一种检测伊氏锥虫的引物对及其检测方法和试剂盒与流程

本发明属于寄生虫分子检测技术领域，更具体地，涉及一种检测伊氏锥虫的引物对及其检测方法和试剂盒。

背景技术：

在自然界中，伊氏锥虫（trypanosomaevansi）是一种呈全球性分布的寄生原虫，借助吸血昆虫在马、牛、骆驼等家畜中进行传播，引起苏拉病（surra），该病临床表现为进行性消瘦、贫血、黄痘、高热、心机能衰退等，严重时可造成家畜死亡，使畜牧业造成严重损失。在我国，伊氏锥虫感染水牛等家畜的概率达到10%。因此有必要对其进行锥虫早期感染的监测，并进行药物治疗。

由于伊氏锥虫与其他家畜血液寄生锥虫，特别是亲缘关系较近的布氏锥虫（trypanosomabrucei）在形态和分子特性上非常相似，很难通过显微镜观察和常规的分子标签进行鉴定。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是克服现有伊氏锥虫检测技术方面存在的缺陷和不足，提供一种检测伊氏锥虫的引物对。所述引物对能够快速准确的将伊氏锥虫从其他锥虫以及利什曼原虫（leishmaniaspp）中鉴定出来，不需要昂贵的显微镜和专业的病原学知识，检测快速方便，可用于动物锥虫感染的检测和混合感染的鉴定，有利于开展流行病学调查，预防和控制伊氏锥虫的传播。

本发明的目的是提供一种检测伊氏锥虫的引物对。

本发明的再一目的在于提供一种检测伊氏锥虫的方法。

本发明的再一目的是提供含有所述引物的检测试剂盒。

本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的：

一种检测伊氏锥虫的引物对，包含上下游引物pag3-f和pag3-r，其序列分别如seqidno：1和seqidno：2所示：

上游引物pag3-f：5’-gtttgacaccgtggagtt-3’（seqidno.1）；

下游引物pag3-r：5’-aacagccacaaacaaccc-3’（seqidno.2）。

由于pag3（procyclinassociatedgene3）基因在伊氏锥虫中部分特异缺失，与其它的锥虫在该基因上表现出序列差异，因此本发明通过伊氏锥虫pag3基因特异性设计pcr引物对和pcr反应程序，从而实现对伊氏锥虫的快速鉴定。

所述pcr引物可用来特异性检测鉴定待测样品中是否含有伊氏锥虫；或用于鉴定伊氏锥虫；因此，所述引物对pag3-f和pag3-r在检测和/或鉴定伊氏锥虫中的应用，以及在制备伊氏锥虫检测试剂或试剂盒中的应用，均应在本发明的保护范围之内。

一种检测/鉴定伊氏锥虫的方法，所述方法具体包括如下步骤：

s1.提取待测样品dna或血液溶解液；

s2.以步骤s1所述dna或血液溶解液为模板，以pag3-f和pag3-r为引物进行pcr扩增反应；

s3.将扩增产物电泳检测，若扩增出单一250bp大小的条带，则待测样品中含有伊氏锥虫，反之则待测样品中没有伊氏锥虫。

优选地，所述pcr扩增反应体系为：引物pag3-f和引物pag3-r，100ng样品dna或5μl样品血液溶解液，2.5unitseasytaqdnapolymerase，10×easytaqbuffer(1×)、0.2mmdntps、灭菌双蒸水补齐至25μl，引物pag3-f和引物pag3-r在反应体系中的终浓度分别为0.2μm。

更优选地，所述pcr反应体系为：100ng/μldna1μl或血液溶解液5μl，10μmpag3-f0.5μl，10μmpag3-r0.5μl，10×easytaqbuffer2.5μl，2.5mmdntps2μl，5units/μleasytaqdnapolymerase0.5μl，灭菌双蒸水补充至25μl。

优选地，所述pcr扩增反应条件为：94℃3min；94℃30s，65℃10s，共30个反应循环；

此外，上述伊氏锥虫检测引物对pag3-f和pag3-r及其检测放在在制备伊氏锥虫检测试剂或试剂盒中的应用亦在本发明保护范围内。

同时，本发明还提供一种伊氏锥虫检测试剂盒，所述试剂盒包含伊氏锥虫检测引物对pag3-f和pag3-r。

优选地，所述试剂盒还含有pcr扩增反应所需试剂；所述pcr扩增反应所需试剂是指能够使得样本dna在上述引物对的作用下进行pcr扩增反应的试剂，现有技术中常规pcr扩增反应试剂均可用于本发明。

所述pcr扩增反应试剂可用商品化的试剂，例如easytaqdnapolymerase。

优选地，所述试剂盒中包含引物pag3-f和引物pag3-r，伊氏锥虫阳性对照，easytaqdnapolymerase，10×easytaqbuffer，dntps和灭菌双蒸水。

优选地，所述试剂盒还包含待测样品dna提取所需试剂及血液溶解液制备所需试剂。

作为一种优选地可实施方式，所述伊氏锥虫检测试剂盒的使用方法为：

s1.提取待测样品dna或血液溶解液；

s2.以步骤s1所述dna或血液溶解液为模板，以pag3-f和pag3-r为引物进行pcr扩增反应；

s3.将扩增产物电泳检测，若扩增出单一250bp大小的条带，则待测样品中含有伊氏锥虫，反之则待测样品中没有伊氏锥虫。

所述pcr扩增反应体系为：100ng/μldna1μl或血液溶解液5μl，10μmpag3-f0.5μl，10μmpag3-r0.5μl，10×easytaqbuffer2.5μl，2.5mmdntps2μl，5units/μleasytaqdnapolymerase0.5μl，灭菌双蒸水补充至25μl。

所述pcr扩增反应条件为：94℃3min；94℃30s，65℃10s，共30个反应循环。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明利用伊氏锥虫序列特异的pag3基因，筛选出一对能够特异性检测伊氏锥虫的引物对，该引物对能特异性扩增出伊氏锥虫的pag3片段，且灵敏度高，能够检测出仅仅含有50个锥虫的样本，或者是0.1ng的dna样本；利用该引物对能够快速准确的将其从其他锥虫以及利什曼原虫（leishmaniaspp）中鉴定出来，不需要昂贵的显微镜和专业的病原学知识，检测快速方便，可用于动物锥虫感染和混合感染的检测，有利于开展流行病学调查，预防和控制伊氏锥虫的传播。

附图说明

图1为引物对特异性检测结果；图中：泳道m：dl2000marker，泳道1为t.evansi（伊氏锥虫）、2为t.brucei（布氏锥虫）、3为t.cruzi（枯氏锥虫）、4为t.lewisi（路氏锥虫）、5为t.musculi（小鼠锥虫）、6为l.amazonensis（利什曼亚马逊属）、泳道n为阴性对照。

图2为引物对特异性检测结果；图中：泳道m：dl2000marker，泳道1为t.evansistib805（伊氏锥虫）、2为t.evansistib806（伊氏锥虫）、3为t.evansistib810（伊氏锥虫）、4为t.bruceitreu920（布氏锥虫）、5为t.bruceistib777（布氏锥虫）、6为t.bruceitreu927（布氏锥虫）、7为t.lewisicpo02(路氏锥虫)、8为t.lewisicpo04(路氏锥虫)、9为t.lewisicpo06(路氏锥虫)、10为t.musculifra（小鼠锥虫）、11为t.musculiatcc30148（小鼠锥虫）、12为t.musculiatcc30181（小鼠锥虫）、13为lv78（利什曼原虫）、14为l.amazonensis（利什曼原虫）、15为t.cruzi（枯氏锥虫）、泳道n为阴性对照。

图3为引物对在伊氏锥虫dna的pcr检测灵敏度结果；图中：泳道m：dl2000marker，泳道1～6分别为200ng、100ng、50ng、10ng、1ng、0.1ng，泳道n为阴性对照。

图4为引物对在伊氏锥虫血液pcr检测灵敏度结果；图中：泳道m：dl2000marker，泳道1～6分别为50,000个锥虫、5,000个锥虫、500个锥虫、50个锥虫、5个锥虫、0.5个锥虫，泳道n为阴性对照。

图5为pcr检测血液样本的流程图。

图6为pcr扩增目的片段，下划线英文字母标注的序列为引物结合区域。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员熟悉的意义相同。

snet缓冲液：100mmnacl，10mmtris·hcl，ph8.0，25mmedta，ph8.0，0.5%sds。

伊氏锥虫（t.evansistib805）总dna的提取：

（1）在纯化过的锥虫样品中加入300μlsnet缓冲液（在snet缓冲液中再加入蛋白酶k，蛋白酶k的终浓度为200μg/ml），56℃金属浴消化3～5h；

（2）将步骤（1）的样品取出，加入rna酶，37℃金属浴消化0.5h；

（3）将步骤（2）的样品去出，加入体积比为25：24：1的酚：氯仿：异戊醇，室温下震荡混匀成乳状液后静置2～5min；

（4）将步骤（3）的混合液用12,000rpm离心10min，转移上层水相到新的离心管中；

（5）向步骤（4）的水相中加入等体积的异丙醇沉淀dna，12,000rpm离心5分钟后弃上清；

（6）将步骤（5）收集到的沉淀，用300μl预冷的70%乙醇洗涤，再12000rpm高速离心5min，弃上清，室温挥发酒精；

（7）用100μlte溶解dna样品，测定dna含量。

实施例1引物设计

研究发现，由于pag3（procyclinassociatedgene3）基因在伊氏锥虫中部分特异缺失，与其它的锥虫在该基因上表现出序列差异，因此本实施例通过伊氏锥虫pag3基因来设计特异性扩增伊氏锥虫的pcr引物对。

首先，在tritrypdb（http://tritrypdb.org/tritrypdb/）上搜索pag3基因序列。

再根据伊氏锥虫（tevstib805.6.480;tevstib805.6.540）与布氏锥虫（tb927.6.460;tb927.6.490;tb927.6.530;tb427.06.530）的基因序列进行比对设计伊氏锥虫pag3特异引物，引物序列见表1。

其中，tubulin为内参基因。

表1引物序列

实施例2伊氏锥虫pag3检测方法特异性实验（58℃）

1、pcr反应条件如下：

（1）建立pcr扩增反应体系：100ng/μldna1μl，10μmpag3-f0.5μl，10μmpag3-r0.5μl，10×easytaqbuffer2.5μl，2.5mmdntps2μl，5units/μleasytaqdnapolymerase0.5μl，灭菌双蒸水补充至25μl。

（2）pcr扩增反应条件：94℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃1min共30个循环；72℃5min。

（3）扩增产物分析：采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。取25μl聚合酶链式反应pcr扩增的最终反应产物5μl，加入6×loadingbuffer，点样至含有溴化乙锭（etbr）染料的1.5%的琼脂糖凝胶中，120v电泳25min，在凝胶成相系统上成像观察结果。

2、结果如图1所示，所设计的引物对在上述pcr条件下能够特异性的扩增出伊氏锥虫单一250bp的片段。

另外，枯氏锥虫和利什曼原虫均被扩增出弱的单一1300bp的条带，而布氏锥虫、路氏锥虫以及小鼠锥虫均出现一些杂带，且都大于500bp，表明扩增体系或扩增程序需进一步优化。我们尝试改变pcr反应程序，提高引物对的特异性，具体实验方式见实施例3。

实施例3伊氏锥虫pag3检测方法特异性实验（65℃）

1、经过优化，pcr反应条件如下：

（1）建立pcr扩增反应体系：100ng/μldna1μl，10μmpag3-f0.5μl，10μmpag3-r0.5μl，10×easytaqbuffer2.5μl，2.5mmdntps2μl，5units/μleasytaqdnapolymerase0.5μl，灭菌双蒸水补充至25μl。

（2）pcr扩增反应条件：94℃3min；：94℃30s，65℃10s，共30个反应循环；

（3）扩增产物分析：采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。取25μl的聚合酶链式反应pcr扩增的最终反应产物5μl，加入6×loadingbuffer，点样至含有溴化乙锭（etbr）染料的1.5%的琼脂糖凝胶中，120v电泳25min，在凝胶成相系统上成像观察结果。

2、结果如图2所示，该引物对在改善后的pcr条件下扩增出伊氏锥虫250bp的片段，而布氏锥虫、路氏锥虫、小鼠锥虫、枯氏锥虫或者利什曼原虫均扩增不出片段，显示出良好的特异性。

实施例4pcr检测方法灵敏度实验（dna样品）

1、按照实施例3的方法进行pcr扩增，其中25μl体系中加入1μl不同浓度（200ng/μl、100ng/μl、50ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、0.1ng/μl）的dna（pcr的扩增条件同实施例3）。

2、按照实施例3中的pcr检测方法，结果如图3所示，至少可以检测到0.1ng的dna模板。

实施例5pcr检测方法灵敏度实验（血液样品）

收集1ml感染伊氏锥虫的小鼠血液于小离心管中，分别用未接种锥虫的小鼠血液以10倍逐级稀释；

一、皂素处理尾血得血液溶解液

（1）吸取50μl待测血液样品于离心管中；

（2）向步骤（1）的待测样品加入300μlsaponinlysisbuffer（0.22%nacl，0.015%saponin，1mmedta）；

（3）将步骤（2）的混合液用4℃,12000g离心1min，弃上清；

（4）将步骤（3）的沉淀用saponinlysisbuffer清洗三遍，用50μl1xpcrbuffer（50mmkcl，10mmtris-hcl，ph8.0，0.5%tween20，100μgofproteinasekperml）重悬；

（5）将步骤（4）的混合液置于56℃金属恒温酶解反应1h；

（6）将步骤（5）的混合液置于95℃金属恒温酶变性失活反应5min；

（7）将步骤（6）的混合液用12,000g离心1min得血液溶解液用于pcr反应。

二、建立pcr扩增反应体系

（1）pcr扩增反应体系：血液溶解液5μl，10μmpag3-f0.5μl，10μmpag3-r0.5μl，10×easytaqbuffer2.5μl，2.5mmdntps2μl，5units/μleasytaqdnapolymerase0.5μl，灭菌双蒸水补充至25μl；其中阴性对照为灭菌双蒸水。

（2）pcr扩增反应条件：同实施例3。

（3）扩增产物分析：取25μl的聚合酶链式反应pcr扩增的最终反应产物5μl，加入6×loadingbuffer，点样至含有溴化乙锭（etbr）染料的1.5%的琼脂糖凝胶中，120v电泳25min，在凝胶成相系统上成像观察结果；

（4）结果如图4所示，按照实施例3中的pcr检测方法，至少能够检测含有50个锥虫的血液样品，相当于虫血症10000个锥虫/ml，低于显微镜镜检的最低浓度，因此该pcr检测方法可用于早期伊氏锥虫感染的检测。

实施例6伊氏锥虫的试剂盒检测的建立

1、一种伊氏锥虫检测试剂盒，所述试剂盒中含有以下各试剂：引物pag3-f和引物pag3-r，伊氏锥虫阳性对照，easytaqdnapolymerase，10×easytaqbuffer，dntps和灭菌双蒸水；

pag3-f和pag3-r的引物序列如下：

上游引物pag3-f：5’-gtttgacaccgtggagtt-3’（seqidno.1）；

下游引物pag3-r：5’-aacagccacaaacaaccc-3’（seqidno.2）。

2、所述试剂盒的使用方法如下：

以待测样品dna或血液为模板，利用pag3-f和pag3-r为引物进行pcr扩增反应。

pcr扩增反应体系为：引物pag3-f和引物pag3-r、100ng样品dna或5μl样品血液溶解液，2.5unitseasytaqdnapolymerase，10×easytaqbuffer(1×)、0.2mmdntps、灭菌双蒸水补齐至25μl，引物pag3-f和引物pag3-r在反应体系中的终浓度分别为0.2μm。

具体pcr扩增反应体系为：100ng/μldna1μl或血液溶解液5μl，10μmpag3-f0.5μl，10μmpag3-r0.5μl，10×easytaqbuffer2.5μl，2.5mmdntps2μl，5units/μleasytaqdnapolymerase0.5μl，灭菌双蒸水补充至25μl。

所述pcr扩增反应条件为：94℃3min；94℃30s，65℃10s.共30个反应循环；

扩增结束后，电泳检测，若扩增出单一250bp大小的条带，则待测样品中含有伊氏锥虫，反之则待测样品中没有伊氏锥虫。

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<110>中山大学

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