
[0029]取3mL上述浓缩菌液加入20mL顶空瓶中后，封紧顶空瓶。将样品瓶倒置连接到曝气装置上，连接时曝气装置进气针和出气针均插入倒置的顶空瓶瓶口，进气针置于液面内，出气针置于液面上方顶空，通入氦气吹扫3h，以除去液体及顶空中残余的氧化亚氮，并使样品瓶内充满氦气。
[0030]4.将样品中的硝酸盐转化为N2O
[0031 ] 取净化后样品瓶，使用微量进样器分别加入0.05mL200 μ mol/L的USGS32、
0.05mL200 μ mol/L 的 USGS34、0.05ml200 μ mol/L 的配置标准品 A (配置标准品 A 为四分之一体积的200 μ mol/L USGS32和四分之三体积的200 μ mol/L USGS34混合)、
0.05ml200 μ mol/L的配置标准品B (配置标准品B为二分之一体积的200 μ mol/L USGS32和二分之一体积的200 μ mol/L USGS34混合)、0.05ml200 μ mol/L的配置标准品C (配置标准品C四分之三体积的200 μ mol/L USGS32和四分之一体积的200 μ mol/L USGS34混合)，均设置三个重复样。样品瓶倒置放于恒温摇床30°C过夜培养，细菌将样品中的硝酸盐转化为 N2O0
[0032]5.N2O氮氧稳定同位素的在线连续测定
[0033]取步骤(4)顶空瓶,使用Precon-GC-MS联机测定，具体设置的程序为:precon阶段:氦气作为载气将样品瓶中样品气带到化学肼，然后进行700秒的液氮冷阱I冻存富集，之后升温，将液氮冷阱I中的样品气转移到液氮冷阱II继续冻存280秒，实现待测定N2O气体的富集和分离，消除杂质气体的干扰。富集后N2O经过GC加热的长色谱柱，达到进一步分离N2O和其他杂质气体的目的，最后进入同位素质谱仪进行同位素比值测定。
[0034]Precon的进样针进行相应的改装(图2)，改装后自动进样针可伸入样品液面以下将顶空气及液体中的氧化亚氮均吹出进入Precon，提高样品检测精密度。具体为，根据所选用样品瓶的高度、三通阀和两通阀高度，剪掉原长针和短针上方螺丝后，将较细的长针(I)套设于较粗的短针(2)内。根据样品瓶内液面高度，调整长短针之间距离，使得套针插入样品瓶后，长针位于液面下，短针位于液面上方(样品瓶口处)。将套针接入三通阀(3)，使用配套垫片将在三通阀下口的短针密封。长针伸出三通阀，使用配套垫片将长针与三通阀上口密封好后，再使用配套垫片将长针与两通阀(4)下口密封连接在一起。使用套针时两通阀上口用配套垫片密封接Precon氦气进气管,三通阀左方用配套垫片密封接precon氦气与样品气混合气的出气管。改装后使用套针时氦气进样孔(长针)可以伸入样品液面以下将顶空气及液体中的氧化亚氮均吹出，样品气进而从短针进入Precon，提高样品检测精密度。
[0035]结果如下:
[0036]结果显示，测定硝酸盐标准品的氮氧稳定同位素各自测量值和真实值的标准曲线均线性良好，R2均大于0.99，满足样品测定的要求，可以用于校正同批次未知样品的测量值，获取未知样品的氮氧稳定同位素真实值(图4A，图4B)。该标准曲线实际反映了本次测量所有样品(标准品)真实值和测量值的函数对应关系(线性)，也是从未知样品测量值反推真实值的公式依据。
[0037]所说的在线连续测定，是针对precon-GC-MS联机进行改造，使其适用于反硝化细菌法离线样品制备后的在线连续测定，24小时可完成多达60-70个样品的测定。具体是改装自动进样器进样针，加长进样针长度，使进样针可以伸入样品液面以下，进样时可将液体中的氧化亚氮吹出，从而提高样品检测精密度；将原放置12mL样品瓶的自动进样器样品盘改装为可放置20mL(图2)和40mL(图3)顶空瓶的样品盘，可直接用20mL样品瓶或40mL样品瓶自动进样，无需将样品气转到12mL样品瓶中。
[0038]实施例2
[0039]1.反硝化细菌的富集培养
[0040]固体牛肉膏蛋白胨培养基的配方为:3.0g牛肉膏，10.0g蛋白胨，5.0g氯化钠，15.0g琼脂，1.0L去离子水。液体牛肉膏蛋白胨培养液的配方为:3.0g牛肉膏，10.0g蛋白胨，5.0g氯化钠，1.0L去离子水。
[0041]配置固体牛肉膏蛋白胨培养基，高温高压灭菌制备固体平板。划线接种无N2O还原酶活性的反硝化细菌，培养三天后，取单菌落接种至已灭菌的5mL液体牛肉膏蛋白胨培养液中，在摇床上30°C, 120rpm下继续培养一天后,转接至600mL已灭菌的液体牛肉膏蛋白胨培养液中30°C，120rpm下富集培养。
[0042]所述无N2O还原酶活性的反硝化细菌购自于保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，分类学命名为pseudomonas.chlororaphis subsp Aureofaciens (绿针假单胞菌金色亚种)，保藏编号为CGMCC1.3351。
[0043]2.反硝化细菌的浓缩
[0044]将上述富集培养五天后的菌液于低温离心机中18°C、7500g离心10分钟。移除上层清液后，将离心后底层沉淀细菌加入至一定体积的新鲜已灭菌的牛肉膏蛋白胨培养液，使得配置后菌液浓度为富集培养后菌液浓度十倍，而后菌体震荡混匀，加入约0.5mL抑泡剂(Antiform B Emuls1n, Sigma)备用。
[0045]3.反硝化细菌及样品瓶的净化
[0046]取3mL上述浓缩菌液加入20mL顶空瓶中后，封紧顶空瓶。将样品瓶倒置连接到曝气装置上，连接时曝气装置进气针和出气针均插入倒置的顶空瓶瓶口，进气针置于液面内，出气针置于液面上方顶空，通入氦气吹扫3h，以除去液体及顶空中残余的氧化亚氮，并使样品瓶内充满氦气。
[0047]4.将样品中的硝酸盐转化为N2O
[0048]取净化后样品瓶，使用微量进样器分别加入0.05mL200 μ mol/L的USGS32、
0.05mL200 μ mol/L 的 USGS34、0.05ml200 μ mol/L 的配置标准品 A (配置标准品 A 为四分之一体积的200 μ mol/L USGS32和四分之三体积的200 μ mol/L USGS34混合)、0.05ml200 μ mol/L的配置标准品B (配置标准品B为二分之一体积的200 μ mol/L USGS32和二分之一体积的200 μ mol/L USGS34混合)、0.05ml200 μ mol/L的配置标准品C (配置标准品C四分之三体积的200 μ mol/L USGS32和四分之一体积的200 μ mol/L USGS34混合)、Iml未知海水样品X，均设置三个重复样。样品瓶倒置放于恒温摇床30°C过夜培养，细菌将样品中的硝酸盐转化为N20。
[0049]5.N2O氮氧稳定同位素的在线连续测定
[0050]取步骤(4)顶空瓶,使用Precon-GC-MS联机测定，具体设置的程序为:precon阶段:氦气作为载气将样品瓶中样品气带到化学肼，然后进行700秒的液氮冷阱I冻存富集，之后升温，将液氮冷阱I中的样品气转移到液氮冷阱II继续冻存280秒，实现待测定N2O气体的富集和分离，消除杂质气体的干扰。富集后N2O经过GC加热的长色谱柱，达到进一步分离N2O和其他杂质气体的目的，最后进入同位素质谱仪进行同位素比值测定。
[0051]结果如下:
[0052]结果显示，测定硝酸盐标准品的氮氧稳定同位素各自测量值和真实值的标准曲线均线性良好，R2均大于0.99，满足样品测定的要求，可以用于校正同批次未知样品的测量值，获取未知样品的氮氧稳定同位素真实值(图5A，图5B)。该标准曲线实际反映了本次测量所有样品(标准品及未知样品)真实值和测量值的函数对应关系(线性)，也是从未知样品测量值反推真实值的公式依据。未知海水样品X经公式校正后，其氮氧稳定同位素真实值为:δ 15Nx = 21.4%ο, δ 18Ox = 25.3%。。根据文献，这个值符合海洋中天然丰度的硝酸盐氮氧稳定同位素分布范围。
【权利要求】
1.一种海水硝酸盐氮氧稳定同位素测定的方法，其特征在于:利用无N2O还原酶活性的反硝化细菌将待测海水中硝酸盐进行离线处理后转化为氧化亚氮气体，使用痕量气体预浓缩装置(Precon)-气相色谱(GC)-同位素比质谱仪(MS)联机进行氮氧稳定同位素的在线连续测定。
2.按权利要求1所述的海水硝酸盐氮氧稳定同位素测定的方法，其特征在于: 所述离线处理是将无N2O还原酶活性的反硝化细菌接种到牛肉膏蛋白胨培养液中，在恒温震荡富集培养5-10天后，将菌液离心，取底层沉淀细菌加入牛肉膏蛋白胨培养液中，使得菌液浓度浓缩至富集培养后菌液浓度的10-20倍，震荡混匀后加入抑泡剂(Sigma)，待用。
3.按权利要求1所述的海水硝酸盐氮氧稳定同位素测定的方法，其特征在于: 将上述离线处理后所得浓缩菌液置于倒置的样品瓶中，并通氦气吹扫菌液及样品瓶顶空气3h，而后注入待测水样使样品中硝酸盐氮含量为0.2-20 μ g，倒置放于恒温摇床20-30°C震荡过夜培养，培养后离心并使用Precon-GC-MS联机测定，得出N2O氮氧稳定同位素值。
4.按权利要求1所述的海水硝酸盐氮氧稳定同位素测定的方法，其特征在于: 将上述测定的氮氧同位素测试结果进行校正，使用多点校正法，取国际原子能标准品USGS32、USGS34以及USGS32和USGS34混合配制后的标准品共五个标准品，标准品与样品一起进行同样的离线处理并同一批次测定，使用五个标准品的测量值和真值建立标准曲线，对样品测定结果进行校正。
5.按权利要求1所述的海水硝酸盐氮氧稳定同位素测定的方法，其特征在于:所述无N2O还原酶活性的反硝化细菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，分类学命名为pseudomonas.chlororaphis subsp Aureofaciens (绿针假单胞菌金色亚种)，保藏编号为CGMCC1.3351。
【文档编号】G01N30/02GK104181247SQ201410419225
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年8月22日 优先权日:2014年8月22日
【发明者】俞志明, 于海燕, 吴在兴 申请人:中国科学院海洋研究所