本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种检测微卫星不稳定性的多重荧光pcr扩增试剂及试剂盒。
背景技术：
：：微卫星又称短串联重复序列(shorttandemrepeats,strs)或简单重复序列(simplesequencesrepeats,ssrs)，广泛分布于人类基因组中。重复序列一般由1～6个核苷酸组成，特别是以二核苷酸重复序列即(ca/gt)n最为常见，n为重复次数，通常为15～60次。微卫星能自身特异性的结合蛋白质或直接编码蛋白质，有的则可能参与染色单体的折叠或端粒的形成等。微卫星通过改变dna结构或通过与特异性蛋白质结合而发挥基因调控作用，是一类新的、多态信息容量高的分子标记。微卫星不稳定性(microsatelliteinstability，msi)是指由于错配修复或复制错误等引起的简单重复序列的增加或丢失，导致微卫星的长度发生改变。msi发生的主要原因是参与配对错误修复的基因功能发生缺陷，因而不能正常的校正复制错误，引起微卫星的dna发生改变，使其不能正常地发挥调控作用。msi容易导致细胞增殖及分化异常，甚至促发恶性肿瘤形成。与正常组织相比，在肿瘤中的微卫星更容易导致微卫星长度发生改变。研究表明msi与结直肠癌、胃癌、子宫内膜癌等肿瘤发生密切相关。其中大约15％的散发性结直肠癌与msi相关，90％以上的遗传性非息肉病性结直肠癌(hnpcc，也称lynch综合症)与msi相关，因此对msi检测在临床上具有重要意义。检测微卫星不稳定性的方法一般通过选定特异的引物，然后pcr扩增样本中的微卫星位点，扩增后的产物经电泳检测(如毛细管电泳)后在显示系统中分析，并与正常组织作对照，判断微卫星位点的序列长度等有无改变。nci(nationalcancerinstitute)推荐了5个微卫星位点作为msi(微卫星不稳定性)检测的标准位点，分别为bat25、bat26、d2s123、d5s346和d17s250。其中bat25和bat26具有单核苷酸重复序列，d2s123、d5s346和d17s250具有双核苷酸重复序列。检测后比较肿瘤和正常样本的检测结果，如果以上5个微卫星位点中有2个或2个以上微卫星位点发生变化，称为高频型(high-frequencymsi，msi-h)；只有1个微卫星位点发生变化，称为低频型(low-frequencymsi，msi-l)，5个均没有发生改变称为微卫星稳定型(microsatellitestable，mss)。然而，传统的pcr扩增试剂对微卫星位点(bat25、bat26、d2s123、d5s346和d17s250)进行pcr扩增后，各个微卫星位点扩增得到的扩增产物经电泳检测后荧光峰容易交叉重叠，因此较难在同一pcr体系中同时检测微卫星位点bat25、bat26、d2s123、d5s346和d17s250是否发生变化。技术实现要素：基于此，有必要提供一种pcr扩增后各个微卫星位点的扩增产物经电泳检测后产生的荧光峰不会交叉重叠，能够在同一pcr体系中同时检测微卫星位点bat25、bat26、d2s123、d5s346和d17s250是否发生变化的检测微卫星不稳定性的多重荧光pcr扩增试剂及检测试剂盒。一种检测微卫星不稳定性的多重荧光pcr扩增试剂，包括：针对微卫星位点bat25设计的上游引物bat25-f1和下游引物bat25-r1，所述上游引物bat25-f1的碱基序列如seqidno.1所示，所述下游引物bat25-r1的碱基序列如seqidno.2所示；针对微卫星位点bat26设计的上游引物bat26-f1和下游引物bat26-r1，所述上游引物bat26-f1的碱基序列如seqidno.3所示，所述下游引物bat26-r1的碱基序列如seqidno.4所示；针对微卫星位点d2s123设计的上游引物d2s123-f1和下游引物d2s123-r1，所述上游引物d2s123-f1的碱基序列如seqidno.5所示，所述下游引物d2s123-r1的碱基序列如seqidno.6所示；针对微卫星位点d5s346设计的上游引物d5s346-f1和下游引物d5s346-r1，所述上游引物d5s346-f1的碱基序列如seqidno.7所示，所述下游引物d5s346-r1的碱基序列如seqidno.8所示；以及针对微卫星位点d17s250设计的上游引物d17s250-f1和下游引物d17s250-r1，所述上游引物d17s250-f1的碱基序列如seqidno.9所示，所述下游引物d17s250-r1的碱基序列如seqidno.10所示。在一个实施方式中，所述扩增试剂还包括：针对微卫星位点pentac设计的上游引物pentac-f1和下游引物pentac-r1，所述上游引物pentac-f1的碱基序列如seqidno.11所示，所述下游引物pentac-r1的碱基序列如seqidno.12所示。在一个实施方式中，所述扩增试剂还包括：针对微卫星位点pentad设计的上游引物pentad-f1和下游引物pentad-r1，所述上游引物pentad-f1的碱基序列如seqidno.13所示，所述下游引物pentad-r1的碱基序列如seqidno.14所示。在一个实施方式中，所述扩增试剂中，所述上游引物bat25-f1的浓度为50nmol/l～200nmol/l，所述下游引物bat25-r1的浓度为50nmol/l～200nmol/l；及/或，所述上游引物bat26-f1的浓度为50nmol/l～200nmol/l，所述下游引物bat26-r1的浓度为50nmol/l～200nmol/l；及/或，所述上游引物d2s123-f1的浓度为50nmol/l～200nmol/l，所述下游引物d2s123-r1的浓度为50nmol/l～200nmol/l；及/或，所述上游引物d5s346-f1的浓度为50nmol/l～200nmol/l，所述下游引物d5s346-r1的浓度为50nmol/l～200nmol/l；及/或，所述上游引物d17s250-f1的浓度为50nmol/l～200nmol/l，所述下游引物d17s250-r1的浓度为50nmol/l～200nmol/l。在一个实施方式中，所述上游引物bat25-f1和所述下游引物bat25-r1中的至少一个标记有第一荧光基团，所述上游引物bat26-f1和所述下游引物bat26-r1中的至少一个标记有第二荧光基团，所述上游引物d2s123-f1和所述下游引物d2s123-r1中的至少一个标记有第三荧光基团，所述上游引物d5s346-f1和所述下游引物d5s346-r1中的至少一个标记有第四荧光基团，所述上游引物d17s250-f1和所述下游引物d17s250-r1中的至少一个标记有第五荧光基团，且所述第三荧光基团与所述第四荧光基团选自两种不相同的荧光基团。在一个实施方式中，所述第一荧光基团标记在所述下游引物bat25-r1上，所述第二荧光基团标记在所述上游引物bat26-f1上，所述第三荧光基团标记在所述上游引物d2s123-f1上，所述第四荧光基团标记在所述上游引物d5s346-f1上，所述第五荧光基团标记在所述下游引物d17s250-r1上。在一个实施方式中，所述第一荧光基团、所述第二荧光基团、所述第三荧光基团、所述第四荧光基团和所述第五荧光基团均选自fam荧光基团、tamra荧光基团、rox荧光基团和joe荧光基团中的一种。在一个实施方式中，所述第一荧光基团为fam荧光基团，所述第二荧光基团为tamra荧光基团，所述第三荧光基团为fam荧光基团，所述第四荧光基团为joe荧光基团，所述第五荧光基团为joe荧光基团。一种检测微卫星不稳定性的多重荧光pcr检测试剂盒，包括上述的扩增试剂。在一个实施方式中，所述试剂盒中还包括taqdna聚合酶和pcr反应缓冲液。上述检测微卫星不稳定性的多重荧光pcr扩增试剂，包括分别针对5个微卫星位点(bat25、bat26、d2s123、d5s346和d17s250)设计的上游引物和下游引物。试验结果表明，上述特定序列的引物能够分别特异性扩增相应的微卫星位点，各微卫星位点的扩增产物条带单一性好。同时对5个微卫星位点(bat25、bat26、d2s123、d5s346和d17s250)进行pcr扩增后，各扩增产物经电泳检测后产生的荧光峰没有交叉重叠的现象，从而能够在同一pcr体系中同时检测微卫星位点bat25、bat26、d2s123、d5s346和d17s250的微卫星不稳定性，检测效率高，灵敏度好。附图说明图1为实施例1中各微卫星位点的引物对人唾液中提取的dna进行pcr扩增后的扩增产物的电泳对比图；图2为采用实施例1中设计的微卫星位点bat25的引物对野生型bat25质粒进行单重荧光pcr扩增后产物的ce电泳图；图3为采用实施例1中设计的微卫星位点bat26的引物对野生型bat26质粒进行单重荧光pcr扩增后产物的ce电泳图；图4为采用实施例1中设计的微卫星位点d2s123的引物对野生型d2s123质粒进行单重荧光pcr扩增后产物的ce电泳图；图5为采用实施例1中设计的微卫星位点d5s346的引物对野生型d5s346质粒进行单重荧光pcr扩增后产物的ce电泳图；图6为采用实施例1中设计的微卫星位点d17s250的引物对野生型d17s250质粒进行单重荧光pcr扩增后产物的ce电泳图；图7为采用实施例2中设计的微卫星位点pentac的引物对野生型pentac质粒进行单重荧光pcr扩增后产物的ce电泳图；图8为采用实施例2中设计的pcr扩增试剂对野生型质粒进行六重荧光pcr扩增后产物的ce电泳图；图9为采用实施例2中设计的pcr扩增试剂对野生型质粒和突变型质粒的混合质粒进行六重荧光pcr扩增后产物的ce电泳图；图10采用实施例2中设计的pcr扩增试剂对临床上样本1701215的正常组织和肿瘤组织的基因组dna进行六重荧光pcr扩增后产物的ce电泳对比图；图11采用实施例2中设计的pcr扩增试剂对临床上样本1717924的正常组织和肿瘤组织的基因组dna进行六重荧光pcr扩增后产物的ce电泳对比图；图12采用实施例2中设计的pcr扩增试剂对临床上样本1700021的正常组织和肿瘤组织的基因组dna进行六重荧光pcr扩增后产物的ce电泳对比图。具体实施方式为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。一实施方式的检测微卫星不稳定性的多重荧光pcr扩增试剂，包括：针对微卫星位点bat25设计的上游引物bat25-f1和下游引物bat25-r1，上游引物bat25-f1的碱基序列如seqidno.1所示，下游引物bat25-r1的碱基序列如seqidno.2所示。针对微卫星位点bat26设计的上游引物bat26-f1和下游引物bat26-r1，上游引物bat26-f1的碱基序列如seqidno.3所示，下游引物bat26-r1的碱基序列如seqidno.4所示。针对微卫星位点d2s123设计的上游引物d2s123-f1和下游引物d2s123-r1，上游引物d2s123-f1的碱基序列如seqidno.5所示，下游引物d2s123-r1的碱基序列如seqidno.6所示。针对微卫星位点d5s346设计的上游引物d5s346-f1和下游引物d5s346-r1，上游引物d5s346-f1的碱基序列如seqidno.7所示，下游引物d5s346-r1的碱基序列如seqidno.8所示。以及针对微卫星位点d17s250设计的上游引物d17s250-f1和下游引物d17s250-r1，上游引物d17s250-f1的碱基序列如seqidno.9所示，下游引物d17s250-r1的碱基序列如seqidno.10所示。发明人发现，传统的pcr扩增试剂对微卫星位点(bat25、bat26、d2s123、d5s346和d17s250)进行pcr扩增后，各个微卫星位点扩增得到的扩增产物的序列长度比较接近。经电泳检测后荧光峰容易交叉重叠，较难在同一pcr体系中同时检测多个微卫星位点是否发生变化。发明人对微卫星位点bat25、bat26、d2s123、d5s346和d17s250进行了大量的研究，重新设计引物，意外的发现具有特定的碱基序列的上游引物bat25-f1、下游引物bat25-r1、上游引物bat26-f1、下游引物bat26-r1、上游引物d2s123-f1、下游引物d2s123-r1、上游引物d5s346-f1、下游引物d5s346-r1、上游引物d17s250-f1以及下游引物d17s250-r1组合形成的pcr扩增试剂能够分别特异性的扩增相应的微卫星位点，且各扩增产物经电泳检测后产生的荧光峰没有交叉重叠的现象，从而能够在同一pcr体系中同时检测微卫星位点bat25、bat26、d2s123、d5s346和d17s250是否发生变化，检测效率高，灵敏度好。进一步地，检测微卫星不稳定性的多重荧光pcr扩增试剂能够针对从唾液或石蜡包埋组织基因组等提取的dna进行扩增，对扩增模板要求较低，灵敏度好。具体地，研究过程中还发现在对具有双核苷酸重复序列的微卫星位点d17s250进行扩增时，有比较多的非特异性的扩增产物，得到的扩增产物条带单一性较差，发明人通过对微卫星位点d17s250的引物进行重新设计，意外的发现碱基序列如seqidno.9所示的上游引物d17s250-f1与碱基序列如seqidno.10所示下游引物d17s250-r1配合，能够特异性的扩增微卫星位点d17s250，产生的扩增产物条带单一。在一个实施方式中，扩增试剂还包括针对微卫星位点pentac设计的上游引物pentac-f1和下游引物pentac-r1，上游引物pentac-f1的碱基序列如seqidno.11所示，下游引物pentac-r1的碱基序列如seqidno.12所示。微卫星位点pentac具有五核苷酸重复序列，常作为pcr时的对照微卫星位点。然而，微卫星位点pentac与d17s250相似，扩增产物条带单一性较差，pcr扩增后两者的扩增产物经电泳检测后荧光峰容易交叉重叠，不利于分析比对。而通过对引物进行重新设计，在扩增试剂中加入碱基序列如seqidno.11所示的上游引物pentac-f1和碱基序列如seqidno.12所示的下游引物pentac-r1，能够特异性的扩增微卫星位点pentac，且pentac的扩增产物电泳检测后产生的荧光峰与微卫星位点bat25、bat26、d2s123、d5s346和d17s250的扩增产物电泳检测后产生的荧光峰不会交叉重叠。因此，能够在同一pcr体系中同时检测待测的微卫星位点(bat25、bat26、d2s123、d5s346和d17s250)以及对照的微卫星位点pentac是否发生变化，检测效率高，且能够判断是否为假阳性的检测结果，检测的准确性好。在一个实施方式中，扩增试剂还包括针对微卫星位点pentad设计的上游引物pentad-f1和下游引物pentad-r1，上游引物pentad-f1的碱基序列如seqidno.13所示，下游引物pentad-r1的碱基序列如seqidno.14所示。微卫星位点pentad也具有五核苷酸重复序列，常作为pcr时的对照微卫星位点。在扩增试剂中加入碱基序列如seqidno.11所示的上游引物pentac-f1和碱基序列如seqidno.13上游引物pentad-f1和如seqidno.14所示下游引物pentad-r1，能够特异性的扩增微卫星位点pentad，且pentad的扩增产物电泳检测后产生的荧光峰与微卫星位点bat25、bat26、d2s123、d5s346和d17s250的扩增产物电泳检测后产生的荧光峰不会交叉重叠。因此，能够在同一pcr体系中同时检测待测的微卫星位点(bat25、bat26、d2s123、d5s346和d17s250)以及对照的微卫星位点pentad是否发生变化，检测效率高，且能够判断是否为假阳性的检测结果，检测的准确性好。进一步地，扩增试剂包括上游引物bat25-f1、下游引物bat25-r1、上游引物bat26-f1、下游引物bat26-r1、上游引物d2s123-f1、下游引物d2s123-r1、上游引物d5s346-f1、下游引物d5s346-r1、上游引物d17s250-f1、下游引物d17s250-r1、上游引物pentac-f1、下游引物pentac-r1、上游引物pentad-f1和下游引物pentad-r1。微卫星位点bat25、bat26、d2s123、d5s346、d17s250、pentac以及pentad的扩增产物电泳检测后产生的荧光峰均不会交叉重叠。因此，能够在同一pcr体系中同时检测待测的微卫星位点(bat25、bat26、d2s123、d5s346和d17s250)以及对照的微卫星位点(pentac和pentad)是否发生变化，检测效率高，且能够更加准确的判断是否为假阳性的检测结果，检测的准确性好。在一个实施方式中，在扩增试剂中上游引物bat25-f1的浓度为50nmol/l～200nmol/l，下游引物bat25-r1的浓度为50nmol/l～200nmol/l。在一个实施方式中，上游引物bat26-f1的浓度为50nmol/l～200nmol/l，下游引物bat26-r1的浓度为50nmol/l～200nmol/l。在一个实施方式中，上游引物d2s123-f1的浓度为50nmol/l～200nmol/l，下游引物d2s123-r1的浓度为50nmol/l～200nmol/l。在一个实施方式中，上游引物d5s346-f1的浓度为50nmol/l～200nmol/l，所述下游引物d5s346-r1的浓度为50nmol/l～200nmol/l。在一个实施方式中，上游引物d17s250-f1的浓度为50nmol/l～200nmol/l，下游引物d17s250-r1的浓度为50nmol/l～200nmol/l。在检测时，扩增试剂中的引物浓度对扩增产物电泳检测后荧光峰的强度有一定的影响，综合考虑成本和检测的灵敏度，上游引物bat25-f1、下游引物bat25-r1、上游引物bat26-f1、下游引物bat26-r1、上游引物d2s123-f1、下游引物d2s123-r1、上游引物d5s346-f1、下游引物d5s346-r1、上游引物d17s250-f1和下游引物d17s250-r1的浓度均为50nmol/l～200nmol/l，例如70nmol/l、100nmol/l、150nmol/l或190nmol/l等。优选地，扩增试剂中上游引物bat25-f1、下游引物bat25-r1、上游引物bat26-f1、下游引物bat26-r1、上游引物d2s123-f1、下游引物d2s123-r1、上游引物d5s346-f1、下游引物d5s346-r1、上游引物d17s250-f1和下游引物d17s250-r1的浓度均为100nmol/l。进一步地，扩增试剂还包括针对微卫星位点pentac设计的上游引物pentac-f1和下游引物pentac-r1时，上游引物pentac-f1和下游引物pentac-r1浓度均为50nmol/l～200nmol/l，例如70nmol/l、100nmol/l、150nmol/l或190nmol/l等。进一步地，扩增试剂还包括针对微卫星位点pentad设计的上游引物pentad-f1和下游引物pentad-r1时，上游引物pentad-f1和下游引物pentad-r1浓度均为50nmol/l～200nmol/l，例如70nmol/l、100nmol/l、150nmol/l或190nmol/l等。在一个实施方式中，上游引物bat25-f1和下游引物bat25-r1中的至少一个标记有第一荧光基团。上游引物bat26-f1和下游引物bat26-r1中的至少一个标记有第二荧光基团。上游引物d2s123-f1和下游引物d2s123-r1中的至少一个标记有第三荧光基团。上游引物d5s346-f1和下游引物d5s346-r1中的至少一个标记有第四荧光基团。上游引物d17s250-f1和下游引物d17s250-r1中的至少一个标记有第五荧光基团。且第三荧光基团与第四荧光基团选自两种不相同的荧光基团。通过标记荧光基团，便于荧光值检测相应的扩增产物的量。第三荧光基团与第四荧光基团选自两种不相同的荧光基团，便于区分微卫星位点d2s123和d5s346的扩增产物的荧光峰。发明人在研究过程中发现，微卫星位点d2s123和d5s346的扩增产物的序列长度较为接近，对微卫星位点d2s123和d5s346的扩增引物标记两种不相同的荧光基团，有利于区分微卫星位点d2s123和d5s346的扩增产物电泳后产生的荧光峰，提高检测的灵敏度。当然，可以理解，在其他实施方式中，也可以是在加入分别检测微卫星位点bat25、bat26、d2s123、d5s346和d17s250的探针，并在探针上标记荧光基团。此时，引物上可以不标记荧光基团。在一个实施方式中，第一荧光基团标记在下游引物bat25-r1上，第二荧光基团标记在上游引物bat26-f1上，第三荧光基团标记在上游引物d2s123-f1上，第四荧光基团标记在上游引物d5s346-f1上，第五荧光基团标记在下游引物d17s250-r1上。发明人在研究过程中发现，荧光基团标记在上游引物或下游引物上，对pcr扩增后产生的pcr产物电泳检测的荧光峰有一定的影响，本实施方式的荧光基团的标记位置，pcr扩增后产生的相应的扩增产物电泳检测的荧光峰单一，灵敏度高。在一个实施方式中，第一荧光基团、第二荧光基团、第三荧光基团、第四荧光基团和第五荧光基团均选自fam荧光基团、tamra荧光基团、rox荧光基团和joe荧光基团中的一种。在一个实施方式中，第一荧光基团为fam荧光基团，第二荧光基团为tamra荧光基团，第三荧光基团为fam荧光基团，第四荧光基团为joe荧光基团，第五荧光基团为joe荧光基团。进一步地，扩增试剂还包括针对微卫星位点pentac设计的上游引物pentac-f1和下游引物pentac-r1时，上游引物pentac-f1和下游引物pentac-r1中的至少一个标记有第六荧光基团。第六荧光基团选自fam荧光基团、tamra荧光基团、rox荧光基团和joe荧光基团中的一种。进一步地，扩增试剂还包括针对微卫星位点pentad设计的上游引物pentad-f1和下游引物pentad-r1时，上游引物pentad-f1和下游引物pentad-r1中的至少一个标记有第七荧光基团。第七荧光基团选自fam荧光基团、tamra荧光基团、rox荧光基团和joe荧光基团中的一种。试验结果表明，上述检测微卫星不稳定性的多重荧光pcr扩增试剂，特定序列的引物能够分别特异性扩增相应的微卫星位点，各微卫星位点的扩增产物条带单一性好。同时对5个微卫星位点(bat25、bat26、d2s123、d5s346和d17s250)进行pcr扩增后，各扩增产物经电泳检测后产生的荧光峰没有交叉重叠的现象，从而能够在同一pcr体系中同时检测微卫星位点bat25、bat26、d2s123、d5s346和d17s250是否发生变化，检测效率高，灵敏度好。进一步地，当上述检测微卫星不稳定性的多重荧光pcr扩增试剂还包括针对微卫星位点pentac设计的上游引物pentac-f1和下游引物pentac-r1，及/或pcr扩增试剂还包括针对pentad设计的上游引物pentad-f1和下游引物pentad-r1时。能够同一pcr体系中同时检测待测的微卫星位点(bat25、bat26、d2s123、d5s346和d17s250)以及对照的微卫星位点pentac及/或pentad是否发生变化，检测效率高，且能够判断是否为假阳性的检测结果，检测的准确性好。一实施方式的检测微卫星不稳定性的多重荧光pcr检测试剂盒，包括上述的扩增试剂。进一步地，上述检测试剂盒，试剂盒中还包括taqdna聚合酶和pcr反应缓冲液。该检测试剂盒能够在同一pcr体系中同时检测微卫星位点bat25、bat26、d2s123、d5s346和d17s250是否发生变化，检测效率高，灵敏度好。下面为具体实施例部分。以下实施例中，如无特别说明，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如参见萨姆布鲁克、ef弗里奇、t曼尼阿蒂斯等(金冬雁，黎孟枫等译)所著的分子克隆实验指南[m](北京：科学出版社，1992)中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。实施例1在genebank中查阅待测微卫星位点所在的基因编号，确定每个微卫星位点的主要重复序列以及主要重复序列上下游1000bp左右的碱基序列，微卫星位点的相关信息如表1所示。表1：微卫星位点的基本信息微卫星位点基因编号主要重复序列bat25l04143(a)25bat26u41210(a)26d2s123z16551.1(ca)15d5s346nm_005669(ca)20d17s250nr_033753.2(ca)24针对性的对每一个微卫星位点设计上游引物和下游引物，并相应的标记荧光基团，具体如表2所示。表2:微卫星位点的上游引物和下游引物设计的引物通过生工生物合成，将合成的上游引物bat25-f1、下游引物bat25-r1、上游引物bat26-f1、下游引物bat26-r1、上游引物d2s123-f1、下游引物d2s123-r1、上游引物d5s346-f1、下游引物d5s346-r1、上游引物d17s250-f1以及下游引物d17s250-r1混合，形成检测微卫星不稳定性的多重荧光pcr扩增试剂，其中，各引物的浓度均为100nmol/l。本实施例的pcr扩增试剂能够在同一pcr体系中同时扩增5个微卫星位点bat25、bat26、d2s123、d5s346和d17s250，各个微卫星位点扩增得到的扩增产物经电泳检测后荧光峰不会交叉重叠。实施例2本实施例的检测微卫星不稳定性的多重荧光pcr扩增试剂中的上游引物bat25-f1、下游引物bat25-r1、上游引物bat26-f1、下游引物bat26-r1、上游引物d2s123-f1、下游引物d2s123-r1、上游引物d5s346-f1、下游引物d5s346-r1、上游引物d17s250-f1以及下游引物d17s250-r1与实施例1相同，不同的是，本实施例中还加入了针对对照的微卫星位点pentac设计的上游引物pentac-f1和下游引物pentac-r1。微卫星位点pentac的相关信息如表3所示。表3：微卫星位点pentac的基本信息微卫星位点基因编号主要重复序列pentacal138752(aaaag)3针对性的对微卫星位点pentac设计pentac设计的上游引物pentac-f1和下游引物pentac-r1，并相应的标记荧光基团，具体如表4所示。表4:微卫星位点的上游引物和下游引物设计的引物通过生工生物合成，将合成的上游引物pentac-f1和下游引物pentac-r1与实施例1的pcr扩增试剂混合，形成检测微卫星不稳定性的多重荧光pcr扩增试剂。其中，上游引物pentac-f1和下游引物pentac-r1的浓度均为100nmol/l。本实施例的pcr扩增试剂能够在同一pcr体系中同时扩增6个微卫星位点bat25、bat26、d2s123、d5s346、d17s250和pentac，各个微卫星位点扩增得到的扩增产物经电泳检测后荧光峰不会交叉重叠。实施例3本实施例的检测微卫星不稳定性的多重荧光pcr扩增试剂中的上游引物bat25-f1、下游引物bat25-r1、上游引物bat26-f1、下游引物bat26-r1、上游引物d2s123-f1、下游引物d2s123-r1、上游引物d5s346-f1、下游引物d5s346-r1、上游引物d17s250-f1以及下游引物d17s250-r1与实施例1相同，不同的是，本实施例中还加入了针对对照的微卫星位点pentad设计的上游引物pentad-f1和下游引物pentad-r1。微卫星位点pentac的相关信息如表5所示。表5：微卫星位点pentad的基本信息微卫星位点基因编号主要重复序列pentadac000014(aaaag)8针对性的对微卫星位点pentad设计pentad设计的上游引物pentad-f1和下游引物pentad-r1，并相应的标记荧光基团，具体如表6所示。表6:微卫星位点的上游引物和下游引物设计的引物通过生工生物合成，将合成的上游引物pentad-f1和下游引物pentad-r1与实施例1的pcr扩增试剂混合，形成检测微卫星不稳定性的多重荧光pcr扩增试剂。其中，上游引物pentad-f1和下游引物pentad-r1的浓度均为100nmol/l。本实施例的pcr扩增试剂能够在同一pcr体系中同时扩增6个微卫星位点bat25、bat26、d2s123、d5s346、d17s250和pentad，各个微卫星位点扩增得到的扩增产物经电泳检测后荧光峰不会交叉重叠。实施例4本实施例的检测微卫星不稳定性的多重荧光pcr扩增试剂包括上游引物bat25-f1、下游引物bat25-r1、上游引物bat26-f1、下游引物bat26-r1、上游引物d2s123-f1、下游引物d2s123-r1、上游引物d5s346-f1、下游引物d5s346-r1、上游引物d17s250-f1、下游引物d17s250-r1、上游引物pentac-f1和下游引物pentac-r1、上游引物pentad-f1和下游引物pentad-r1。具体引物的序列参见上表2、表4和表5。各引物的浓度均为100nmol/l。本实施例的pcr扩增试剂能够在同一pcr体系中同时扩增7个微卫星位点bat25、bat26、d2s123、d5s346、d17s250、pentac和pentad，各个微卫星位点扩增得到的扩增产物经电泳检测后荧光峰不会交叉重叠。测试一检测扩增产物的条带采集人的唾液样本，用试剂盒(生工生物，产品编号：b518266)提取基因组dna，以人的唾液基因组dna为模板，分别加入如表1所示设计的微卫星位点bat25、bat26、d2s123、d5s346、d17s250上游引物和下游引物进行pcr扩增，扩增产物进行凝胶电泳，结果参见图1所示。最左边泳道为电泳marker(生工生物，产品编号：b600303)，marker条带大小依次为500bp，400bp，300bp，200bp，150bp，100bp，75bp，50bp和25bp。bat25、bat26、d2s123、d5s346、d17s250的扩增产物每个至少四个平行实验。从图1可以看出，采用表1所示设计引物扩增bat25、bat26、d2s123、d5s346、d17s250后，扩增产物的条带单一，说明各引物的特异性好，能够特异性的扩增相应的微卫星位点。测试二单重荧光检测扩增产物分别以1pg/μl的野生型bat25质粒、野生型bat26质粒、野生型d2s123质粒、野生型d5s346质粒、野生型d17s250质粒和野生型pentac质粒作为扩增模板。采用微卫星位点bat25、bat26、d2s123、d5s346、d17s250和pentac各自对应的上游引物和下游引物进行单重荧光pcr扩增，并将扩增产物进行ce电泳，结果分别如图2～图7所示。图中横坐标为扩增产物的基因片段的碱基数值，纵坐标为荧光数值。从图中可以看出，微卫星位点bat25、bat26、d2s123、d5s346、d17s250和pentac的扩增产物ce电泳后的荧光峰均比较集中，在相应的碱基数值位置有明显的特异性峰值。测试三六重荧光检测野生型微卫星位点的扩增产物将野生型bat25质粒、野生型bat26质粒、野生型d2s123质粒、野生型d5s346质粒、野生型d17s250质粒和野生型pentac质粒混合作为扩增模板。其中各质粒的浓度均为1pg/μl。采用实施例2的多重荧光pcr扩增试剂扩增进行荧光pcr扩增，并将扩增产物进行ce电泳，结果如图8所示。图中横坐标为扩增产物的基因片段的碱基数值，纵坐标为荧光数值。从图中可以看出，微卫星位点bat25、bat26、d2s123、d5s346、d17s250和pentac的扩增产物ce电泳后的荧光峰没有交叉重叠的现象，从而能够在同一pcr体系中同时检测微卫星位点bat25、bat26、d2s123、d5s346、d17s250和pentac是否发生变化，检测效率高，灵敏度好。测试四六重荧光检测含有突变型的微卫星位点的扩增产物将的野生型bat25质粒、野生型bat26质粒、野生型d2s123质粒、野生型d5s346质粒、野生型d17s250质粒和野生型pentac质粒混合，然后加入突变型bat25质粒(缺失5个重复的碱基)、突变型bat26质粒(缺失4个重复的碱基)、突变型d2s123质粒(缺失27个重复的碱基)和突变型d17s250质粒(缺失10个重复的碱基)混合。其中各质粒的浓度均为1pg/μl。采用实施例2的多重荧光pcr扩增试剂扩增进行荧光pcr扩增，并将扩增产物进行ce电泳，结果如图9所示。图中横坐标为扩增产物的基因片段的碱基数值，纵坐标为荧光数值。比较图8和图9可知，加入突变型bat25质粒、突变型bat26质粒、突变型d2s123质粒和突变型d17s250质粒后，相应的四个微卫星位点的扩增产物的峰发生左移或右移，检测灵敏度高。测试五分别以临床上同一患者的正常组织样本和肿瘤组织样本的基因组dna为模板，采用实施例2的多重荧光pcr扩增试剂进行msi检测。样本1701215、样本1717924以及样本1700021的msi检测ce峰图分别如图10～12所示，根据msi检测结果汇总样本的msi类型如下表7。表7:msi检测结果样品编号检测结果msi类型1701215五个位点无变化mss型1717924五个位点无变化mss型1700021bat-25，bat-26和d2s123出现双峰msh型以上所述实施例仅表达了本发明的一种或几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。sequencelisting<110>常州桐树生物科技有限公司<120>检测微卫星不稳定性的多重荧光pcr扩增试剂及试剂盒<160>14<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1gctttcctcgcctccaagaa20<210>2<211>25<212>dna<213>人工序列<400>2actatggctctaaaatgctctgttc25<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列<400>3cagagcccttaacctttttcag22<210>4<211>22<212>dna<213>人工序列<400>4gcttcttcagtatatgtcaatg22<210>5<211>24<212>dna<213>人工序列<400>5gcctgcctttaacactgctattca24<210>6<211>25<212>dna<213>人工序列<400>6tccctttctgacttggataccatct25<210>7<211>23<212>dna<213>人工序列<400>7tcagggaattgagagttacaggt23<210>8<211>24<212>dna<213>人工序列<400>8tggcatatgaataccaggatagct24<210>9<211>23<212>dna<213>人工序列<400>9ttagtagagacggggtttcaccg23<210>10<211>31<212>dna<213>人工序列<400>10tatacacatacataaactttcaaatggtttc31<210>11<211>25<212>dna<213>人工序列<400>11gacatgaacacactttgcacctgtc25<210>12<211>24<212>dna<213>人工序列<400>12caagagagcattccaacactgagc24<210>13<211>22<212>dna<213>人工序列<400>13gagcaagacaccatctcaagaa22<210>14<211>27<212>dna<213>人工序列<400>14atatttgcctaacctatggtcataacg27当前第1页12当前第1页12