利用微流控SNP芯片检测绵羊FecB基因多态性的方法与流程

本发明涉及分子标记检测技术，具体地说，涉及一种微流控snp芯片检测绵羊fecb基因多态性的方法。

背景技术：

家畜的产仔数是经济价值十分巨大的数量性状。对绵羊产羔数的选择不仅受到性别和年龄的限制，而且绵羊的产羔数是一个遗传力很低的数量性状，因此难以用常规的育种技术来改良产羔数性状。标记辅助选择能够通过影响选择的时间、选择的强度和准确性而极大地提高这类低遗传力性状的选择功效，而找到与这些数量性状基因座相连锁的分子遗传标记，则是实现标记辅助选择的先决条件。

上世纪50年代，seears兄弟选育出一群可以生多胞胎的澳大利亚美利奴(booroolamerino,bm)，并报道这种产多胞胎的美利奴绵羊比其他群体的美利奴绵羊产羔数提高了30％。该基因已被绵羊和山羊遗传命名委员会定名为fecb(fecunditybooroola)。montgomery等用遗传连锁和微卫星标记定位的方法将fecb基因定位于booroola羊的第6号常染色体上。最终研究者发现绵羊fecb的影响是由于骨形态发生蛋白受体1b(bonemorphogeneticproteinreceptor1b,bmpr1b)基因编码区发生了a746g突变，从而引起第249位氨基酸由谷氨酰胺变为精氨酸(q249r)。1个fec^b拷贝增加排卵数1.3-1.6枚，母羊产羔数增加0.9-1.2只；2个fec^b拷贝增加排卵数2.7-3.0枚，母羊产羔数增加1.1-1.7只。

由于fecb基因能提高绵羊繁殖力，可带来巨大的经济利益，因此各地展开了对不同绵羊品种fecb基因检测。目前研究表明fecb突变存在于世界各地各种高繁殖力绵羊品种中。我国的湖羊和小尾寒羊均携带此突变。传统的fecb基因检测方法，大多采用pcr-rflp(polymerasechainreaction-restrictionfragmentlengthpolymorphism)和pcr-sscp(polymerasechainreaction-singlestrandconformationpolymorphism)检测方法，这些方法通量较低，程序繁多，较难实现高通量自动化测定。目前新开发出的taqmanmgb以及snapshot这些高通量分型技术，可以实现fecb基因的快速准确的高通量分型，但是存在成本偏高的问题。

单核苷酸多态性标记(snp)主要是指在基因组脱氧核酸(dna)序列上由单个脱氧核苷酸的变异所引起的dna片段的多态性。snp的多态性仅涉及到单个碱基的变异，表现的形式有替换、插入和缺失等。snp的检测方法，目前常用的包括，sanger测序、dna芯片、飞行时间质谱、以及最新的高通量二代测序等技术。通过检测单核苷酸多态性标记检测基因型是近些年兴起的一种方法。snp作为遗传标记已经广泛地应用于基因定位、克隆、遗传育种以及遗传多样性等研究领域。分子标记在动物育种中的应用已有一段时间，相比传统育种方法，分子育种大大加快了选育效率，节省了育种时间，使得育种学家可以在分子水平上不断探索并选育更优良的家畜品种。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种利用微流控snp芯片检测绵羊fecb基因多态性的方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种检测绵羊多胎主效基因fecb基因型的方法，其是对绵羊第6号染色体上第29382188bp位点(nc_019463.1，基于绵羊基因组序列信息版本号oar_v3.1，2012年12月)的核苷酸进行单核苷酸多态性检测，根据检测结果判定绵羊fecb基因为aa、ag或gg。本发明中单核苷酸多态性检测所采用的方法为微流控snp芯片法。

本发明首先提供一种利用微流控snp芯片检测绵羊fecb基因多态性的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测绵羊的基因组dna；

(2)以待测绵羊的基因组dna为模板，利用引物探针组合，进行普通pcr反应；所述引物探针组合含有一对引物和2条探针，

所述引物的核苷酸序列如下：

正向引物：5’-ccagctggttccgagagaca-3’

反向引物：5’-cttatactcacccaagatgttttcatg-3’

所述探针的核苷酸序列如下：

p-g：5’-f1-aaatatatcggacggtgtt-mgb-3’

p-a：5’-f2-aaatatatcagacggtgttg-mgb-3’

其中，f1和f2为不同颜色的荧光报告基团；

(3)pcr仪运行停止后，取出芯片，将芯片放入luxscan-10k/d扫描仪，进行荧光扫描。

步骤(2)中f1为fam，f2为hex。

步骤(2)中普通pcr反应使用的扩增体系以1μl，即为：基因组dna0.2μl，2×mastermix0.5μl，10μmol/l正向引物0.05μl，10μmol/l反向引物0.05μl；10μmol/l探针p-g0.025μl，10μmol/l探针p-a0.025μl，去离子水补齐至1μl。

步骤(2)中普通pcr反应的扩增程序为：95℃10min；95℃15sec，60℃1min，共40个循环；37℃1min。

本发明提供了上述方法在绵羊分子标记辅助育种中的应用。

本发明提供了上述方法在选育繁殖力高的绵羊品种中的应用。

本发明提供了上述方法在绵羊种质资源改良中的应用。

本发明还提供一种引物探针组合，含有一对引物和2条探针，

所述引物的核苷酸序列如下：

正向引物：5’-ccagctggttccgagagaca-3’

反向引物：5’-cttatactcacccaagatgttttcatg-3’

所述探针的核苷酸序列如下：

p-g：5’-f1-aaatatatcggacggtgtt-mgb-3’

p-a：5’-f2-aaatatatcagacggtgttg-mgb-3’

其中，f1和f2为不同颜色的荧光报告基团。

本发明提供了上述引物探针组合在利用微流控snp芯片技术检测绵羊fecb基因多态性中的应用，

本发明提供了上述引物探针组合在利用微流控snp芯片技术筛选高繁殖力绵羊品种中的应用。

本发明提供了上述引物探针组合在利用微流控snp芯片技术在改良绵羊种质资源中的应用。

微流控snp芯片是通过把生物样品的反应和检测等基本操作单元集成到一块小型芯片上，基于微流控管道的方式，轻松完成snp分型的全过程。其含有进/出样孔、进样管道、反应孔三部分，可实现每个反应孔形成一个独立的pcr体系，具有试剂消耗小、反应速度快、检测灵活、对实验室无污染等优点。

本发明提供的利用微流控snp芯片检测绵羊fecb基因多态性的方法，能高通量检测a、g位点，结果容易判读。与传统的pcr-rflp检测fecb基因等方法相比，减少了手动操作过程，并在简化操作的同时，大大缩短了检测周期，提高了检测效率。同时微流控snp芯片方法反应体系降低到1μl，对探针的消耗量大幅降低，显著降低了试剂成本。本发明使用的引物和探针特异性强，不会受到其他基因的干扰，降低了pcr产物污染引起假阳性的风险，并且结果判读更容易。可对fecb基因的snp位点实现高通量检测，在对羊进行大规模分子育种中具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1中利用微流控snp芯片法用第1组的引物探针组合对fecb基因的三种基因型，即gg、aa和ag的检测结果。

图2为本发明实施例1中第2组的引物探针组合对fecb基因的三种基因型的分型检测结果。

图3为本发明实施例1中第3组的引物探针组合对fecb基因的三种基因型的分型检测结果。

图4为本发明实施例1中第4组的引物探针组合对fecb基因的三种基因型的分型检测结果。

图5为本发明实施例1中第5组的引物探针组合对fecb基因的三种基因型的分型检测结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件。

实施例1针对绵羊fecb基因snp位点的检测引物和探针的设计

针对绵羊第6号染色体上第29382188bp位点(nc_019463.1，基于绵羊基因组序列信息版本号oar_v3.1，2012年12月)的核苷酸进行单核苷酸多态性a/g，设计了以下引物和探针组合，采用微流控snp芯片检测绵羊fecb基因多态性。

通过对fecb基因的多态性位点序列共设计了5对引物和探针，在探针的5’分别标记不同颜色的荧光报告基团。

所述引物1的核苷酸序列如下：

正向引物：5’-ccagctggttccgagagaca-3’

反向引物：5’-cttatactcacccaagatgttttcatg-3’

所述探针1的核苷酸序列如下：

p-g：5’-fam-aaatatatcggacggtgtt-mgb-3’

p-a：5’-hex-aaatatatcagacggtgttg-mgb-3’

所述引物2的核苷酸序列如下：

正向引物：5’-ctaatacagacttatactcacccaagatgt-3’

反向引物：5’-ttcactacagaggaggccagct-3’

所述探针2的核苷酸序列如下：

p-g：5’-fam-catgcctcatcaacaccgtccgatatattt-mgb-3’

p-a：5’-hex-tcatgcctcatcaacaccgtctgatatatttc-mgb-3’

所述引物3的核苷酸序列如下：

正向引物：5’-cacccaagatgttttcatgcct-3’

反向引物：5’-tacagaggaggccagctggtt-3’

所述探针3的核苷酸序列如下：

p-g：5’-fam-cgagagacagaaatatatcagacggtgttga-mgb-3’

p-a：5’-hex-cgagagacagaaatatatcggacggtgtt-mgb-3’

所述引物4的核苷酸序列如下：

正向引物：5’-ctgaacatcnctaatacagacttatactca-3’

反向引物：5’-cttcactacagaggaggccagct-3’

所述探针4的核苷酸序列如下：

p-g：5’-fam-ttttcatgcctcatcaacaccgtccgatata-mgb-3’

p-a：5’-hex-tgttttcatgcctcatcaacaccgtctgata-mgb-3’

所述引物5的核苷酸序列如下：

正向引物：5’-cccaagatgttttcatgcctca-3’

反向引物：5’-ctgtgaaagtgttcttcactacagagga-3’

所述探针5的核苷酸序列如下：

p-g：5’-fam-tggttccgagagacagaaatatatcggacg-mgb-3’

p-a：5’-hex-tggttccgagagacagaaatatatcagacgg-mgb-3’

经过对上述五种引物和探针进行实验测试，结果发现，第1组的引物和探针表现最佳。从图1的分型散点图可以看到，第1组的散点分布可以将三种基因型aa\ag\gg很清晰的分开，有较好的区分度。通过第2组、第3组、第4组和第5组的引物、探针进行实验发现其检测特异性均不如第1组，从图2，图3，图4和图5的分型散点图可以看到，除第1组外的其它四组对不同样本的三种基因型的区分界限不显著，会造成分型结果误判。

实施例2利用微流控snp芯片检测绵羊fecb基因多态性的方法

1、实验材料选取以小尾寒羊为母本、其它品种为父本杂交产生的共95只绵羊为检测对象。

2、基因组dna的提取绵羊颈静脉采血1ml，用edta抗凝处理。首先红细胞裂解液裂解去除不含dna的红细胞，细胞核裂解液裂解包细胞释放出基因组dna，然后蛋白沉淀液选择性沉淀去除蛋白，纯净的基因组dna通过异丙醇沉淀并重溶解于dna溶解液。

3、微流控snp芯片进行基因分型

选用实施例1筛选得到的针对绵羊第6号染色体上第29382188bp位点(nc_019463.1，基于绵羊基因组序列信息版本号oar_v3.1，2012年12月)的最佳检测引物及探针进行检测。

所述引物的核苷酸序列如下：

正向引物：5’-ccagctggttccgagagaca-3’

反向引物：5’-cttatactcacccaagatgttttcatg-3’

所述探针的核苷酸序列如下：

p-g：5’-fam-aaatatatcggacggtgtt-mgb-3’

p-a：5’-hex-aaatatatcagacggtgttg-mgb-3’

引物和探针由英潍捷基公司合成，universalmastermix购自abi公司，利用北京博奥晶典生物技术有限公司的微流控snp芯片检测系统进行分型实验。反应体系：以提取的基因组dna为模板，以上述合成的探针在微流控snp芯片检测系统中进行以下扩增(1μl反应体系)：dna0.2μl，2×mastermix0.5μl，10μmol/l正向引物0.05μl，10μmol/l反向引物0.0.05μl；10μmol/l探针p-g0.025μl，10μmol/l探针p-a0.025μl，去离子水补至1μl。具体步骤如下：

(1)按基因组dna按顺序分别加在芯片孔中，等待晾干。

(2)使用压膜机将芯片和膜压紧，从芯片注样口将反应mix从弯道注入，用封口膜将注样孔密封。

(3)将密封好的芯片，放入离心机，4000rpm，1min。

(4)将芯片放入平板pcr仪，按着前面设定的pcr反应程序，进行扩增。

(5)pcr仪运行停止后，取出芯片，将芯片放入luxscan-10k/d扫描仪，进行扫描。

4.分析结果通过luxscan-10k/d扫描仪扫描生成tif文件，并将荧光信号转换成数据字信号值。然后将上述数字信号输入到snptyper软件中，运行软件后，可实现snp分型。结果见表1。

5.统计结果

表1待测绵羊第6号染色体29382188位点不同基因型分析统计

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

sequencelisting

<110>中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京博奥晶典生物技术有限公司

<120>利用微流控snp芯片检测绵羊fecb基因多态性的方法

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