本发明涉及snp标记及其应用。具体地，本发明涉及吉富罗非鱼生长速度相关的snp标记，用于检测前述snp标记的引物对和试剂盒，前述snp标记、引物对、试剂盒在吉富罗非鱼选育中的用途，以及检测吉富罗非鱼生长速度的方法。
背景技术：
罗非鱼属鲈形目、丽鱼科、罗非鱼属，为广盐性热带鱼类，已被联合国粮农组织fao列为人类六大主要食品之一。目前，罗非鱼养殖已遍布全球80余个国家和地区，成为世界性养殖鱼类。二十世纪九十年代以来，我国罗非鱼产业保持持续发展的良好态势，2016年，全球的罗非鱼产量为555万吨，其中，中国的罗非鱼产量为172万吨左右，占全球总产量的31％。然而，我国罗非鱼优良品种的选育工作起步较晚，罗非鱼优良品种供应严重不足。在罗非鱼育种方法上，以传统的性别控制、表型选育技术等为主，缺乏有效的种质鉴别技术、制种和保种机制，加之罗非鱼属内中间杂交容易，导致出现了种质退化、品种混杂、杂交子一代雄性率不高等现象，致使罗非鱼苗种经济性状衰退，从而影响产量的提高和产业的市场竞争力，制约罗非鱼产业的持续健康发展。
传统的鱼类选育方法完全依赖于表型，存在周期长和效率低等无法逾越的障碍。分子育种，即分子标记辅助选择育种，是指利用dna分子标记对育种材料进行选择，综合改良选育物种的重要经济性状，是传统遗传育种与现代分子生物学有机结合的育种方法。分子育种为鱼类育种开辟了一条新的途径，随着现代生物技术的发展，分子标记在鱼类育种中的作用将日益突出。在罗非鱼的育种中，人们希望通过对于生长性状密切相关，并且与数量性状紧密连锁的dna标记的选择，以实现早期选种和提高育种准确性的目标，从而取得更大的遗传进展。
然而，现阶段能够有效用于罗非鱼育种的生长性状相关的分子标记仍有待挖掘。
技术实现要素：
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种与石斑鱼生长性状相关，能够有效用于石斑鱼选育的snp标记。
其中，需要说明的是，snp(singlenucleotidepolymorphism,snp，即单核苷酸多态性)是1996年由美国麻省理工学院的人类基因组研究中心学者lander提出的一类分子遗传标记，主要是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的dna序列多态性。snp表现出的多态性仅涉及到单个碱基的变异，表现是有转换、颠换、插入和缺失等。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种吉富罗非鱼生长速度相关的snp标记。根据本发明的实施例，该snp标记为seqidno：1所示核苷酸序列(全长1001bp)自5’端起第501位碱基以y表示，y代表g或t。根据本发明的实施例，seqidno：1所示核苷酸序列如下：
acatgcacgcacacacacacacacacacacacacacacacacacacacagcttggcctcacaattatgttatgttacgtgctgatcttggacctgagctgcagtccacaaacacacacagataacactaggtgtgaggatgaagtgttttcaaacttagtccttgtggagttaataaccactacctgcctaactcctatcttgatttttttggcctcttgtgtgaagcagaacaagctgtgaactcgactttattatagcttaaaaactacagtagcattcatatggagttgtgcatctggccaccagacgaatgtgaaggccttggtatgttcagctgaagtttaaactttctgatgtcaaattggagggggagccttatccgacaatttctgtaacttttcaaaatgaaagattcaattgatcatcttttctaaagctctcttttttcgtcatttccacaactatgggcagaagcagtgcagataaaagcagaaagytgtaatattgaatacatacagtctcgaaaagggactgcggcaggaaatggcctgcagccagtttggcttgacttcaggtcagtgagatacctttactatatttccacataccattgttagccttaaggtgtgtaggtttgcctctttcaatctattattttcttgacaaagaggaaaaacatacttgattctggaattatttcacttgtttcctcattttgctgaaattgacctttctgatcctgtttctctttgctttttgacacttcttgagaatttcagatgaagttcaactgcagtggaaacaagaggggctttccaattggcaagatgattcactcgctgtgaacaaaaaaaaaatagaagtggaattgtaagacagtttttgactaagatggatgcacacacaacagtttgtgtctcagtaggataccgatgtaatccaacatttcctgactgcagtttttcccctgtaatctatcaaactgaggctgtagtgt(seqidno：1)。
发明人发现，该位点处基因型为杂合gt的吉富罗非鱼的体重显著高于此处基因型为纯合tt的吉富罗非鱼。进而，根据本发明的实施例，通过检测吉富罗非鱼的上述snp，能够有效地确定其生长速度，具体地，如前所述，该snp位点为杂合gt的吉富罗非鱼的体重显著高于此处基因型为纯合tt的吉富罗非鱼，例如该snp位点的基因型为gt时，则能够确定待测吉富罗非鱼的属于生长速度快的个体。由此，发明人确定，本发明的snp标记与吉富罗非鱼的生长速度紧密相关，能够有效用于吉富罗非鱼的分子标记辅助育种。进而能够根据实际育种需求选择生长速度对吉富罗非鱼育种材料进行早期选择，进一步能够有效提高育种的效率和准确性，提高吉富罗非鱼繁殖群体的遗传水平，从而能够准确、高效地选育出吉富罗非鱼优良品种。此外，根据本发明的一些实施例，利用本发明的snp标记进行吉富罗非鱼分子标记辅助育种，具有早期筛选、节省时间、成本低廉、准确性高的优点。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种用于检测前面所述的本发明的snp标记的引物对。根据本发明的实施例，所述引物对具有seqidno：2-3所示的核苷酸序列。具体地，本发明的引物对的序列如下所示：
上游引物：5’-cattcatatggagttgtgcatct-3’(seqidno：2)；
下游引物：5’-gaaagaggcaaacctcacacctt-3’(seqidno：3)。
根据本发明的实施例，利用本发明的引物对能够有效地对待测吉富罗非鱼的上述与生长速度相关的snp标记所在的片段进行pcr扩增，进而通过测序能够有效实现对该snp标记的检测，确定待测吉富罗非鱼该snp标记位点的基因型，进而能够有效确定待测吉富罗非鱼的生长速度。具体地，该snp标记位点处基因型为杂合gt的吉富罗非鱼的生长速度显著高于此处基因型为纯合tt的吉富罗非鱼，例如该snp位点的基因型为tt或at时，则能够确定待测吉富罗非鱼的属于生长速度快的个体。由此，用于检测前面所述的本发明的snp标记的引物对，能够有效用于吉富罗非鱼的分子标记辅助育种，进而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育吉富罗非鱼优良品种。
根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种用于检测前面所述的snp标记的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包含：前面所述的用于检测本发明的snp标记的引物对。即本发明的试剂盒中包含具有seqidno：2-3所示的核苷酸序列的引物对。根据本发明的实施例，利用本发明的试剂盒中所包含的引物对，能够有效实现对待测吉富罗非鱼的上述与生长速度相关的snp标记的多态性检测，确定待测吉富罗非鱼该snp标记位点的基因型，进而能够有效确定待测吉富罗非鱼的生长速度。具体地，该snp标记位点处基因型为杂合gt的吉富罗非鱼的生长速度显著高于此处基因型为纯合tt的吉富罗非鱼，例如该snp位点的基因型为gt时，则能够确定待测吉富罗非鱼属于生长速度快的个体。由此，本发明的用于检测前面所述的本发明的snp标记的试剂盒，能够有效用于吉富罗非鱼的分子标记辅助育种，进而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育吉富罗非鱼优良品种。
根据本发明的再一方面，本发明还提供了前面所述的本发明的snp标记、引物对或试剂盒，在吉富罗非鱼选育中的用途。如前所述，通过能够用于检测本发明的与吉富罗非鱼生长速度相关的snp标记的试剂例如前述的引物对或包含该引物对的试剂盒等，能够有效地检测确定待测吉富罗非鱼的上述snp标记的基因型，进而基于获得的基因型能够有效确定待测吉富罗非鱼的生长速度，从而能够有效辅助吉富罗非鱼选育。
进而，根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种检测吉富罗非鱼生长速度的方法。根据本发明的实施例，该方法通过对待测吉富罗非鱼进行前面所述的snp标记的检测，确定所述待测吉富罗非鱼的生长速度。具体地，可以通过能够用于检测本发明的与吉富罗非鱼生长速度相关的snp标记的试剂例如前述的引物对或包含该引物对的试剂盒等，对待测吉富罗非鱼进行pcr扩增、测序，以便检测确定待测吉富罗非鱼的上述snp标记的基因型，进而基于获得的基因型能够有效确定待测吉富罗非鱼的生长速度。其中，如前所述，该snp标记位点处基因型为杂合gt的吉富罗非鱼的生长速度显著高于此处基因型为纯合tt的吉富罗非鱼，例如当该snp位点的基因型为gt时，则待测吉富罗非鱼的属于生长速度快的个体。由此，本发明的检测吉富罗非鱼生长速度的方法，能够快速、高效、准确地检测吉富罗非鱼生长速度，进而能够有效用于吉富罗非鱼的分子标记辅助育种，从而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育吉富罗非鱼优良品种。
另外，根据本发明上述实施例的检测吉富罗非鱼生长速度的方法还可以具有如下附加的技术特征：
根据本发明的实施例，对待测吉富罗非鱼进行snp标记检测的方法不受特别限制。测序、单链构象多态性聚合酶链式反应(pcrsinglestrandconformationpolymorphism，pcr-sscp)、限制性片段长度多态性聚合酶链式反应(pcr-restritcionfragmentlengthpolymorphism，pcr-rflp)及飞行时间质谱等技术均可以实现snp的检测。其中，测序是一种准确性最高、灵活性强，通量大、检测周期短的检测技术。只需在snp位点的两侧设计一对引物，扩增200-1000bp的产物，再通过测序即可直接检测snp位点的基因型。因而，本发明采用测序的方法进行snp标记检测。根据本发明的一些具体示例，通过对待测吉富罗非鱼进行前面所述的snp标记的检测，确定所述待测吉富罗非鱼的生长速度，进一步包括：提取待测吉富罗非鱼的基因组dna；利用前面所述的引物对，将所述待测吉富罗非鱼的基因组dna进行pcr扩增，以便获得pcr扩增产物；对所述pcr扩增产物进行测序，以便获得测序结果；基于所述测序结果，确定所述待测吉富罗非鱼的所述snp标记的基因型；以及基于所述待测吉富罗非鱼的所述snp标记的基因型，确定所述待测吉富罗非鱼的生长速度。由此，能够有效提高检测吉富罗非鱼生长速度的效率。
根据本发明的实施例，提取待测吉富罗非鱼的基因组dna的方法不受特别限制，可以采用任何已知的基因组dna提取方法或试剂盒进行。根据本发明的一些具体示例，采用常规酚氯仿方法抽提待测吉富罗非鱼的基因组dna。由此，能够有效获得质量好、纯度高的基因组dna，便于后续步骤进行。
根据本发明的实施例，将所述待测吉富罗非鱼的基因组dna进行pcr扩增的条件不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，该pcr扩增的扩增体系以25μl计为：50-100ng/μl的模板dna1μl，10pmol/μl的seqidno：2-3所示的上下游引物各1μl，10mmol/l的dntpmix2.0μl，5u/μl的taqdna聚合酶0.125μl，10×pcr反应缓冲液2.5μl，余量为双蒸水；该pcr扩增的反应条件为：94℃5分钟；94℃30秒，53℃30秒，72℃30秒，30个循环；72℃5分钟。由此，能够快速、高效、准确地扩增本发明的snp标记所在的片段，获得目标扩增产物，便于后续步骤的进行。
根据本发明的实施例，对所述pcr扩增产物进行测序的方法不受特别限制，只要能够有效获得pcr扩增产物即snp标记所在的片段的序列即可。根据本发明的一些具体示例，可以采用选自hiseq和单分子测序方法的至少一种对所述pcr扩增产物进行测序。由此，能够高通量、快速、高效、准确地获得测序结果。
根据本发明的实施例，基于测序结果，通过比对石斑鱼参考基因组序列，能够有效确定待测吉富罗非鱼的所述snp标记的基因型为tt还是gt。
根据本发明的实施例，所述snp标记的gt基因型个体的生长速度显著高于tt或gg基因型个体。即本发明前面所述的snp标记与吉富罗非鱼的生长速度紧密相关。由此，基于确定的待测吉富罗非鱼的该snp标记的基因型，能够准确有效地确定待测吉富罗非鱼的生长速度即生长速度性状，例如该snp位点的基因型为gt时，则待测吉富罗非鱼的属于生长速度快的个体。进而本发明的方法能够有效用于吉富罗非鱼的分子标记辅助育种，从而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育吉富罗非鱼优良品种。
需要说明的是，本发明的与吉富罗非鱼生长速度相关的snp标记及其应用具有如下优点：
(1)本发明提供的snp标记不受吉富罗非鱼的年龄、性别等限制，可用于吉富罗非鱼的早期选育，可显著促进吉富罗非鱼的育种进程；
(2)检测吉富罗非鱼如seqidno.1所示自5’端起第501位snp位点的方法，准确可靠，操作方便；
(3)吉富罗非鱼如seqidno.1所示自5’端起第501位的snp位点的检出，为吉富罗非鱼生长性状的标记辅助选择提供了科学依据。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
除非特殊说明，本发明所用术语具有本发明所属领域中的一般含义。
下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1与吉富罗非鱼生长速度相关的snp标记的获得
1.1吉富罗非鱼群体的获得
所采用的群体为海南华大海洋科技有限公司养殖场2016年4月10日孵化的吉富罗非鱼，2016年4月20日，20,000尾鱼苗被转移至一个网箱继续饲养。2016年10月8日，从该网箱随机选出500个个体，剪取鱼体背鳍鳍条于95％乙醇-20℃保存，用于基因组dna提取。
1.2吉富罗非鱼基因组dna提取
本试验采用常规酚氯仿方法抽提吉富罗非鱼鳍条中的基因组dna，具体步骤如下：
(1)取0.3～0.5g鳍条于1.5mleppendorf管中，剪碎，在超净工作台上开盖干燥20min；
(2)待乙醇基本挥发后，te缓冲液(10mmol/mltris、1mmol/mledta、sds5％，ph＝8.0)洗涤1～2次，再加入600μldna抽提液(0.001mol/ltris-cl、0.1mol/ledta、sds5％，ph＝8.0)和3μl蛋白酶k(200mg/ml)，55℃水浴消化3h左右，前30min每10min轻摇离心管1次，消化至管内液体澄清；
(3)加入自配酚氯仿溶液(酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1)600μl，轻轻来回颠倒离心管10min，12000r离心10min。取上层水相用等体积上述酚氯仿再抽提，直至水相与有机相之间没有白色沉淀；
(4)再用氯仿抽提1次，取出上清液，加入2倍体积已预冷的无水乙醇沉淀dna，颠倒混匀，4℃静置30min，12000r离心10min，沉淀再用70％乙醇洗涤，离心晾干沉淀后加50μl无菌水溶解。4℃保存备用或-20℃长期保存。
1.3构建简化基因组测序(restrictionsiteassociateddnasequencing，rad-seq)文库并测序获得吉富罗非鱼体重相关的snp标记
基于hiseq2500高通量测序平台，采用rad简化基因组测序方法对500个个体的dna样本进行测序，每个个体产生1g左右的数据量，平均覆盖1x的吉富罗非鱼基因组。同时还对这500个个体进行体重等生长性状表型鉴定。采用plink软件对数据进行处理筛选处理，然后使用基于混合线性模型的emmax软件进行gwas分析，从234,386个snp中找到了一个与体重显著相关的snp位点。该snp位点位于seqidno.1所示序列的501bp位点处，在seqidno.1序列中用y表示该处位点，且此处位点的碱基为g或t。该位点处基因型为杂合gt的吉富罗非鱼的体重显著高于此处基因型为纯合tt的吉富罗非鱼。
实施例2与吉富罗非鱼生长速度相关的snp标记的测序验证与应用
2.1提取待测吉富罗非鱼鳍条中的基因组dna
待测吉富罗非鱼来自实施例1中的吉富罗非鱼群体，重新随机选取了200尾鱼，按照实施例1中所述的dna提取方法抽提基因组dna。
2.2扩增含snp位点的核苷酸片段
以前述提取获得的各待测吉富罗非鱼的基因组dna为模板，利用正向引物f：5’-cattcatatggagttgtgcatct-3’(seqidno：2)和反向引物r：5’-gaaagaggcaaacctcacacctt-3’(seqidno：3)，扩增出待测snp所在的核苷酸片段。其中，pcr反应体系以25μl计为：50-100ng/μl模板dna1μl，10pmol/μl引物f和r各1μl，10mmol/ldntpmix2.0μl，5u/μltaqdna聚合酶0.125μl，10×pcr反应缓冲液2.5μl，余量为双蒸水；pcr反应条件为：94℃5分钟；94℃30秒，53℃30秒，72℃30秒，30个循环；72℃5分钟。
2.3测序识别snp位点基因型
将上述步骤中获得的各pcr扩增产物于abi3730测序仪上进行单向测序，识别seqidno：1序列中501bp处(即本发明的snp标记)的基因型。其中，200尾待测吉富罗非鱼个体该snp位点的基因型及其体重如下表1所示。
表1200个个体该snp位点的基因型及其体重
2.4snp位点基因型与生长速度的关联分析
基于表1的结果，利用sas9.0软件mixed程序进行线性模拟分析snp位点的基因型与生长速度的关联性，其中分析时以个体体重代表表型值，采用的模型如下：
yijk＝μ+gi+aj+eijk。
其中，yijk为个体体重值，μ群体体重均值，gi为基因型效应向量，aj为微效多基因向量，eijk为随机残差效应向量。
snp位点的基因型与生长速度的关联分析结果见下表2。
表2snp位点的基因型频率及与体重的关联分析
由表2可知，gt杂合型个体体重均值比tt纯合型个体体重均值大。
表2所示的关联分析结果表明，gt基因型个体体重的均值与tt或gg基因型个体体重的均值的差异达极显著性水平(p<0.01)。进而，证明seqidno：1所示核苷酸序列自5’端起第501位碱基g或t，与吉富罗非鱼生长速度显著相关，为吉富罗非鱼生长速度相关的snp标记，该snp标记的gt基因型个体的生长速度显著高于tt或gg基因型个体。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
sequencelisting
<110>海南华大海洋科技有限公司
<120>一个与吉富罗非鱼生长速度相关的snp标记及其应用
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ataacactaggtgtgaggatgaagtgttttcaaacttagtccttgtggagttaataacca180
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