样品被判定为阴性，即阴性读数认定标准为:样品平均〇〇值< 阴性对照平均0D值。
[0050] 本发明的有益效果：
[0051] 通过酶联免疫标记技术来研究迀飞昆虫的迀出规律和迀入种群的再迀飞规律将 是一种行之有效的方法，该方法操作简单，结果精确，成本低廉。通过对大田当地迀飞种群 和外地迀入种群先后喷洒两种标记蛋白，检测带有不同标记蛋白的迀飞昆虫数量，以明确 当地迀飞昆虫的迀出规律以及迀入种群的再迀飞规律，进而指导农业迀飞性昆虫的预测预 报及其防控。
【附图说明】
[0052]图1为苜蓿草中集栖瓢虫迀入种群单一及双重标记比例。
【具体实施方式】
[0053]以下通过实验案例来进一步说明本发明的有益效果：
[0054]实验案例:本地种群迀出规律和迀入种群的再迀飞规律
[0055] 该试验分别于2010年和2011年在山东省德州市宁津县实验基地进行了两年。具体 步骤如下：
[0056] (1)实验昆虫的选择:集栖瓢虫，幼虫、成虫均以蚜虫为主要食物源，成虫为越夏迀 飞型；
[0057]实验植物的选择:苜蓿为多年生开花植物，是重要的青贮饲料，同样也是有益昆虫 重要的庇护所，特别是自然天敌，例如集栖瓢虫；
[0058]实验田选择与设置：实验地点位于山东省德州市宁津县。试验田种植面积为 2160m2(180mX12m)。试验田划分为均等3个实验区（6〇1^12111)。2010年，每个实验区设置4 个同等面积的样本区（60mX0.508m)，即总共取样12次;2011年，每个实验区设置3个同等面 积的样本区（60m X 0.508m)，即总共取样9次；
[0059] (2)蛋白标记物的选择与制备:选择蛋清蛋白标记物为第一种蛋白标记物，脱脂奶 粉标记物为第二种蛋白标记物；（标记物的配置方法详见附录2)
[0060] (3)当地种群集栖瓢虫密度调查:结合往年集栖瓢虫田间种群动态规律，对每个样 本区划出面积相等的取样区（6mX0.508m = 0.003095ha;即样本每公顷的转换系数为 322.80)，进行大田普查(居留型）与诱虫灯诱捕(迀出型），明确苜蓿田集栖瓢虫当地种群的 规模和数量；
[0061] (4)第一种蛋白标记物的喷洒(285L/公顷）与目的昆虫捕获:选择在集栖瓢虫当地 种群高密度时期，将现配置的蛋清蛋白标记物装入到喷雾器在实验田中喷洒，喷洒均匀； 24h后，通过电动吸虫器和诱虫灯分别捕获居留型和迀出型的集栖瓢虫，然后将捕获的居留 型和迀出型的集栖瓢虫个体分别放在1.5mL微量离心管中，-20°C保存；
[0062] (5)第二种蛋白标记物的喷洒(285L/公顷）与目的昆虫捕获:结合对迀入种群往年 迀入高峰期的分析进行预判，并利用田间诱虫灯每日对迀入种群迀入情况的实时监测，于 目的昆虫迀入高峰当天均匀喷洒脱脂奶粉标记物;24h后，通过电动吸虫器和诱虫灯分别捕 获居留型和迀出型的集栖瓢虫，然后将捕获的居留型和迀出型的集栖瓢虫个体放在1.5mL 微量离心管中，_20°C保存；
[0063] (6)集栖瓢虫当地种群的迀出行为规律及迀入种群的再迀飞行为规律研究：通过 酶联免疫吸附法(见附录1)分别检测步骤(4)和步骤(5)所捕获的目的昆虫所携带的标记蛋 白种类和数量，以明确当地种群的迀出行为规律和迀入种群的再迀飞规律。
[0064] I在调查集栖瓢虫当地种群期间只是用蛋清蛋白进行标记，捕获的迀出型目的昆 虫中呈蛋清蛋白阳性的即为有迀飞行为的当地种群：
[0065] 当地种群迀飞比例=迀出型蛋清蛋白阳性种群数量/(迀出型蛋清蛋白阳性种群 数量+居留型蛋清蛋白阳性种群数量）；
[0066] n在调查集栖瓢虫迀入种群中利用蛋清蛋白和脱脂奶粉双重蛋白标记，捕获的迀 出型目的昆虫中只有呈脱脂奶粉阳性的即为有再迀飞行为的迀入种群：
[0067] 迀入种群再迀飞比例=(迀出型脱脂奶粉阳性种群数量-迀出型双重阳性种群数 量)/(迀出型脱脂奶粉阳性种群数量+居留型脱脂奶粉阳性种群数量-迀出型双重阳性种群 数量-居留型双重阳性种群数量）。
[0068] 结果如下:两年的调查数据表明，栖息于苜蓿草的集栖瓢虫种群以居留型为主，种 群迀出比例在2010年和2011年分别占带标记瓢虫总捕获量的8%和32%，2011年迀出比例 稍有增加(表1)。
[0069] 表1苜蓿草中集栖瓢虫当地种群迀飞比例（山东德州宁津县）
[0071] 样本每公顷的转换系数为322.80(6m X 0.508m)
[0072] 在2010年和2011年集栖瓢虫迀入种群迀入高峰期，对瓢虫捕获情况的统计结果显 示，集栖瓢虫迀出种群呈脱脂奶粉阳性的比例为71%和79%，其中呈蛋清蛋白阳性的双重 阳性样本为当地种群，分别占带标记昆虫总捕获量的6%和5% (表2)，因此迀入种群在两年 间的再迀飞性比例分别为75%和84%，表明迀入种群在找到最适居住地前仍是以迀飞为 主，即迀飞种群有很强的再迀飞能力，但迀入种群两年中均有近1/5的种群停留取食（图1)。 结果说明迀飞途中的集栖瓢虫在到达目的地前仍是以迀飞为主，但也有较大比例种群选择 停留。
[0073]表2苜蓿草集栖瓢虫迀入种群捕获种群的标记类型及比例（山东德州宁津县）
[0076] 样本每公顷的转换系数为322 ? 80(6m X 0 ? 508m)
[0077]附录1酶联免疫吸附法
[0078] A实验中所用的试剂以及配置要求见附录2。
[0079] B采用脱脂奶粉作为标记物
[0080] (1)捕获的目的昆虫分别放在1.5ml的微量离心管中，小心处理，以防止交叉污染。 每一个离心管中加入750y 1 TBS缓冲溶液，置于恒温摇床27 °C，lOOrpm，清洗lh，取上清液移 至新1.5ml离心管；
[0081] (2)获得的上清液即为抗原样品（浸泡昆虫的TBS缓冲液），取80yl样品加入到96孔 微量滴定板中（每个样品均加3个孔，即进行3次技术重复），然后在4°C冰箱孵育lh;
[0082] (3)用2X TOST缓冲液冲洗微量滴定板三次，每次每孔用300yl冲洗，用Stat Fa.x? 2600microplate washer(Awareness Technology，Inc.，FL)洗板机清洗；
[0083] (4)向微量滴定板中加入360yl 25%鸡蛋清蛋白封闭剂，然后置于4°C冰箱孵育 lh；
[0084] (5)按照步骤3，用2X PBST缓冲液冲洗微量滴定板三次；
[0085] (6)向微量滴定板反应孔加入80yl的第一抗体(羊抗牛酪蛋白，按1:2000稀释），将 板置于4°C冰箱孵育lh;
[0086] (7)用5x PBST缓冲液冲洗微量滴定板，每次每孔用300yl;
[0087] (8)向微量滴定板反应孔中加入80yl第二抗体（鼠抗羊免疫球蛋白，按1:4000稀 释），将板置于4°C冰箱孵育lh;
[0088] (9)用5x PBST缓冲液对微量滴定板清洗三次，每次每孔用300yl;
[0089] (10)每反应孔中加入80y 1的TBM酶作用物(3,3'，5,5'_四甲基联苯胺），将板置于4 °C冰箱孵育10min;
[0090] (11)加入50yl终止液（2M H2S〇4)终止反应；
[0091] (12)用Stat Fax 3200酶标仪测定微量滴定板各反应孔的吸光值，借助吸光光度 的方法测定在650nm处吸光值；
[0092] (13)设阴性对照(水)和阳性对照(第二蛋白标记物），将样品的吸光度值与阴性对 照(水)进行比较；当样品的吸光光度值0D等于或大于阴性对照吸光光度值的平均值加上3 倍标准差时，就判定为阳性读数，即阳性读数认定标准为:样品平均0D值2阴性对照平均0D 值+3 X阴性对照平均0D值的标准差；当数值小于阴性对照的平均吸光光度值时，样品被判 定为阴性，即阴性读数认定标准为:样品平均〇〇值< 阴性对照平均0D值。
[0093] C采用鸡蛋清蛋白作为标记物
[0094] (1)捕获的目的昆虫分别放在1.5ml的微量离心管中，小心处理，以防止交叉污染。 每一个离心管中加入750y 1 TBS缓冲溶液，置于恒温摇床27 °C，lOOrpm，清洗lh，取上清液移 至新1.5ml离心管；
[0095] (2)获得的上清液即为抗原样品（浸泡昆虫的TBS缓冲液），取80yl样品加入到96孔 微量滴定板中（每个样品均加3个孔，即进行3次技术重复），然后在恒温箱37°C，温育lh; [0096] (3)用2x TOST缓冲液冲洗微量滴定板三次，每次每孔用300yl冲洗，用StatFax? 2600microplate washer(Awareness Technology，Inc.，FL)洗板机清洗；
[0097] (4)向微量滴定板中加入360yl 1%牛血清蛋白封闭剂，然后放在摇床上在27°C下 孵育lh;
[0098] (5)按照步骤3，用2x PBST缓冲液冲洗微量滴定板三次；
[0099] (6)向微量滴