专利名称：一种用于生物质发酵产氢的固定化微生物及制备方法
技术领域：
本发明涉及生物质发酵产氢的固定化的微生物和酶及其制备方法。
背景技术：
氢能是洁净、高效、可再生的能源。生物质原料广泛，利用其制备氢能能够处理有机污染物，是可再生替代能源研究领域中的重要技术。
1937年Nakamura首先报道生物产氢的现象。20世纪80年代初，日本学者Suzuki等利用细胞固定化梭状芽孢杆菌，以酒精厂废水为基质产氢。20世纪90年代，直接以厌氧活性污泥作为天然产氢微生物，以碳水化合物为供氢体，通过厌氧发酵制备出生物氢气，使生物制氢技术向应用转化有了实质性的进展。1994年Tanisho等人采用产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes E.82005)菌株分别进行了连续流非固定化和采用聚氨基甲酸乙酯泡沫对细菌进行固定化的产氢试验，研究表明可持续产氢率由未固定化前的1.5mol H2/mol糖，提高到了固定化后的2.2mol H2/mol糖；1997年Yokoi等人对产气肠杆菌HO-39菌株进行了连续流产氢研究，在非固定化条件下获得了120mLH2/(L.h)的产氢速率，而分别以琼脂凝胶和多孔玻璃对菌种进行固定化处理后，最大产氢率分别提高到240mL H2/(L.h)和850mL H2/(L.h)，较非固定化细胞产氢率分别提高了2倍和7倍；Kumar 2000年的最新研究中，利用椰子壳纤维固定Enterobacter clocae IIT-BT08菌株，在连续里稳定运行中获得了高达62mmol/(L.h)的最大产氢率；Karube等人利用聚丙烯酰胺凝胶包埋固定化Clostridium butyricum细胞进行产氢试验，发现①细胞经固定化后，产氢的pH稳定性增加，游离细胞在pH值小于5.0时即停止产氢，而固定化细胞仍保持产氢活性；②细胞经固定化后，其氢化酶系统稳定性提高，产氢体系得到了保护，使其免受O2的毒害影响，能够连续产氢。但大多数固定化技术对生物质发酵产氢的研究以纯菌种为主，由于纯菌种的固定化处理需要消耗的工作量大，技术复杂因而增加了生物质氢的成本。实际上，生物制氢要达到工业上的发展，底物是十分复杂的混合体，单一菌种很难达到实际应用的要求。因此，采用固定化混合菌种处理底物发酵产氢是必需进行的研究，而这方面研究几乎没有相关报道。
产氢稳定性和持久性是发酵产氢存在的另一问题。要从根本上提高产氢的稳定性和持久性，必须要消除丙酸、丁酸等代谢产物的反馈抑制作用，进行发酵微生物菌群的筛选和改造。Tatsuyu Noike等的研究表明加热预处理厌氧活性污泥可以减少有机酸的积累，增加产氢量，这一现象提示大量有机酸的积累可能来自活性污泥中的常温菌，加温处理后残存的高温型菌株在发酵产氢过程中可减少有机酸的积累。You-kwan Oh等的研究表明在产氢体系中加入磷酸盐也可以减少丙酸的累积，提示发酵过程中维持较低的pH缓冲体系能够减少丙酸的累积而有利于产氢。此外，如何在稳定持续产氢的基础上提高产氢的速率和转化率是发酵产氢研究中的重要内容，也是能否实现产业化应用的关键性因素。而要解决这个问题，必须选育获得高效产氢菌群或菌株和提供适宜产氢菌产氢的生态位。
聚乙烯醇作为微生物包埋固定化材料，具有强度高、化学稳定性好、抗微生物分解性能强、对微生物无毒、价格低廉等一系列优点，是一种具有实用潜力的包埋材料，在国内外获得了较广泛的研究。但是对于固定化技术配方、制作及运行存在的一系列问题有待解决。
发明内容
本发明的目的是针对发酵产氢研究中存在和亟待解决的关键问题，实现以混合菌种固定化微生物对不同生物质原料连续或批量发酵产氢。
本发明通过以下方式实现由以下成分组成的用于生物质发酵产氢的固定化微生物，它具有水热溶制成的聚乙烯醇胶液、与该胶液等体积的悬浮液脱氢酶酶活力≥50U/mL的菌群种液，占二者总体积8～16％膨润土、10～20％CaCO3、0.1～0.2％的半胱氨酸或胱氨酸。
本发明脱氢酶酶活力单位(U)定义为以红四氮唑TTC(2，3，5-triphenyltetrazolium)为底物，样品与底物在40℃下恒温反应2h，以1mL或1g样品在1h内生成的1μg甲簪TPF(triphenylformazan)的量定义为一个酶活单位U。
本发明以脱氢酶为指标进行了产氢微生物的分离和筛选，进行产氢实验表明，脱氢酶酶活与产氢成正比，而且，脱氢酶酶活高的产氢微生物产气量多、气体中氢气含量高、稳定且持续。
本发明菌群种液为单一菌群种液或经驯化后TS为15％～20％的活性污泥混合菌群种液。
发酵产氢微生物，依据它们的生理特征及其产氢机制大致可以分成严格厌氧菌和兼性厌氧菌两大类，本发明包括以上两类微生物。
发酵产氢方式主要有纯培养和混合培养两种，纯培养是利用单一的产氢细菌发酵基质产氢，主要用于发酵产氢的理论研究；混合培养是对若干株纯菌的混合驯化或对厌氧活性污泥的驯化。本发明侧重于后者。
TS(Total Soild)，即总固形物，指一定量的发酵物料在105℃下烘干至恒重所得净重。
本发明在固定化微生物中具有以下配比之助剂之一或组合1～2％Na2S，M＝20mg/L Fe2+、1mg/L Ni2+、100mg/L Fe3+、10mg/L Mg2+、100mg/L K+、1mg/L Mn2+的硫酸盐阳离子，N＝0.1g/L 钼酸根[Mo7O24]6-、1g/L 草酸根[C2O4]2-、5g/L柠檬酸根[C6H5O7]3-、1.5g/LSO42-的铵盐阴离子。
所述固定化微生物中具有Ni2+-Fe3+组合金属离子、钼酸根[Mo7O24]6-—柠檬酸根C6H5O7]3-组合阴离子，或其组合。并且，减少或抑制在混合菌群中的ZnSO4和Zn2+离子。
用于生物质发酵产氢的固定化微生物的制备方法，(1)聚乙烯醇加水热溶制成胶液，(2)取与胶液等体积、且悬浮液脱氢酶酶活力≥50U/mL的菌群种液，按配比加入膨润土、CaCO3、半胱氨酸或胱氨酸、与胶液混合均匀后，冰冻成型后切割为块状。
用1L的生物反应器实验时，冰冻成型的固定化微生物，切割为边长不超过1～1.5cm长方体，用量50～100g/L。
制备中，按配比在聚乙烯醇胶液中添加Na2S；在菌群种液中添加上述硫酸盐阳离子、铵盐阴离子，或以上两种离子的组合。
所述菌群种液中加入Ni2+-Fe3+组合金属离子、钼酸根[Mo7O24]6-—柠檬酸根[C6H5O7]3-组合阴离子、或其组合。
部分加入或不加入硫酸盐阳离子和铵盐阴离子，会引起发酵产氢的氢含量、产气速率、产气量等差别；在工业生产中，加入或不加该离子配剂还取决于生产成本。
本发明以厌氧活性污泥为接种物，进行了下列研究1、对柠檬酸、苹果酸、乳酸、丙酮酸、甲酸、草酸、琥珀酸、富马酸、丁酸、丙酸和乙酸11种有机酸的发酵产氢，表明柠檬酸、苹果酸、乳酸、甲酸、丙酮酸、草酸和富马酸可以实现发酵产氢，其产氢潜力分别为171.3、117.4、93.5、79.6、75.6、24.6和23.7ml/g，而琥珀酸、丁酸、丙酸和乙酸不能发酵产氢；连续发酵除甲酸外，均不能持续产氢。在甲酸体系下进行了蔗糖发酵产氢的实验研究，蔗糖发酵产氢的产气速率平均28.52L/L·d，最高达30.68L/L·d，氢含量43.4％，蔗糖产氢率174ml/g，能源转化率8.29％，适宜的糖浓5-15g/L；蔗糖发酵的产氢速率与国内文献的最大值11.28L/L·d相比高出了18.04％；与日本的5.33L/L·d相比高出了150％；产气率341.2ml/g，与国内文献值340ml/g相当。
2、生物质发酵产氢中金属阳离子的作用，得出以下结论(1)、以混合菌群的生物质发酵产氢，对产氢有促进作用的金属离子组成为Fe2+20mg/L，Zn2+0mg/L，Ni2+1mg/L，Mg2+10mg/L，K+100mg/L，Fe3+100mg/L，Mn2+1mg/L。在此金属离子组成下，以马铃薯水解液为原料的发酵产氢验证发酵气体产生比对照组(12h时气体产生)提前了6h，而且氢气总产量提高了42.10％，总产气量提高了8.06％。
(2)、ZnSO4中的Zn2+离子一般是中性蛋白酶的活性中心离子，能够促进蛋白酶活性，对蛋白质有强烈的水解作用，因此有可能破坏产氢过程中酶系，从而大大抑制发酵产氢的效能。
(3)、由研究证明FeSO4在一定浓度范围内对生物质发酵产氢过程中的糖利用率、CO2和氢气的产量都有良好的极显著促进作用。
(4)、在研究中发现Ni2+-Fe3+组合金属离子对产生的交互作用对生物质发酵产氢出现了值得深入探讨研究的效果。该研究证实了Ni2+-Fe3+具有形成有利于发酵产氢过程放氢的条件，使氢酶向着发生放氢反应的方向进行，从而提高了混合菌群发酵产氢的能力，也促进了微生物的代谢，增加了CO2的产生。
3、生物质发酵产氢中酸根阴离子的作用，得出以下结论(1)、以混合菌群的生物质发酵产氢，对产氢有促进作用的酸根阴离子组成为0.1g/L钼酸根[Mo7O24]6-、1g/L草酸根[C2O4]2-、5g/L 柠檬酸根[C6H5O7]3-、1.5g/L SO42-。
(2)、钼酸根[Mo7O24]6-—柠檬酸根[C6H5O7]3-组合的阴离子交互作用对生物发酵产氢的代谢有良好的促进作用，从而进一步提高了混合菌种之间的协同作用，提高了氢气产量和原料的利用与转化率。
4、使用传统设备实现了在15％的不同糖S(S＝木糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、马铃薯)为原料下的批量固定化微生物发酵产氢，以及以新鲜马铃薯水解液为原料的6～7级串联的固定化微生物连续发酵产氢，固定化微生物在发酵产氢生物反应器中投入前置级，其它串联各级中都不投入，产氢持续性、稳定性显著提高。
本发明以活性污泥来源的微生物混合菌种制作发酵产氢固定化微生物，提供了广泛的持续、高效、稳定的微生物种源种量来源，并适用于不同生物质原料发酵产氢，具有广阔前景；以细菌为主的发酵产氢，代谢速度快，效率高，供给稳定的原料是发挥微生物产氢潜能效率的前提，本发明以促进山区贫困农民增收的优势产业---马铃薯，作为连续发酵产氢原料，不但能够高效、稳定的连续发酵产氢，实现产业化生产，而且具有社会意义。除此之外，本发明制备成本低，氢气产量和产氢速率却明显提高。
图1为本发明制备方法工艺流程图。
图2为本发明马铃薯7级连续发酵装置的工艺流程图。
具体实施例方式
实施例1、葡萄糖为原料的混合菌种固定化微生物发酵产氢以葡萄糖为原料底物分别在1％、7.5％和15％三个浓度下，以1L的生物反应器装置进行发酵产氢，装液量体积为800mL，采用本发明混合菌种固定化微生物技术方法制成的固定化块100g，30℃下批量发酵产氢。结果见下表1，表1葡萄糖不同浓度下固定化发酵产氢
注Vmax指最大的产氢速率V平均指整个发酵过程氢气产生的平均速率YH2指氢气的产率在1％，7.5％和15％的葡萄糖浓度下，混合菌种固定化微生物发酵产氢，氢气的产率和产氢速率均较高，氢含量大于40％，最大氢含量为50.84％，仅在30℃下氢气产率就均大于1.11mol/mol葡萄糖，当浓度为7.5％时氢气产率高达1.34mol/mol葡萄糖；平均产氢速率最大为182.38mL/L.h。此结果远远大于D.James Brisseau等人利用Clostridiumsaccharoperbutylacetonicum菌株非固定化，在26℃得到的0.093～0.37mol/mol葡萄糖的产氢率和10.83mL/L.h产氢速率。此外，2003年Monmoto等利用不同的活性污泥非固定化发酵葡萄糖产氢，在50℃时产氢速率最大也仅为137mL/L.h，氢气得率2.1mol/mol葡萄糖；在60℃时氢气产率为1.4mol/mol葡萄糖，产氢速率为125mL/L.h；2004年清华大学的卢元等利用分离出的类腐败梭状芽孢杆菌M-21，非固定化菌种在37℃以葡萄糖发酵得到氢气产率为1.05mol/mol葡萄糖。与文献中的产氢条件相比，本发明研究采用的是普通温和条件的混合微生物，既非单一纯菌种，也不是高温发酵条件，因此，从技术可行性和应用前景都占有很大的优势。结果揭示了利用本发明技术工艺方法发酵产氢具有产氢速度快，在30℃下原料利用率和转化率就已达到较高水平的温和条件，以及8h内就有氢气产生的快速启动时间等良好现象特征。
实施例2、蔗糖为原料的混合菌种固定化微生物发酵产氢将蔗糖配制成15％的浓度，按实施例1中的方法启动发酵产氢。氢气最大含量51.46％，平均含量45.56％；最大产氢速率为324.20mL/L.h，平均产氢速率127.91mL/L.h；氢气产率为3.20mol/mol蔗糖。本发明以蔗糖为原料的发酵产氢与文献报道的不同技术比较见表2，可以看出，与非固定化或相关的固定化技术相比，以本发明的蔗糖发酵产氢，产氢最大速率是最快的、氢气产量也是最高，只有活性炭吸附承载的混合微生物(也称固定化，但不是真正的固定化)与本发明接近相当。
表2本发明技术方法与相关文献报道方法的结果比较
实施例3、乳糖为原料的混合菌种固定化微生物发酵产氢将乳糖配制成15％的浓度，按实施例1中的方法启动发酵产氢试验。结果表明氢气最高含量46.73％，平均含量36.89％；最大的产氢速率138.46mL/L.h，平均产氢速率为69.24mL/L.h；氢气产率为1.72mol/mol乳糖。2004年，Christophe Collet等用Clostridium thermolacticum(一种能高效利用乳糖发酵的菌株)在58℃连续发酵产氢，得到最大的产氢速率为63.0ml/L.h，氢气产量为1.5mol/mol乳糖。本实验所得最大产氢速率和氢气率分别比其提高了119.8％和14.7％。
实施例4、淀粉为原料的混合菌种固定化微生物发酵产氢称取15％的淀粉用量，用少量冷水浸温，加入沸水中调成糊状成乳白色半透明溶解状态，冷却加水稀释至所需浓度，按实施例1中的方法启动发酵产氢，并以每克淀粉加入100u的糖化酶和10u的α-淀粉酶，试验共进行了6天。。
实验结果表明，淀粉发酵产氢过程中，氢气最大含量为53.77％，平均氢气含量为48.85％；最大产氢速率822.68mL/L.h，平均产氢速率为173.30mL/L.h；氢气产率为207.8mL/g淀粉相当于1.67mol/mol葡萄糖(以1g淀粉相当1g葡萄糖计)，该结果比张同等2003年用活性污泥在55℃得到的氢气产率92mL/g淀粉高125.9％。
实施例5、马铃薯水解液为原料的混合菌种固定化微生物发酵产氢取适量马铃薯，测定原料TS，称取的鲜马铃薯，加水调节马铃薯TS为15％，打浆、酶水解，测定还原糖百分含量、启动批量发酵产氢。结果显示6h内混合菌种固定化微生物块带着气泡全部浮起，8小时产气速率就达到150mL/L.h，发酵产氢共进行了5天。其中氢气最高含量达61.74％，平均氢含量为50.20％；最大产氢速率392.24mL/L.h，平均产氢速率为118.59mL/L.h；马铃薯TS产氢潜力为177.9ml/g TS，马铃薯VS产氢潜力187.42ml/g VS，氢气产率为1.51mol/mol(以1g起始VS相当于1g葡萄糖计)。从马铃薯这种成分相对复杂的原料为底物进行发酵产氢，从氢气含量和氢气产率都高于实例4中的精淀粉结果，另外，从成本上看也具有极大优势。结果也可进一步说明本发明的混合菌种固定化微生物技术对不同生物质原料发酵产氢具有较广泛的适应特性。
实施例6、木糖为原料的混合菌种固定化微生物发酵产氢将木糖配制成15％的浓度，按实施例1中的方法启动发酵产氢。以木糖进行发酵产氢启动时间较长，24h以后混合菌种固定化微生物块带着气泡浮起开始产氢，这是因为混合菌种微生物在驯化时从未接触过木糖，所以增加了一定的适应的调适过程。氢气最大产生速率54.35mL/L.h，平均产氢速率为48.44mL/L.h；氢气产率为0.46mol/mol木糖，氢气最高含量达41.81％，平均氢含量为38.46％。此结果比通常非固定化混合菌种(即，无本发明中所用辅助剂)发酵产氢平均氢含量提高了50.34％。2003年左宜等采用预热处理以后的河底污泥对几种糖进行发酵产氢实验，木糖的累计产氢量和产氢速率也较低，分别为23.5mL/gTVS和2.0mL/gTVS.h。
实施例7、人为的混合物糖为原料以混合菌种固定化微生物发酵产氢将以上六碳糖(单糖葡萄糖)、五碳糖(单糖木糖)、双糖的蔗糖和乳糖、以及多糖淀粉为原料，等量称取混合浓度15％，淀粉的混入方法同实施例4中处理制作，按实施例1中的方法启动发酵产氢。此混合物发酵产氢，氢含量最高可达70.19％，平均氢含量为60.79％；最大的产氢速率和平均的产氢速率分别为631.73mL/L.h和121.34mL/L.h；氢气产率为2.01mol/mol混合糖(各糖的摩尔质量总和，淀粉仍以葡萄糖计)。结果表明，本发明的混合菌种固定化微生物不仅能够利用单一的糖为原料进行发酵产氢，而且在多种生物质混合物的复杂原料中更好发挥了其发酵产氢的高效作用特性，因为混合菌种之间的相互协同作用良好地促进了氢气的产生，氢含量比同等条件下葡萄糖发酵产氢的平均氢含量(45.5％)提高了33.6％。该项实施例证实和突出了本发明的创造性。
实施倒8、仅以PVA和膨润土制作混合菌种固定化微生物，马铃薯连续发酵产氢，工艺如下鲜马铃薯→打浆→酶水解→多级发酵产氢体系→产氢在该工艺中，马铃薯不作任何处理(不洗，也不去皮直接用)，加水打浆后，进行酶水解，投入7级连续产氢发酵反应器中，每克马铃薯可产气205ml，产氢气52.5ml。设计的多级产氢反应器，能有效提高原料的产氢效率，逐级能提高气体中氢的含量，并且使糖基本消化完全。结果见表3表3未加助剂混合菌种固定化微生物的连续发酵产氢的各级气体成分含量(％)
实施例9、马铃薯水解液为原料的混合菌种固定化微生物连续发酵产氢在仅以PVA和膨润土制作混合菌种固定化微生物的连续发酵的基础上，原料预处理和发酵操作工艺路线和条件不变，按配比添加助剂的混合菌种固定化微生物方法连续发酵马铃薯水解液产氢。结果表明启动时间从原来的14h大大缩短为6h。每克马铃薯产气量和产氢量分别为319.6ml和158.3ml，比原总产气量(205ml)提高了55.9％，产氢量(52.5ml)提高了201％，平均氢气含量由原来的25.6％提高到49.5％。结果为表4。
表4混合菌种固定化微生物的连续发酵产氢的各级气体成分含量(％)
从上表可以明显看出，各级氢气含量都不同于实施例8的变化程度，第五级氢气含量最高达86.74％，比原有最高(60.37％)显著提高了43.6％；第一级氢气含量提高了21.3％，第二级和第三级提高幅度不大；尽管第四级氢气含量由原来的55％下降到46.79％(下降了17％)，第六级氢气含量却由48.22％提高到了64.2％，增加了33.13％。因此在相同的工艺条件下，本发明的混合菌种固定化微生物用于马铃薯连续发酵产氢具有高效、持续稳定的效能。
权利要求
1.一种用于生物质发酵产氢的固定化微生物，其特征在于由以下成分组成水热溶制成的聚乙烯醇胶液、与该胶液等体积的悬浮液脱氢酶酶活力≥50U/mL的菌群种液，占二者总体积8～16％膨润土、10～20％CaCO3、0.1～0.2％的半胱氨酸或胱氨酸。
2.根据权利要求1所述的一种用于生物质发酵产氢的固定化微生物，其特征在于菌群种液为单一菌群种液，或经驯化后TS为15％～20％的活性污泥混合菌群种液。
3.根据权利要求1所述的一种用于生物质发酵产氢的固定化微生物，其特征在于在固定化微生物中具有以下配比之助剂之一或组合聚乙烯醇胶液中1～2％Na2S，菌群种液中M＝20mg/L Fe2+、1mg/L Ni2+、100mg/L Fe3+、10mg/L Mg2+、100mg/L K+、1mg/L Mn2+的硫酸盐阳离子，菌群种液中N＝0.1g/L钼酸根[Mo7O24]6-、1g/L草酸根[C2O4]2-、5g/L柠檬酸根[C6H5O7]3-、1.5g/L SO42-的铵盐阴离子。
4.根据权利要求1所述的一种用于生物质发酵产氢的固定化微生物，其特征在于固定化微生物中有Ni2+-Fe3+组合金属离子、钼酸根[Mo7O24]6--柠檬酸根[C6H5O7]3-组合阴离子、或其组合。
5.根据权利要求1所述的一种用于生物质发酵产氢的固定化微生物，其特征在于减少或抑制在混合菌群中的ZnSO4和Zn2+离子。
6.一种用于生物质发酵产氢的固定化微生物的制备方法，其特征在于(1)聚乙烯醇加水热溶制成胶液，(2)取与胶液等体积、且悬浮液脱氢酶酶活力≥50U/mL的菌群种液，按配比加入膨润土、CaCO3、半胱氨酸或胱氨酸，与胶液混合均匀，冰冷后切割为块状。
7.根据权利要求6所述的一种用于生物质发酵产氢的固定化微生物的制备方法，其特征在于采用菌群种液为单一菌群种液或经驯化后TS为15％～20％的活性污泥混合菌群种液。
8.根据权利要求6所述的一种用于生物质发酵产氢的固定化微生物的制备方法，其特征在于(1)按配比在聚乙烯醇胶液中添加Na2S，(2)在菌群种液中添加上述硫酸盐阳离子、铵盐阴离子，或以上两种离子的组合。
9.根据权利要求6所述的一种用于生物质发酵产氢的固定化微生物的制备方法，其特征在于菌群种液中加入Ni2+-Fe3+组合金属离子、钼酸根[Mo7O24]6--柠檬酸根[C6H5O7]3-组合阴离子、或其组合。
全文摘要
一种用于生物质发酵产氢的固定化微生物及制备方法，涉及生物质发酵产氢固相化的微生物和酶及其制备方法。本发明水热溶制成的聚乙烯醇(PVA)胶液为包埋胶体、与该胶液等体积的悬浮液脱氢酶酶活力≥50U/mL的菌群种液，包括单一菌群种液和TS为15％～20％的活性污泥来源的混合菌种菌群种液；并配以8～16％膨润土为吸附载体，以及助剂10～20％CaCO
文档编号C12N11/02GK1789414SQ20051001108
公开日2006年6月21日 申请日期2005年10月26日 优先权日2005年10月26日
发明者刘士清, 张无敌, 马欢 申请人:云南师范大学