利用来自酿酒酵母的高效表达载体制备重组蛋白质的方法

专利名称：利用来自酿酒酵母的高效表达载体制备重组蛋白质的方法
背景技术：
本发明涉及利用重组DNA技术由酵母制备重组蛋白质的方法。更具体地说，本发明涉及利用酵母表达载体制备重组蛋白质的方法，该载体含有由两种酵母可诱导启动子组成的杂合启动子和由酵母的杀伤毒素和成熟白介素1β(IL-1β)的氨基端组成的分泌信号。
另外，本发明涉及利用由酵母热激蛋白150的启动子和分泌信号构成的表达载体来制备hGCSF的方法。
另外，本发明涉及利用带有XbaI切割位点的酵母表达载体来制备重组蛋白质的方法，插入XbaI位点是为了方便插入重组蛋白基因。
通过使用本发明所述表达载体，可以制备人粒细胞集落刺激因子(hGCSF)和人生长激素(hGH)，并使之高效分泌。一项骨髓分化和繁殖实验揭示了嗜中性粒细胞或单核巨噬细胞能形成集落，后来人们知道活体内存在集落刺激因子(J.Cell.Comp.Physiol.66319(1965)；Aust.J.Exp.Biol.Med.Sci.44287(1966))。
被称为集落刺激因子(文中以下用CSF表示)的因子根据其生物活性特点可以分为如下几类(i)GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞CSF)使粒性白细胞和单核巨噬细胞的干细胞增殖和分化，最后形成集落；(ii)M-CSF(巨噬细胞CSF)使单核巨噬细胞形成集落；(iii)multi-CSF(多系CSF)刺激未分化的多能干细胞，最终形成多能细胞集落；(iv)G-CSF(粒细胞CSF)使粒性白细胞形成集落(J.B.C.2521998-2033(1977)，J.B.C.2524045-4052(1977)，生物化学杂志185341-343(1980)，J.B.C.2589017-9021(1983))。
GCSF是一种大约20kDa的糖蛋白，它来源于单核细胞、单核细胞巨噬细胞、上皮细胞、成纤维细胞等。并且人GCSF(文中以下用hGCSF表示)基因存在于第17染色体上。已知在体外将GCSF与IL-3结合使用能刺激嗜中性集落和胚细胞、巨噬细胞集落的产生，并获得一些成熟的髓样白血病细胞系。GCSF在体外可以增加嗜中性细胞和单核细胞的数量。
hGCSF具有以下临床应用首先，在治疗嗜中性细胞减少症并发晚期实体瘤和血癌患者时，hGCSF能够剂量依赖性地增加嗜中性细胞数量。
其次，hGCSF能迅速治愈某些患者的嗜中性细胞减少症，这些患者的嗜中性细胞减少症是对恶性淋巴肿瘤、肺癌、睾丸癌、尿道上皮瘤和急性白血病等进行化疗导致的。
第三，在给急性非淋巴细胞性白血病和慢性骨髓白血病患者做骨髓移植时，用hGCSF来增加嗜中性细胞数量。
第四，hGCSF能迅速治愈某些患者的嗜中性细胞减少症，这些患者的嗜中性细胞减少症是骨髓发育不良综合症造成的。
第五，hGCSF能迅速治愈某些患者的嗜中性细胞减少症，这些患者的嗜中性细胞减少症是再生障碍性贫血造成的。
第六，hGCSF可用于治疗遗传性和原发性嗜中性细胞减少症。
第七，hGCSF能抑制或减少抗肿瘤化疗导致的粘膜炎和发热嗜中性细胞减少症的发生率(药物年鉴(Drug Evaluations Annual)1993，美国药学会(American Medical Associations)p2232-2333)。
人生长激素(文中以下用hGH表示)是一种由191个氨基酸组成的非糖苷化蛋白质，它是由垂体前叶分泌的。hGH含有两个分子内二硫键，其分子量为22000道尔顿。它首先被合成为其前体，在加工后从细胞中分泌出来。
人在成年前产生大量hGH，并且一生中都有产生。
hGH是正常生长和发育所必需的，但是hGH产生水平过低会导致几种类型的侏儒症，而过度产生hGH又会伴生肢端肥大症或巨人症。
hGH表现出多种生物活性，并对多种组织直接或间接产生影响。它能影响骨骼的长度生长率和泌乳，并显示出致糖尿病的类胰岛素活性。另外，它能促进蛋白质合成，并影响脂类和碳水化合物的代谢。
以下是hGH的临床应用我们都知道，对于hGH缺乏导致的侏儒症，如果在童年服用hGH，可以使异常生长复原(Raben，M.S.，J.Clin.Endocr.18901-904(1958))。还知道hGH可以用来治疗肥胖症，并能有效地治疗多种病痛如骨折、皮肤烧伤、出血性溃疡等(Proc.of NIAMDD Symp.Publ.No.74-612(Raiti，S.编)(Baltimore，Maryland，1973))。
通过对基因进行cDNA克隆知道了hGH DNA的碱基序列，并且已有报导hGH DNA在大肠杆菌中表达了(Martial等，科学205602-605(1979))。
有许多基因工程方法试图使重组蛋白质过表达。
首先，已经建立了一种在克隆目的基因后在大肠杆菌中表达蛋白质的方法(科学23261-64(1986))。但是在这个用大肠杆菌作为宿主的方法中，存在如下所述的一些缺点。
在人体中，蛋白质先被合成为其前体，然后通过蛋白质水解加工成成熟形式。
但是在大肠杆菌中表达蛋白质时，所合成蛋白质的N-端甲硫氨酸不能象在人体内那样被氨肽酶有效地去除，因此在大肠杆菌的细胞质中有和没有甲硫氨酸的蛋白质同时存在。这样就很难将没有甲硫氨酸的蛋白质与有甲硫氨酸的蛋白质分开。
在许多情况中，蛋白质被表达为失活或不溶的形式，然后应当通过复性(重新折叠)过程将其转化为有生物活性的蛋白质，这一过程有时会显著地降低蛋白质的回收量。
纯化过程中还存在细菌内毒素造成的污染问题。
另外，在大肠杆菌中不可能进行蛋白质的翻译后修饰(例如hGCSF的糖苷化)。
其次，已经在动物细胞，比如CHU-2(人产GCSF的肿瘤细胞系)或中国仓鼠卵巢癌细胞中表达了克隆的目的基因。
但是用动物细胞做为宿主的方法也有一些缺点，比如需使用昂贵的血清培养基的培养条件很复杂，并且由于一般从很大体积的培养基中只能纯化到少量重组蛋白质，回收产量通常很低(EMBO杂志5871-876(1980)；(KR91-5624))。
已经建立的用酵母作为宿主的表达系统是以上问题的一种合理解决方案。据Loison和其他人报道，用这种方法可以从重组酵母中获得大量目的多肽或蛋白质(生物/技术4433-437(1986)；Rose和Harrison编，酵母，第3卷，349-420页，Burrow，“面包师的酵母”，AcademicPress，London(1970))。与其他采用动物细胞或大肠杆菌作为宿主的表达系统相比，重组酵母表达系统有明显的优点。
本发明人研究了使用酵母来制备hGCSF的方法。US FDA宣称酵母不是人体的致病菌，而且酵母中的多数基因表达调控原理已经被公开(Strathern等，酵母属酵母的分子生物学，代谢和基因表达，冷泉港实验室，纽约(1982))。
用酵母作为宿主细胞有这样一些优点，即通常认为酵母是对人体安全的生物，有可能从高细胞密度培养物中产生大量hGCSF，还有纯化过程简化了，这是因为可溶性蛋白质在信号肽的引导下可以从细胞中分泌出来。
最近报道了在酵母中表达某些异源蛋白质如乙型肝炎病毒、干扰素、牛凝乳酶、表皮生长因子的方法(Valensuela等，自然298347-350(1982)；Hitzeman等，NAR 112745-2763(1983)；McAleer等，自然307178-180(1984)；Tuite等，EMBO杂志1603-608(1982)；Mellor等，基因241-14(1983)；Urdea等，PNAS 807461-7465(1983))。
但是一般来说异源蛋白质在重组酵母中的表达水平与酵母的同源蛋白质相比非常低，因此人们做过大量工作来建立高效表达载体以便提高异源蛋白质在酵母中的表达水平(Chen等，NAR 128951-8970(1984))。
例如，EP84303833公开了一种通过使用带有外来目的基因和酵母GAL1启动子的克隆载体，从酵母中制备半乳糖激酶-牛凝乳酶原融合蛋白质的方法。还可以在酵母GAL4基因被插入含有外源基因和GAL1启动子的表达载体中的情况下，通过半乳糖转录水平调控途径使GAL4蛋白质的表达量提高，从而可以提高异源蛋白质的合成(Laughon等，PNAS 796827-831(1982))。
EP84302723公开了一种通过使用交配因子α的信号序列和启动子在酵母中表达人干扰素、人血清白蛋白、牛干扰素α-1、α-2、组织纤溶酶原激活剂、凝乳酶和人胰岛素样生长因子的方法。发明概述本发明的目的是提供一种通过使用重组DNA技术从酵母中制备重组蛋白质的方法。更准确地说，本发明提供了一种利用酵母表达载体来制备重组蛋白质的方法，该载体含有由两种酵母可诱导启动子组成的杂合启动子和由酵母杀伤毒素和成熟白介素1β(IL-1β)的氨基端组成的分泌信号。
本发明的目的是提供一种通过使用由酵母热激蛋白150的启动子和分泌信号构成的表达载体来制备hGCSF的方法。
本发明的目的是提供一种通过使用带有XbaI切割位点的酵母表达载体来制备重组蛋白质的方法，在所述载体中插入XbaI位点是为了方便插入重组蛋白基因。图面简述在附图中

图1显示YEp2-K的制备过程。
图2显示YEp2KIL20GC的制备过程。
图3显示pIL20GC的制备过程。
图4显示YEpHSPGC的制备过程。
图5显示一个氨基酸序列，该氨基酸序列由杀伤毒素前导序列、IL-1β的N-端24个残基、hGCSF以及信号肽酶和KEX2肽酶的切割位点组成。
图6显示在酵母中表达的hGCSF的SDS-PAGE分析结果。
图7显示利用酵母表达载体YEpHSPGC在酵母中表达的hGCSF的Western印迹结果图8是显示细胞、乙醇和hGCSF浓度以及质粒稳定性随时间变化的曲线图。
图9显示在酵母中表达的hGCSF的SDS-PAGE分析结果。
图10是显示细胞、乙醇和hGH浓度以及质粒稳定性随时间变化的曲线图。
图11显示在酵母中表达的hGH的SDS-PAGE分析结果。
图12显示一个氨基酸序列，该氨基酸序列由杀伤毒素前导序列、IL-1β的N-端24个残基、hGH以及信号肽酶和KEX2肽酶的切割位点组成。
图13是pIL20XGH的图谱。
图14显示酵母培养液中的hGCSF的纯化过程。
图15显示经Sephacryl S-200柱层析纯化hGCSF的过程。
图16显示hGCSF纯化过程的最后步骤。发明详述本发明人关注的是这样一个事实，即为了从酵母中高水平生产重组hGCSF，应当提高其分泌效率以及表达水平。
为了分泌出加工过的hGCSF，曾将多种分泌信号与hGCSF的氨基端融合在一起，但分泌并不成功。
同时曾有人报道利用分泌信号从酵母中高效地分泌出了白介素1β(EMBO杂志6229-234(1987))。本发明人关注的是利用IL-1β氨基端的氨基酸来从酵母细胞中分泌出加工过的hGCSF的可能性。本发明人最终发现在hGCSF基因的前面放置一个由杀伤毒素分泌信号和IL-1β的24个氨基酸组成的融合肽时，能成功地表达并从细胞中分泌出hGCSF。这时，在IL-1β N-端24个残基和hGCSF之间插入二碱基的KEX2切割位点，从而在分泌途径中通过KEX2酶(内肽酶)的作用释放出成熟的hGCSF。
上面描述的表达载体具有杀伤毒素分泌信号-IL-1β的24个氨基酸残基-KEX2切割位点-成熟hGCSF这一排列方式。利用上述表达载体表达的蛋白质通过以下步骤分泌在合成好的蛋白质被转运到高尔基体的过程中，信号肽被信号肽酶切割，KEX2肽酶切割IL-1β区，最终分泌出具有正确氨基端序列的成熟hGCSF。
以下详细描述本发明所用的hGCSF表达载体。
hGCSF表达载体包含代替酵母表达载体YEpsecl-hI1(C.Baldari等，EMBO杂志6229-234(1987))中的CYC-1启动子的交配因子-α1启动子、由杀伤毒素前导序列(该序列按酵母的密码子使用习惯进行了优化)和IL-1β N-端24个残基组成的杂合分泌信号、hGCSF基因和GAL4(它是GAL基因的激活子)。用该表达载体转化酿酒酵母，然后在缺乏尿嘧啶的基本培养基中挑选出转化子作为产hGCSF的菌株。重组基因在该挑出的转化子的高细胞密度培养物中表达，结果产生大量胞外hGCSF，并且发酵罐中细胞生长和产生hGCSF的培养条件得到了系统性优化。
本发明人还构建了一个表达载体，它含有热激蛋白的启动子和信号前导肽；借助于此载体，重组hGCSF的表达受到温度变换的调控。与其他可诱导的酵母启动子(比如受半乳糖诱导的GAL启动子、磷饥饿诱导的Pho5启动子、葡萄糖诱导的ADHII启动子)不同的是，热激蛋白(HSP)的启动子只通过温度调节(37-42℃)来调控转录以及随后的蛋白质合成。并且HSP是借助前导序列从细胞中分泌出来的(PNAS，893671-3675)。本发明人已建立了一种利用由HSP150启动子和HSP前导序列构建的表达载体来制备hGCSF的方法。
另外，为了方便将其他异源基因插入上述带有交配因子α启动子的表达载体中，发明人在该载体的IL-1β氨基酸序列和KEX2切割位点之间插入了XbaI位点。
上述表达载体可以用于生产其他重组蛋白质。特别是在本发明中，利用XbaI-BamHI片段作为克隆位点将hGH的结构基因插入上述表达载体，从所选出的转化子成功地表达出hGH。同样，在上述选出的转化子的高细胞密度培养物中，成功地合成了hGH，并大量分泌到发酵罐中的胞外培养液中。
此处应重点提及，尽管在本发明中仅给出生产hGCSF和hGH的方法，上述表达载体可以用于生产其他重组蛋白质。
在上述高细胞密度发酵中hGH的产量超过1g/L，与过去报道的其他来源于酵母的重组蛋白质的发酵产量相比，这是一个相对非常高的水平。因此，通过使用将含有杀伤毒素前导序列-IL-1β氨基端24个残基-hGH的序列作为杂合信号肽的表达载体，可以从酵母中表达并高效地分泌出其他重组蛋白质。
通过实施例详细描述本发明。
实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明权利要求的范围。I.制备YEp2-K表达载体YEpsecl-hI1由GAL1，10基因的上游激活序列、CYC-1启动子、乳酸克鲁维酵母杀伤毒素前导序列[M.J.R.Stark等，NAR126011-6031(1984)]和白介素-1β基因组成，并且白介素-1β由诱导剂(半乳糖)诱导表达。
为了使载体YEpsecl-hI1的效率更高，将杀伤毒素前导序列进行了优化，并用更有效的MFα1启动子代替了CYC-1启动子。
为了终止mRNA转录，在hGCSF的3′端添加了GAPDH的转录终止子，并克隆了Gal4基因(它是Gal基因的激活子)，而且将该基因添加到了表达载体中。
1)优化杀伤毒素前导序列的密码子制备YEpsec-ok实施例1合成杀伤毒素前导序列的寡核苷酸为了用编码在酿酒酵母中过表达的蛋白质的密码子来代替酵母表达载体YEpsecl-hI1中的杀伤毒素前导序列的密码子，用合成仪(ABI，392 DNA/RNA合成仪)合成了以下寡核苷酸(J.Bennetzen，B.Hall生物化学杂志2573026-3031)。
C TAT AAA ACA ATG AAC ATC TTC TAC ATC TTC TTGTC GAG ATA TTT TGT TAC TTG TAG AAG ATG TAG AAG AACSacITTC TTG TTG TCT TTC GTT CAA GGT ACAAG AAC AAC AGA AAG CAA GTT CKpnI遵循以下反应以便将合成的寡核苷酸插入一个位点，使得在该位点要切割出YEpsecl-hI1中的杀伤毒素前导序列。用T4多核苷酸激酶(NEB)在30μl含有ATP的反应溶液(70mM Tris-HCl(pH7.6)、10mMMgCl2、5mM DTT(二硫苏糖醇))中将寡核苷酸的每个5′端于37℃磷酸化1小时。将两份反应溶液混合，放置20分钟。在慢慢冷却到30℃的过程中，寡核苷酸被退火。实施例2消化YEpsecl-hI1用限制酶(SacI、KpnI；NEB)在40μl反应溶液(20mM Tris-醋酸、10mM醋酸镁、50mM醋酸钾)中将1μg YEpsecl-hI1于37℃消化1小时，然后在1％琼脂糖凝胶板中经电泳分离。分离后，切下8.4kb的带利用Jetsorb(GENOMED，cat#110300)，将DNA从切下来的DNA带中洗脱下来，并进行纯化。实施例3 DNA的连接和转化用100单位T4DNA连接酶在30μl反应溶液中(该溶液由50mMTris-HCl(pH7.6)、10mM MgCl2、10mM DTT和1mM ATP组成)将实施例1中退火的杀伤毒素前导序列和实施例2中用限制酶(SacI和KpnI)消化好的YEpsecl-hI1于16℃连接过夜。依照分子克隆实验指南(Sambrook，Fritch Mantiatis第2版，CSH)，通过CaCl2法用连接反应液转化大肠杆菌XL-1 Blue(supE44 hsdR17 recAl endAlgyrA46 thi relAl Iac-F’(proAB+lacIqlacZΔM15 Tn(tetr)))。转化后，将被转化的大肠杆菌铺在LB-Amp琼脂平版培养基(10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物、10g/l NaCl、100μg/ml氨苄青霉素)上，并于37℃温育20小时。将氨苄青霉素抗性转化子(AmpR)的菌落在1.5ml液体LB-Amp培养基中培养后，通过碱裂解法提取质粒，并用RPM旋转滤器(BIO101)将其纯化。挑选出不被限制酶SmaI消化的质粒(因为通过密码子优化步骤，杀伤毒素前导序列中的限制酶SmaI位点消失了)，并将所得质粒命名为YEpsec-ok。实施例4单链DNA为了鉴定出为优化密码子目的而取代的碱基序列，测定YEpsec-ok的序列。如下制备测序所需的单链DNA。
用限制酶BamH1消化实施例3中所得YEpsec-ok，再用SacI消化，在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，切下带有0.66kb DNA片段的凝胶。随后用GENE CLEAN试剂盒II将DNA从琼脂糖凝胶上洗脱下来。取1μg载体M13mp19用限制酶BamH1和SacI消化，然后用GENECLEAN试剂盒II将其纯化。在连接体系中用T4DNA连接酶将0.66kb的DNA片段和M13mpl9于16℃连接过夜。用反应溶液转化感受态大肠杆菌XL-1Blue后，依照分子克隆实验指南(同上)分离单链DNA。更具体地说，将200μl过夜培养的XL-1Blue溶液、40μl X-Gal(20mg/ml，在二甲酰胺中)和4μl IPTG(200mg/ml)与琼脂混合，将混合液铺在LB琼脂平板培养基上。将转化的大肠杆菌于37℃温育后，在琼脂平板上挑取一个白色菌落。用挑出的菌落与20ml LB于37℃感染200μl XL-1Blue，250rpm培养5小时。这之后，将培养液离心，向上清液中加入1/5体积的PEG(溶于2.5M NaCl的20％PEG8000)，置于冰上15分钟。离心后，弃上清。将沉淀下来的M13病毒沉淀物重悬于200μl TE缓冲液(10mM Tris-HCl(pH7.6)，1mM EDTA)，然后用酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)提取蛋白质。离心后，向上清液中加入2体积的乙醇来沉淀DNA，并用70％乙醇洗涤DNA沉淀。将沉淀真空干燥后，再溶于20μl蒸馏水中。实施例5序列分析通过双脱氧链终止DNA测序法分析实施例4中制备的单链质粒的碱基序列。用ABI合成仪合成测序所用的引物。
用于分析碱基序列的寡DNA5′GTT TTC CCA GTC ACT AC3′碱基序列分析的结果表明密码子的碱基已被取代成优化密码子。
GAG CTC TAT AAA ACA ATG AAC ATC TTC TAC ATC TTCSacITTG TTC TTG TTG TCT TTC GTT CAA GGT ACC CGG GGAKpnITCA CTG AAC2)制备GAPDH(甘油醛3-磷酸脱氢酶)的转录终止子(YEpsec-term)。实施例6合成寡核苷酸为了终止由GAL1，10 UAS(上游激活序列)-MFα1启动子引导的转录，合成如下GAPDH的转录终止子(生物学化学杂志245839-845(1979))。GA TCC CGG GTT TTT TAT AGC TTT ATG ACT TAG TTT CAAG GCC CAA AAA ATA TCG AAA TAC TGA ATC AAA GTTBamHITTA TAT ACT ATT TTA ATG ACA TTT TCA GGAAT ATA TGA TAA AAT TAC TGT AAA AGT CCA GCTSalI合成后，经OPC(寡核苷酸纯化柱)纯化寡核苷酸。并依照实施例1将其磷酸化和退火。实施例7消化YEpsecl-hI1为了将GAPDH的转录终止子插入到被表达基因的下游，用限制酶BamH1和SacI于37℃将YEpsecl-hI1消化1小时。将消化的质粒在1％琼脂糖凝胶板中电泳，切下9kb的带，并用Jetsorb将DNA从切下的带中洗脱下来。实施例8 DNA的连接和转化于16℃用T4DNA连接酶将用限制酶BamH1和SacI消化的YEpsecl-hI1与经实施例6中磷酸化并退火的GAPDH的转录终止子寡核苷酸连接在一起。
将氨苄青霉素抗性的菌落(该菌落是依照CaCl2法用反应液转化大肠杆菌XL-1 Blue获得的)培养在1.5ml LB-amp培养基中。培养后，经RPM滤器纯化质粒。
用限制酶BamH1、SacI消化质粒，并在8％PAGE(聚丙烯酰胺凝胶)中进行电泳。将带有70bp DNA片段的质粒命名为YEpsec-term。3)制备YEpsec-ok实施例9消化YEpsec-ok用限制酶KpnI、SalI将1μg YEpsec-ok于37℃消化1小时，并在1％琼脂糖凝胶板中进行分离。切下大约8.3kb的带并用Jetsorb纯化DNA。实施例10消化YEpsec-term用限制酶KpnI、SalI将1μg YEpsec-term于37℃消化1小时。之后，在1％琼脂糖凝胶板中分离质粒，切下0.6kb的带并洗脱DNA。实施例11DNA的连接和转化将实施例10中洗脱出的0.6kb片段和实施例9中洗脱出的8.3kb载体溶于30μl连接溶液中，并用T4DNA连接酶将它们连接在一起。用反应溶液经CaCl2法转化大肠杆菌XL-1 Blue。将氨苄青霉素抗性的菌落培养在1.5ml LB-amp培养基中，用RPM旋转滤器分离出质粒。用限制酶消化质粒，将带有YEpsec-ok的转录终止子的质粒命名为YEpsec-kt。4)用MFα1启动子取代CYC-1启动子(制备Yepαkt)原始的YEpsecl-hI1由包含CYC-1启动子和调控区的启动子复合体、GAL1-10 UAS(Gal4蛋白质(半乳糖代谢相关基因的激活子)结合在它上面)组成，但在本发明中，CYC-1启动子被MFα1启动子取代，后者有更有效的转录起始作用(Kurjan等，细胞30933-943(1982))。实施例12MFα1启动子的PCR(聚合酶链反应)为了便于进行克隆，用带有合适限制酶切位点的引物经PCR获得MFα1启动子。
在每个引物的5′端有限制酶SalI和SacI切割位点。
用于扩增MFα1转录起始序列的引物为5′GTG CAC TCG AGC CAA AAA GCA ACA ACA GGT TTT GG3′SalI5′TTA ATG AGC TCT ATT GTG TAT GAA ATT GAT AGT TTG3′SacIPCR中所用模板是含有MFα1启动子的p70αT载体。向50pmol每种引物和100μl含有200μM dNTP的反应溶液(10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、20mM Tris-HCl(pH8.8)、2mM MgSO4、0.1％triton X-100)中加入2单位的Vent DNA聚合酶，然后利用PCR ROBOT(Fine Co.)使反应按照如下温度程序循环35次预处理94℃，300秒；退火53℃，40秒；延伸72℃，40秒；变性94℃，40秒；后反应53℃，300秒将扩增的MFα1启动子在1.5％琼脂糖凝胶板中电泳，鉴定出150bpDNA带，并将之从凝胶上洗脱下来。用限制酶SalI和SacI消化洗脱下来的DNA。实施例13消化YEpsec-kt用限制酶XhoI和SacI将1μg YEpsec-kt于37℃消化1小时。消化好的质粒在1％琼脂糖凝胶板上进行分离，将大约8.8kb DNA带切下，并用Jetsorb洗脱DNA。实施例14连接和转化用T4DNA连接酶在30μl连接溶液中将实施例12中经SalI和SacI消化制备的MFα1启动子与实施例13中用XhoI和SacI消化的8.3kb载体连接在一起。用反应溶液转化大肠杆菌XL-1 Blue，将氨苄青霉素抗性的转化菌落培养在1.5ml LB-amp培养基中，并纯化质粒。当XhoI位点和SacI位点正确连接时，质粒不能被XhoI和SacI切割，因此挑选出不能被XhoI和SacI切割的质粒，并将之命名为YEpαkt。5)Gal4基因(制备YEpαktGAL4)当半乳糖作为碳源时，GAL4蛋白激活半乳糖代谢相关基因(Gal7、10、1，Gal2，Mel1)在酵母中的表达(Johnstone等，美国科学院学报796971-6975(1982))。这一诱导过程从每个基因的转录水平开始，并以GAL4蛋白作为转录激活子。YEpsecl-hI1的Gal1(激酶)-Gal10(差向异构酶)位点含有UAS(它是GAL4的结合位点，Cirton等，细菌杂志158269-278(1984))。YEpsecl-hI1是酵母2μ环形高拷贝数质粒。由于GAL4蛋白是由染色体DNA编码的，当用半乳糖进行诱导时，可以结合在GAL1-10 UAS上的GAL4蛋白浓度很低。因此很难进行高效表达。为了维持足够量的GAL4蛋白，向YEpsecl-hI1中插入GAL4基因。实施例15GAL4基因的PCR合成了以下引物以便进行GAL4基因的PCR5′AGTTTGAATTCCAACAGCAAGCAGGTGTGCAAGACA3′EcoRI5′TCGAAGAATTCTCACCTTCGTGAACTTCAGAGGCGA3′EcoRI模板是酿酒酵母2805的基因组DNA。
该PCR使用了如下组分50pmol的各引物、100μl含有200μMdNTP的反应溶液(10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、20mM Tris-HCl(pH8.8)、6mM MgSO4、0.1％triton X-100)，所用聚合酶为2单位的Vent DNA聚合酶，然后利用PCR ROBOT(Fine Co.)使反应按照如下温度程序循环35次预处理94℃，300秒；退火53℃，50秒；延伸72℃，260秒；变性94℃，50秒；后反应53℃，300秒将扩增的GAL4基因在1％琼脂糖凝胶板中电泳，鉴定出大约3.5bp的DNA带，将DNA从凝胶上洗脱下来并用限制酶EcoRI消化。实施例16制备pUCGAL4将pUC18用限制酶EcoRI于37℃消化1小时后，用CIP(小牛肠磷酸酶，NEB)将消化过的质粒去磷酸化。利用Jetsorb将用EcoRI消化的质粒纯化。用T4DNA连接酶在30μl连接溶液中将GAL4基因和用EcoRI消化过的质粒于16℃过夜连接。依照CaCl2法转化大肠杆菌XL-1 Blue，培养菌落，并经RPM旋转滤器纯化质粒。挑选出当用EcoRI消化时带有3.5kb DNA的质粒，并将之命名为pUCGAL4。实施例17YEpαktGAL4为了将GAL4基因插入YEpαkt，进行了如下操作。
用限制酶EcoRI消化pUCGAL4，并在1％琼脂糖凝胶板中电泳，将大约3.5kb的DNA带切下，从胶上洗脱下来并纯化。用限制酶EcoRI将1μg YEpαkt于37℃消化1小时，并用CIP(小牛肠磷酸酶，NEB)将质粒去磷酸化，利用Jetsorb将消化过的载体纯化。用T4DNA连接酶在连接溶液中将GAL4基因和用EcoRI消化的YEpαkt于16℃连接过夜。依照CaCl2法转化大肠杆菌XL-1 Blue，培养菌落，然后纯化质粒。用EcoRI切割质粒后，挑选出3.5kb DNA带，并命名为YEpαktGAL4。6)制备Yep2-k实施例18制备Yep2-k在YEpαktGAL4上有限制酶KpnI的两个切割位点。一个在杀伤毒素前导序列的末端，另一个在选择标记leu2-d基因上。在本发明中，由于使用URA3作为酵母的选择标记，位于leu2-d基因上的KpnI切割位点被破坏掉了。将YEpαktGAL4用KpnI部分消化后，用T4DNA连接酶在50μl反应溶液(10mM Tris-HCl(pH8.0)、5mM MgCl2、5mMDTT、100μM dDNP、50μg/ml BSA)中将消化位点于室温填平1小时，这样KpnI位点变为平末端。利用T4DNA连接酶和ATP将平末端KpnI位点于16℃连接过夜。依照CaCl2法转化大肠杆菌XL-1 Blue，将菌落培养在1.5ml LB-Amp培养基中，然后纯化质粒。用限制酶消化质粒，将没有leu2-d基因上的KpnI位点的质粒命名为YEp2-k。
II.克隆GCSF(制备YEp3KGC)实施例19制备hGCSF合成如下寡核苷酸以便进行GCSF的PCR5′AGG TAG GGT ACC ACC CCC CTG GGC CCT GCC 3′KpnI5′ATG GGA GGA TCC GGG CTT GGC TCA GGG CTG GGC 3′BamHIhGCSF的PCR中所用模板是巨噬细胞cDNA文库(Clontech)。向50pmol每种引物和100μl含有200μM dNTP的反应溶液(10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、20mM Tris-HCl(pH8.8)、2mM MgSO4、0.1％TritonX-100)中加入2单位Vent DNA聚合酶，然后利用PCR ROBOT(FineCo.)使反应按照如下温度程序循环35次预处理94℃，300秒；退火53℃，30秒；
变性94℃，30秒；后反应53℃，300秒将扩增的hGCSF基因在1％琼脂糖凝胶板中电泳，鉴定出0.5kbDNA带，进行纯化并用限制酶KpnI和BamHI消化。实施例20消化YEpsec-kt用KpnI和BamHI将1μg的YEp2-k消化后，将消化过的DNA在1％琼脂糖凝胶板上进行电泳，弃去IL-1β片段，将载体的其他片段洗脱下来。实施例21DNA的连接和转化用T4DNA连接酶在30μl连接溶液中将GCSF基因与用KpnI和BamHI消化的YEp2-k连接在一起。用反应溶液转化大肠杆菌XL-1Blue，培养菌落，然后纯化质粒。用限制酶KpnI和BamHI消化质粒时，插入了GSCF片段的质粒被命名为YEp2KGC。
III.制备YEpGalMF为了在通用克隆载体YEp352(J.E.Hill等，酵母2163-167(1986))中表达GCSF，进行了如下操作。从YpGX265Gal4获得表达GCSF所需的片段，构建表达载体YEpGalMF并用于表达GCSF。实施例22GAL4-GAL1，10 UAS-MFα1的PCR用与GAL4和MFα1启动子互补的引物由YpGX265GAL4(美国专利5013652)经PCR获得GAL4-GAL1，10中的UAS-MFα1。
与MFα1启动子互补的引物5′TTAATGAGCTCTATTGTGTATGAAATTGATAGTTTG3′SacI
与GAL4互补的引物5′AGTTTGAATTCCAACAGCAAGCAGGTGTGCAAGACA3′EcoRI向500pmol每种引物和100μl含有200μM dNTP的反应溶液中加入2单位的Vent DNA聚合酶，然后利用PCR ROBOT(Fine Co.)使反应按照如下温度程序循环35次预处理94℃，300秒；退火53℃，30秒；延伸72℃，30秒；变性94℃，30秒；后反应53℃，300秒将扩增的GAL4-GAL1，10 UAS-MFα1基因在1％琼脂糖凝胶板中电泳，鉴定出大约4kb的DNA带，将之从凝胶中洗脱下来并用限制酶SacI和EcoRI消化。实施例23连接YEp352用SacI和EcoRI将1μg的YEp352于37℃消化1小时，在1％琼脂糖凝胶板中将质粒电泳，将大约kb的DNA带切下，并利用Jetsorb将其洗脱。
预处理94℃，300秒；退火50℃，30秒；延伸72℃，30秒；变性94℃，30秒；后反应53℃，300秒实施例24DNA的连接和转化用T4DNA连接酶在30μl连接溶液中将来自YpGX265GAL4的GAL4-GAL1，10 UAS-MFα1与用SacI和EcoRI消化的YEp352连接在一起。用反应溶液转化大肠杆菌XL-1 Blue，培养菌落然后纯化质粒。用限制酶SacI、EcoRI消化质粒时，挑选出3.5kb的DNA带并命名为YEpGalMF。
IV.制备YEp2kIL20GC实施例25制备IL20GCSF1)合成如下引物以便用于杀伤毒素前导序列、IL-1β氨基端24AA和内肽酶KEX2切割位点的PCR5′ACA ATA GAG CTC TAT AAA ACA 3′SacI5′GGC AGG GCC CAG GGG GGT TCT CTT GTC CAA AGA AACAGC TTT CAG TTC ATA TGG 3′以YEp2-k作为模板，向50pmol每种引物和100μl含有200μMdNTP的PCR反应溶液中加入2单位Vent DNA聚合酶，然后使反应按如下程序循环35次预处理94℃，300秒；退火50℃，30秒；延伸72℃，30秒；变性94℃，30秒；后反应53℃，300秒将扩增的杀伤毒素前导序列、IL-1β氨基端24AA在1.5％琼脂糖凝胶板中电泳，将大约80bp的DNA带从凝胶上切下来，洗脱，并进行纯化。PCR所扩增的DNA序列如下ACA ATA GAG CTC TAT AAA ACA MET ACC TTC TAC ATCTGT TAT CTC GAG ATA TTT TGT TAC TGG TAG AAG ATG TAGSacITTC TTG TTC TTG TTG TCT TTC GTT CAA GGT TTG TCA CTGAAG AAC AAG AAC AAC AGA AAG CAA GTT CCA AAC AGT GACAAC TGC ACG CTC CGG GAC TCA CAG CCA AAA AGC TTG GTGTTG ACG TGC GAG GCC CTG AGT GTC GGT TTT TCG AAC CACATG TCT GGT CCA TAT GGA CTG AAA GCT GGT GTT TCT TTGTAC AGA CCA GGT ATA CCT GAC TTT CGA CCA CAA AGA AACGAC AAG AGA ACC CCC CTG GGC CCT GCC 3′CTG TTC TCT TGG GGG GAC CCG CGA CGG2)利用以上1)中描述的PCR产物和与GCSF羧基端互补的寡核苷酸经PCR来扩增GCSF。合成以下与GCSF的羧基端互补的寡核苷酸5′ATG GGA GGA TCC GGG CTT GGC TCA GGG CTG GGC 3′BamHI将由实施例21获得的YEp2KGC作为模板。向50pmol每种引物、编码杀伤毒素前导序列和IL-1β24A的DNA片段以及100μl含有20μM dNTP的反应溶液中加入2单位Vent DNA聚合酶，然后使反应按照如下温度程序循环35次预处理94℃，300秒；退火50℃，30秒；延伸72℃，30秒；
变性94℃，30秒；后反应53℃，300秒将扩增过的IL20GCSF在1％琼脂糖凝胶板中电泳，从凝胶上切下大约0.66kb的DNA带，洗脱，并进行纯化。用SacI、BamHI消化IL20GCSF，并纯化。实施例26消化YEp2-k用SacI和BamHI将1μg YEp2-k于37℃消化1小时。将消化过的质粒在1％琼脂糖凝胶中电泳，将大约12kb的DNA带切下来，并用Jetsorb洗脱DNA。实施例27DNA的连接和转化用T4DNA连接酶在30μl连接溶液中将IL20GCSF与实施例26中用SaeI和BamHI消化过的YEp2-k连接在一起。
用反应溶液转化大肠杆菌XL-1 Blue，培养菌落并将质粒纯化。用限制酶消化质粒，只挑选含有IL20GCSF的质粒并将之命名为YEp2kIL20GC。
V.制备pIL20GC实施例28消化YEp2kIL20GC为了从YEp2kIL20GC中获得IL20GCSF-GAPDH转录终止子，用KpnI和SalI将该质粒于37℃消化1小时。通过与上述相同的方法分离出消化好的质粒，并将大约0.66kb大小的DNA纯化。实施例29消化YEpGalMF用KpnI和SalI将1μg YEpGalMF于37℃消化1小时。通过与上面相同的方法分离和纯化已被消化过的质粒。实施例30DNA的连接和转化用T4DNA连接酶在30μl连接溶液中将用KpnI和SalI消化过的IL20GCSF-GAPDH转录终止子与YEpGalMF连接在一起。用反应溶液转化大肠杆菌。培养菌落并纯化质粒。用限制酶消化质粒，挑选出插入了IL20GCSF-GAPDH转录终止子的质粒并将之命名为pIL20GC。
VI.制备YEpHSPGCHSP150(热激蛋白)是一种由酵母在37℃到42℃的培养条件下分泌的糖蛋白。利用HSP150的这一特性，能够很容易地调控hGCSF的表达。首先克隆HSP150启动子和分泌信号，然后通过插入hGCSF基因来制备YEpHSPGC。实施例31HSP150启动子和前导序列的PCR合成以下引物用于HSP150启动子和前导序列的PCR。
5′CTA GAC GTC GAC GAT AAG TCG CCA ACT CAG CCT 3′SalI5′CTA GCA GGC ACC GGC CAA AGT AGT AGC GGC CAA 3′KpnI采用该引物由酿酒酵母基因组DNA经PCR来扩增大约0.4kb的HSP150启动子和前导序列。纯化后，用KpnI和SalI消化该质粒。实施例32制备YEpHSPGC用HSP150启动子和前导序列代替YEp2kGC中的MF(交配因子)α1启动子和杀伤毒素前导序列，并将所得质粒命名为YEpHSPGC。
VII.利用pIL20GC和YEp2kIL20GC表达hGCSF实施例33酵母的转化为了在酵母中表达hGCSF，用pIL20GC和YEp2kIL20GC转化酵母。
将酿酒酵母2805(a，pep4∷HIS3，prol-，canl，GAL1，his3，ura3-52)接种到3ml的YEPD培养基(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)中，于30℃、250rpm过夜培养。培养的细胞再接种到15ml YEPD培养基中。当OD600约为1.0时，将培养物离心，然后根据碱性阳离子-酵母转化试剂盒(Bio101)的说明来制备感受态酵母。用TE缓冲液洗涤酵母沉淀，将沉淀悬浮在醋酸锂溶液中，并于30℃、120rpm培养。离心悬浮液后，将沉淀悬浮在TE缓冲液中，并与转化质粒、载体DNA和组胺在小塑料离心管中混匀。将混合溶液在室温放置15分钟后，向其中添加PEG，并将所得溶液于30℃放置10分钟。对反应液于42℃进行5分钟的热激处理，离心，然后悬浮在200μl SOS培养基中。将悬浮溶液铺在SD琼脂平板培养基(0.8g/l完全补充物培养基-URA(Bio101)、6.7g/l酵母无氨基酸氮基础(DIFCO)、2％葡萄糖、1.5％琼脂)上，于30℃培养3天，挑选出URA+菌落。将被pIL20GC转化了的酵母命名为酿酒酵母GCl，被YEp2kIL20GC转化了的酵母命名为酿酒酵母k2GC，两个菌株均于1995年9月27日保藏在韩国典型培养物保藏中心(保藏号分别为KCTC0193BP和KCTC0195BP)。实施例34GCSF的表达将菌落接种到SD培养基中，并于30℃、250rpm过夜培养。将培养液离心后，沉淀悬浮到1ml YEPGal培养基(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％半乳糖)中，于30℃、250rpm培养15小时以便表达hGCSF。将培养物离心，取0.5ml上清液与10μg/ml BSA和10％TCA混匀，置冰上20分钟。然后将其于4℃、13000rpm离心10分钟来沉淀hGCSF。
将沉淀溶解在含有20μl蒸馏水和20μl2×SDS染料(125mMTris-HCl(pH6.8)、4％SDS、20％甘油、10％2-巯基乙醇)的溶液中，该溶液用16％SDS(十二烷基磺酸钠)-PAGE凝胶(Laemmli，自然227680-684)电泳分析，用考马斯蓝将胶染色。结果显现出18.7kDa的hGCSF带。实施例35发酵培养生产hGCSFa)菌株和培养基在被重组质粒pIL20GC转化了的酵母的补料分批培养物中表达和生产hGCSF。种子培养基每升含有20g葡萄糖、6.7g YNB(酵母无氨基酸氮基础)和0.8g CSM-Ura(无尿嘧啶完全补充混合物)。用于分批和补料分批培养的培养基组分如下(1)分批培养(每升)a)KH2PO410g(NH4)2SO42gCaCl22H2O 0.5gNaCl0.5g微量金属溶液10ml维生素溶液 1ml水解酪蛋白氨基酸 5gTween 800.6gb)MgSO4·7H2O 0.5gc)葡萄糖 10g组分a)、b)和c)分别在121℃加热15分钟高压灭菌。(2)补料分批培养1)生长期(每升)a)(NH4)2SO43gKH2PO45g维生素溶液 3.5ml微量金属溶液5ml水解酪蛋白氨基酸变量Tween 800.6gb)MgSO4·7H2O 4gc)葡萄糖 变量生长期培养基中sequence与水解酪蛋白氨基酸的浓度比在0.5到4.5。
2)诱导或生产发酵期(每升)a)(NH4)2SO43gKH2PO45g维生素溶液 3.5ml微量金属溶液5ml酵母提取物 变量Tween 800.6gb)MgSO4·7H2O 4gc)半乳糖 变量诱导期培养基中葡萄糖与酵母提取物的浓度比在0.5到3。
组分a)、b)和c)分别在121℃加热15分钟高压灭菌。
每升微量金属溶液包含2.78g FeSO4、1.36g ZnCl2·2H2O、0.8gCuSO4·5H2O、2.42g Na2MoO4·2H2O、2.38g CoCl2·6H2O和1.69gMnSO4。
每100ml维生素溶液包含0.6g肌醇、0.12g泛酸钙、0.12g盐酸吡哆醇、0.12g硫胺素和0.01g生物素。
b)培养和生产hGCSF将重组酵母在与种子培养基组分相同的琼脂平板培养基上培养，之后，将菌落悬浮在15％甘油溶液中并保存于-70℃。进行培养时，将保存于-70℃的重组酵母铺在上述琼脂平板培养基上，并于30℃培养48小时。然后将菌落接种到摇瓶(250ml)种子培养基中，于30℃、250rpm培养。24小时后，将种子培养物以最高5％的接种量接种到分批培养基中，在5L发酵罐中(30℃、pH5.5)进行培养。当培养基中的葡萄糖耗尽时，通过与发酵罐控制舱相连的泵加入用于补料分批培养的生长期培养基。用以下设计公式控制培养基进料速率以便使葡萄糖的浓度保持在100mg/l以下。μ=μ0(S)(1-XXm)]]>Fi=μXiViS0Yx/s]]>Vi+1＝Vi+Fi(Δt)Xi+1Vi+1＝XiViexp(μΔt)S0补料培养基中的葡萄糖浓度(g/L)X培养液中的酵母浓度(g/L)Xm细胞生物量抑制常数(g/L)μ比生长速率(hr-1)V培养体积(L)F体积进料速率(L/hr)Δt30秒在生长期中，当酵母的浓度达到25到35g/L时，应当将补料培养基换成诱导期培养基。控制体积进料速率以便使半乳糖浓度保持在10到35g/L。通过控制震摇速率和气流速率使发酵液中的溶氧浓度保持在40％气体饱和度以上。从发酵罐中采集培养样品用于分析细胞密度、乙醇浓度、hGCSF浓度和质粒稳定性。结果，在发酵液中产生的hGCSF浓度达到230mg/L，乙醇积累被抑制，质粒稳定性维持在90％以上。
VIII.用YEpHSPGC表达hGCSF实施例36转化酵母及表达GCSF借助于碱性-阳离子酵母转化试剂盒(Bio101)用YEpHSPGC来转化酿酒酵母2805，挑选出Ura+的转化子。被YEpHSPGC转化了的酵母命名为酿酒酵母HGCA，并于1995年9月27日保藏在韩国典型培养物保藏中心(保藏号KCTC 0194BP)。将在无尿嘧啶的SD培养基上长出的酵母菌落接种到3ml液体培养基中，并于36℃、250rpm温育。将离心后沉积下来的沉淀物悬浮在1ml YEP Gal培养基(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％半乳糖)中，于37℃、250rpm培养18小时。将培养液离心后，向沉淀和上清液中各加入SDS染料，并经16％SDS-PAGE分析蛋白质。在上清液中，没有显现出被诱导的重组蛋白质带，但在沉淀部分中，出现了一个20.1 kDa大小的新的主要带。用hGCSF Ab(R&D System)和抗小鼠IgG-碱性磷酸酶做Western印迹，证明该20kDa大小的蛋白质有免疫反应性。
IX.hGCSF的表达实施例37制备pIL20XGC为了便于克隆，向pIL20GC中插入XbaI位点。
1)PCR首先，用合成仪(ABI，392 DNA/RNA合成仪)合成以下包含XbaI位点的寡核苷酸。
5′TCT CTT GTC TAG AGA AAC AGC T 3′XbaI用上述引物和如下与交配因子α互补的引物做PCR。
5′ACA ATA GAG CTC TAT AAA ACA 3′SacI用pIL20GC作为模板。向100μl含有200μM dNTP和50pmol每种引物的PCR反应溶液中加入2单位Vent DNA聚合酶，然后使反应按照如下条件循环35次预处理90℃，60秒；退火45℃，5秒；延伸72℃，15秒；变性94℃，5秒；后反应53℃，30秒用1.5％琼脂糖凝胶经过电泳分离出扩增的杀伤毒素前导序列-IL-1β-24-AA DNA片段，将80bp的DNA带洗脱下来并进行纯化。由PCRMetACA ATA GAG CTC TAT AAA ACA ATG AAC ATC TTC TAC ATCTGT TAT CTC GAG ATA TTT TGT TAC TTG TAG AAG ATG TAGSacITTC TTG TTC TTG TTG TCT TTC GTT CAA GGT TTG TCA CTGAAG AAC AAG AAC AAC AGA AAG CAA GTT CCA AAC AGT GACAAC TGC ACG CTC CGG GAC TCA CAG CCA AAA AGC TTG GTGTTG ACG TGC GAG GCC CTG AGT GTC GGT TTT TCG AAC CACATG TCT GGT CCA TAT GGA CTG AAA GCT GGT GTTTAC AGA CCA GGT ATA CCT GAC TTT CGA CCA CAATCT CTA GAC AAG AGAAGA GAT CTG TTC TCTXbaI1β-24-AA DNA片段，将80bp的DNA带洗脱下来并进行纯化。由PCR获得的DNA具有以下碱基序列。
通过PCR插入XbaI位点时，氨基酸序列没有发生变化，而只有碱基序列水平的取代。
2)用如上合成的PCR产物和与hGCSF基因C-端互补的寡核苷酸由PCR获得hGCSF基因。
与hGCSF基因C-端互补的寡核苷酸如下5′ATG GGA GGA TCC GGG CTT GGC TCA GGG CTG GGC 3BamHI用pIL20GC作为模板。向100μl含有50pmol引物、扩增的杀伤毒素前导序列-IL-1β-24AA-XbaI-KEX2的DNA片段和20μM dNTP的反应溶液中加入2单位Vent DNA聚合酶，然后使反应按照如下条件循环35次预处理95℃，60秒；退火55℃，5秒；延伸72℃，15秒；变性94℃，7秒；后反应53℃，30秒用1％琼脂糖凝胶经过电泳分离出扩增产物(杀伤毒素前导序列-IL-1β N端(24AA)-XbaI-KEX2-hGCSF)，从凝胶上洗脱下0.66kb大小的DNA带，用限制酶SacI和BamHI消化，最后进行纯化。用SacI和BamHI于37℃将1μg pIL20GC消化1小时。将消化过的质粒在1％琼脂糖凝胶中电泳，用Jetsorb将DNA洗脱下来。加入T4DNA连接酶使经SacI和BamHI消化过的PCR产物与质粒pIL20GC在30μl连接反应溶液中反应。用反应混合物转化大肠杆菌XL-1 Blue。培养菌落，然后纯化质粒。挑选出能被限制酶XbaI消化的质粒并命名为pIL20XGC。实施例38酵母的转化为了在酵母中表达hGCSF，用pIL20XGC转化酵母。将酿酒酵母2805(a，pep4∷HI53，pro1-δ，can1，GAL1，his3δ，ura3-52)接种到3mlYEPD培养基中，于30℃、250rpm过夜培养。再将它接种到15ml YEPD培养基中。当OD600约为1时，将培养物离心。然后根据碱性阳离子-酵母转化试剂盒(Bio101)的说明来制备感受态酵母。用TE缓冲液洗酵母沉淀，将所得酵母沉淀悬浮在醋酸锂溶液中，并于30℃、120rpm振荡。离心悬浮液后，将沉淀悬浮在TE缓冲液中，并加入含有转化质粒、载体DNA和组胺的小塑料离心管中。在室温放置15分钟后，向该溶液中加入PEG溶液，并将得到的溶液于30℃放置10分钟。将混合液于42℃加热5分钟并离心后，将沉淀悬浮在200μl SOS培养基中，随后铺在SD琼脂平板培养基上，于30℃培养3天。最后挑选出URA+菌落。
该酵母菌株已保藏在韩国典型培养物保藏中心(保藏号为KCTC0330BP)。实施例39表达hGCSF将菌落接种到3ml SD培养基中，并于30℃、250rpm过夜培养。离心培养液后，将沉淀悬浮在1ml YEPGal培养基中，于30℃、250rpm培养15小时，最后诱导表达hGCSF。向培养液中加入等量的2×SDS染料(125mM Tris-HCl(pH6.8)、4％SDS、20％甘油、10％2-巯基乙醇)，并将溶液加热5分钟。在15％SDS-PAGE中分离出蛋白质(Laemmli，自然227680-684)并用考马斯蓝染色。结果表明hGCSF表达水平与用pIL20GC的情况相同。
X.纯化所表达的hGCSF蛋白质实施例40硫酸胺沉淀将酵母细胞培养物于10,000×g离心10分钟后，用(NH4)2SO4使上清液饱和度达到85％并于4℃放置24小时。于10,000×g离心30分钟后，将得到的沉淀溶于含有0.1mM EDTA和1mM DTT的50mMTris(pH7.8)缓冲液中，于10,000×g离心10分钟来除去不溶物。所有上述实验均在4℃进行。进一步通过凝胶渗透层析来纯化由以上操作获得的hGCSF。实施例41凝胶渗透层析用含有1mM DTT和0.1mM EDTA的50mM Tris(pH7.8)缓冲液洗涤凝胶渗透层析介质Sephacryl-S-200(Pharmacia)，并用所述介质装柱(1.6×100cm)。按上述(NH4)2SO4沉淀过程来浓缩20ml培养液中的蛋白质，并将浓缩液上样到柱子中，用含有1mM DTT和0.1mMEDTA的50mM Tris(pH7.8)缓冲液洗脱。通过冻干来浓缩每个峰(在280nm光吸收处产生的峰)中的蛋白质。根据每个峰样品的SDS-PAGE分析结果，第一个峰样品中含有hGCSF和一些其他蛋白质，第二个峰样品中含有培养基组分肽/蛋白质(图15)。多数培养基肽/蛋白质被Sephacryl-S-200凝胶过滤层析除去。将经过凝胶渗透层析而部分纯化的hGCSF样品再进行以下的C4反相HPLC处理。实施例42C4反相HPLC用反相HPLCC4柱将经凝胶渗透层析部分纯化的hGCSF样品做最后纯化。C4柱子是Vydac公司的产品，柱体积为1.0×25cm。流速为2ml/min。注入大约100μg介质后，用0.1％TFA/水洗脱柱子5分钟，使用0到100％线性梯度的0.1％TFA/乙腈。于90％0.1％TFA/乙腈梯度洗脱下hGCSF。经SDS-PAGE证实hGCSF已完全纯化(图16)。在实施例44-46中所述纯化操作中，hGCSF回收率为8％，从1L培养液中获得大约18mg纯hGCSF。
XI.分析纯化hGCSF的N-端氨基酸实施例43纯hGCSF的N-端氨基酸分析将经C4反相HPLC分离的hGCSF转印到PVDF膜上，并测定其N-端氨基酸序列。
该N-端氨基酸序列与成熟hGCSF的N-端氨基酸序列(NH2-苏氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-COOH)相符。这项分析是在韩国基础科学中心的技术协助下进行的。分析所用蛋白质测序仪是Milligen6600B，用HPLC来分析Edman降解法制备的PTH-氨基酸衍生物。
流动相A35mM醋酸铵缓冲液(pH4.8)流动相B100％乙腈温度50C
氨基酸序列还用聚合物偶联法进行了确定。将5ml溶液A点在膜板(PVDF)的每个边上，将膜板干燥15到20秒。将膜板放在55℃的加热板上，取30ml溶液B点在其上，干燥7分钟(干燥不要超过10分钟)。将5ml溶液C点在膜板的每个边上，干燥15到20秒。将膜板放在55℃加热板上，取30ml溶液D点在上面，干燥5分钟。再点上20ml溶液B，干燥5分钟，用乙醇、水和甲醇冲洗膜板。
A)PITC溶液(10nmol/μl，溶于乙酸乙酯)B)缓冲液(2％三乙胺溶于50％甲醇，v/v)C)DITC溶液(0.1％w/v，溶于乙酸乙酯)D)聚合物溶液(0.1％w/v，盐酸多芳胺(低分子量)溶于B溶液)根据由以上方法得到的氨基酸分析结果，在第一轮检测到苏氨酸，第二轮检测到脯氨酸，第三轮检测到亮氨酸，第四轮检测到甘氨酸，第五轮检测到脯氨酸。因此，本发明制备的hGCSF的N-端氨基酸序列为NH2-苏氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸，它与真正的人hGCSF的N-端氨基酸序列吻合。
XII.用pIL20XGH表达hGH实施例44人生长激素(hGH)的PCR为了做hGH的PCR，合成如下与成熟人生长激素的N-端和C-端互补的寡核苷酸。5′TGT TTC TCT AGA CAA GAG ATT CCC AAC CAT TCC CTT ATC CAG G 3′XbaI5′ATG CCA GGA TCC GAG CTA GAA GCC ACA GCT GCC CTC CAC A 3′BamHI向100μl含有50pmol各引物和200μM dNTP的反应溶液(10mMKCl、10mM(NH4)2SO4、20mM Tris-HCl(pH8.8)、2mM MgSO4、0.1％TritonX-100)中加入2单位Vent DNA聚合酶，用人垂体cDNA文库作为模板，使PCR按照如下条件循环35次预处理94℃，60秒；
退火60℃，5秒；延伸72℃，10秒；变性94℃，7秒；后反应53℃，30秒将1％琼脂糖凝胶中显现的大约0.6kb的DNA带纯化，并用限制酶XbaI和BamHI消化。用限制酶XbaI和BamHI将1μg pIL20XGC于37℃消化1小时，在1％琼脂糖凝胶中进行分离。然后除去hGCSF片段，选择剩余的载体部分并洗脱下来。用T4DNA连接酶在30μl连接反应液中将hGH基因与用XbaI和BamHI消化过的pIL20XGC连接在一起。用反应混合液转化大肠杆菌XL-1 Blue后，培养菌落，然后纯化质粒。用限制酶XbaI和BamHI消化质粒，挑出含有hGH基因的质粒并命名为pIL20XGH。实施例45转化酵母为了在酵母中表达hGH，用pIL20XGH转化酵母。将酿酒酵母2805(a，pep4∷HIS3，pro1-δ，can1，GAL1，his3δ，ura3-52)接种到3ml YEPD培养基中，于30℃、250rpm培养过夜。将培养液再接种到15ml YEPD培养基中，当OD600约为1时，将培养物离心，然后根据碱性阳离子-酵母转化试剂盒(Bio101)的使用说明来制备感受态酵母。用TE缓冲液洗酵母沉淀，将所得沉淀悬浮在醋酸锂溶液中，并于30℃、120rpm振荡。离心悬浮液，将沉淀悬浮在TE缓冲液中，并加入到含有转化质粒、载体DNA和组胺的小塑料离心管中。将混合溶液在室温放置15分钟后，向混合液中添加PEG，并将溶液于30℃放置10分钟。对上述溶液于42℃进行5分钟的热激处理，然后悬浮于200μl SOS培养基中，铺在SD琼脂平板培养基上，并于30℃培养3天，最后挑选出URA+菌落。
这株酵母菌被保藏在韩国典型培养物保藏中心(保藏号为KCTC0331BP)。实施例46表达hGH将菌落接种到SD培养基中，并于30℃、250rpm过夜培养。离心培养液，将沉淀悬浮到1ml YEPGal培养基中，于30℃、250rpm培养15小时以便诱导hGH的表达。向培养液中加入2×SDS染料(125mMTris-HCl(pH6.8)、4％SDS、20％甘油、10％2-巯基乙醇)，并将其加热5分钟，16％SDS-PAGE凝胶(Laemmli，自然227680-684)电泳。用考马斯蓝将胶染色，检测到相当于大约22kDa大小的hGH带。实施例47发酵培养生产hGH(a)菌株和培养基用被重组质粒pIL20XGH转化了的酵母经补料分批培养来生产hGH。种子培养基的成分与hGCSF发酵中所用的相同。用于分批和补料分批培养的培养基成分如下(1)分批培养(每升)与实施例35相同(2)补料分批培养1)生长期(每升)a)(NH4)2SO43gKH2PO45g维生素溶液 3.5ml微量金属溶液5ml水解酪蛋白氨基酸136gTween 800.6gb)MgSO4·7H2O 4gc)葡萄糖 409g2)诱导期或发酵生产期(每升)a)(NH4)2SO43gKH2PO45g维生素溶液3.5ml微量金属溶液 5ml酵母提取物167gTween 80 0.6gb)MgSO4·7H2O 4gc)半乳糖333g组分a)、b)和c)分别在121℃加热15分钟高压灭菌。微量金属溶液和维生素溶液的组成与实施例35中的相同。
b)培养和生产hGH在生长期中，当酵母的浓度达到25到35g/L时，应当将补料培养基换成上述诱导期培养基。控制培养基的进料速率以便使培养液中的半乳糖浓度保持在大约18g/L。除非特别指出，培养物的保存和培养方法与实施例35相同。结果，仅有极微量的乙醇累积，质粒稳定性在80％以上，培养液中的hGH浓度增加到1330mg/L。
权利要求
1.包含来源于酵母的启动子和来源于酵母的分泌信号的表达载体。
2.权利要求1的表达载体，其中所述来源于酵母的启动子是包含GAL1-10 UAS和交配因子α-1启动子的杂合启动子。
3.权利要求1的表达载体，其中所述来源于酵母的分泌信号包含杀伤毒素分泌信号和IL-1β氨基端的24个氨基酸。
4.权利要求3的表达载体，其中所述杀伤毒素分泌信号按照酵母密码子使用习惯得到了优化。
5.权利要求1的表达载体，该载体除了包含来源于酵母的启动子和来源于酵母的分泌信号外，还包含转录终止子和GAL4基因。
6.权利要求5的表达载体，其中所述转录终止子是GAPDH的转录终止子。
7.酵母表达载体YEp2-k，它包含GAL UAS-MFα1启动子-杀伤毒素前导序列-GAPDH转录终止子-GAL4。
8.表达载体YEp2kIL20GC。
9.表达载体pIL20GC。
10.用YEp2kIL20GC转化的酿酒酵母转化子K2GC(保藏号KCTC 0195BP)。
11.用pIL20GC转化的酿酒酵母转化子GC1(保藏号KCTC0193BP)。
12.包含热激蛋白的启动子和其分泌信号的表达载体。
13.权利要求11的表达载体，其中所述热激蛋白是HSP150。
14.表达载体YEpHSPGC。
15.用YEpHSPGC转化的酿酒酵母转化子HGCA(保藏号KCTC0194BP)。
16.表达载体pIL20XGC。
17.用pIL20XGC转化的酿酒酵母转化子(保藏号KCTC0330BP)。
18.通过培养权利要求10、11、15或17所述的转化子来制备hGCSF的方法。
19.表达载体pIL20XGH。
20.用pIL20XGH转化的酿酒酵母转化子(保藏号KCTC0331BP)。
21.通过培养权利要求20所述的转化子来制备人生长激素的方法。
全文摘要
本发明涉及通过使用重组DNA技术由酵母来制备人粒细胞集落刺激因子(hGCSF)和人生长激素(hGH)的方法。更具体地说,本发明涉及利用酵母表达载体来制备hGCSF或hGH的方法,该表达载体所含杂合启动子包括来自酵母的两个不同基因的启动子,即酵母杀伤毒素前导肽和IL－1β的氨基端。另外,本发明涉及利用含有HSP150启动子和分泌信号的表达载体来制备hGCSF的方法。
文档编号C12N15/18GK1256711SQ97182214
公开日2000年6月14日 申请日期1997年5月27日 优先权日1997年5月27日
发明者张基龙, 文载雄, 裴千淳, 梁斗硕, 李志远, 成百麟 申请人:(株)韩-合纤