一种古代羊毛织品间接竞争法检测试纸的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及文物检测技术领域，尤其涉及一种古代羊毛织品间接竞争法检测试纸的制备方法。
【背景技术】
[0002]羊毛是一种天然动物毛纤维。具有角质组织，呈现光泽，坚韧并有弹性。因其产量高、种类多，可生产多种毛织品，是主要的毛纺工业原料。中国历史悠久，从中国早期的墓葬中出土有大量的羊毛制品文物，出土的大量羊毛制品文物对研究古代社会环境和人文活动具有重要参考价值。
[0003]羊毛的主要成分是角蛋白，在酸、碱、盐、氧化剂、还原剂、卤素等中羊毛都具有一定的不稳定性。此外羊毛还容易受到多种环境因素，如光照、射线和微生物等的影响，造成角蛋白发生变性和分子链的断裂，从而使其降解破坏，传统的检测方法对文物样品要求较高，而出土的羊毛制品文物一般都有不同程度的破损，对于破损文物尤其是腐朽文物的检测存在一定难度。常用的酶联免疫的方法，实验时间较长，需要在实验室进行，且检测结果不够直观，不适合于考古现场分析，而取而代之的间接竞争法检测用的胶体金试纸在定量分析上有缺陷，相对灵敏度低，也亟需完善。
【发明内容】
[0004]为了解决上述技术问题，本发明提供了一种古代羊毛织品间接竞争法检测试纸的制备方法。本发明方法操作简单，制备的古代羊毛织品间接竞争法检测试纸成本低，用于检测时定量分析准确性高，反应时间短，灵敏度高，更加直观，适合于考古现场的检测。
[0005]本发明的具体技术方案为:一种古代羊毛织品间接竞争法检测试纸的制备方法，其特征在于步骤如下:
A)荧光标记兔抗角蛋白抗体的制备:向每2.5-3.5mL的PBS缓冲液中依次加入0.14-
0.16mg的荧光微球、2.6-2.8yL的现配的浓度为4_6mg/mL的1_( 3-二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亚胺溶液和8-12yL的浓度为0.4-0.6mg/mL的兔抗角蛋白抗体溶液，得到A混合液，将所述A混合液在室温下搅拌1.5-2.5h，用0.5-1.5被％的牛血清蛋白溶液封闭25-35min后在8000-10000 r/min、4°C条件下离心处理8-12min，移除上清液，将沉淀加入到体积为兔抗角蛋白抗体溶液30倍的PBS缓冲液中复溶、混匀，制得荧光标记兔抗角蛋白抗体溶液，将所述荧光标记兔抗角蛋白抗体溶液保存备用。
[0006]B)试纸条的组装:用喷膜机将5-20体积份的羊毛角蛋白稀释液和5-20体积份的山羊抗兔抗体稀释液分别喷在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上，在36-38°C下烘干备用;将5-20体积份的荧光标记兔抗角蛋白抗体溶液稀释10-20倍后包被在荧光结合垫上，在36-38°C下烘干备用;将样品垫、荧光结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次组装在PVC底板上，并切割成条状，制得检测试纸，将所述检测试纸放入带干燥剂的铝箔袋中密封储存。
[0007]本发明利用免疫荧光层析技术的原理来检测古代墓葬中羊毛织品的痕迹，即将兔抗羊毛角蛋白抗体进行荧光标记，然后将荧光标记的兔抗羊毛角蛋白抗体溶解在荧光结合垫上，将羊毛角蛋白标准品和山羊抗兔IgG(H+L)抗体分别喷在硝酸纤维素薄膜上形成检测线和质控线。样品加入样品吸收垫，样品中的液体首先溶解结合垫中含有的荧光标记的兔抗羊毛角蛋白抗体，同时，样品中待测抗原与荧光标记的兔抗羊毛角蛋白抗体结合，形成抗原-兔抗羊毛角蛋白抗体荧光复合物，并靠毛细作用向检测线移动。样品经过检测线时，样品中的抗原与硝酸纤维素膜上的抗原进行竞争兔抗羊毛角蛋白抗体。若样品中含有抗原，聚集在硝酸纤维素膜上的荧光标记的兔抗羊毛角蛋白抗体就会减少，检测线不显荧光。抗原-荧光标记的兔抗羊毛角蛋白抗体或者荧光标记的兔抗羊毛角蛋白抗体(样品中不含有抗原)经过质控线，与山羊抗兔IgG(H+L)抗体反应，荧光标记的兔抗羊毛角蛋白抗体聚集在质控线上，在紫外照射下显出明显的荧光，且荧光强度可通过荧光定量仪测定。即若T/C(阳性K T/C(阴性)证明样品中含有羊毛角蛋白；若T/C(阳性)> T/C(阴性)，证明样品中未含有羊毛角蛋白或者羊毛角蛋白的浓度低于试纸条的检出限。
[0008]作为优选，步骤A)中所述荧光微球为聚苯乙烯荧光微球，粒径为100-11nm，激发波长为365nm，发射波长为610nmo
[0009]作为优选，所述PBS缓冲液的浓度为0.02mol/L，pH为5.5。
[0010]作为优选，步骤A)中所述牛血清蛋白溶液的用量为A混合液体积的1-1.2倍。
[0011]作为优选，步骤B)中所述硝酸纤维素膜的规格为长2.5cm，宽4mm。
[0012]作为优选，所述检测试纸的宽度为4mm。
[0013]作为优选，所述羊毛角蛋白稀释液的制备方法为:将羊毛角蛋白用Tris-HCl溶液稀释至浓度为0.5-4mg/mLo
[0014]作为优选，所述山羊抗兔抗体稀释液的制备方法为:将浓度为lmg/mL的山羊抗兔抗体溶液用Tr i s-HCl溶液稀释至100-400倍。
[0015]作为优选，所述荧光标记兔抗角蛋白抗体溶液稀释所用的稀释溶液包括0.15wt%的吐温-20，1%的牛血清蛋白、5%的蔗糖和余量的Tris-HCl溶液。
[0016]作为优选，步骤B)中所述Tri s-HCl溶液的pH为8.2。
[0017]与现有技术对比，本发明的有益效果是:本发明方法操作简单，制备的古代羊毛织品间接竞争法检测试纸成本低，用于检测时定量分析准确性高，反应时间短，灵敏度高，显示更加直观，适合于考古现场的检测。
【具体实施方式】
[0018]下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
[0019]实施例1
一种古代羊毛织品间接竞争法检测试纸的制备方法，其特征在于步骤如下:
A)荧光标记兔抗角蛋白抗体的制备:向3mL的浓度为0.02mol/L(pH为5.5)的PBS缓冲液中依次加入0.15mg的聚苯乙稀焚光微球(粒径为105nm，激发波长为365nm，发射波长为610nm)、2.7yL的现配的浓度为5mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液和1yL的浓度为0.5mg/mL的兔抗角蛋白抗体溶液，得到A混合液，将所述A混合液在室温下搅拌2h，用体积为A混合液体积1.1倍的lwt%的牛血清蛋白溶液封闭30min后在9000 r/min、4°C条件下离心处理1min，移除上清液，将沉淀加入到体积为兔抗角蛋白抗体溶液30倍的PBS缓冲液中复溶、混匀，制得荧光标记兔抗角蛋白抗体溶液，将所述荧光标记兔抗角蛋白抗体溶液在4°C下保存备用。
[0020]B)试纸条的组装:用喷膜机将12.5yL羊毛角蛋白稀释液和12.5yL山羊抗兔抗体稀释液分别喷在硝酸纤维素膜(长2.5cm，宽4mm)的检测线和质控线上，在37°C下烘干备用;将12.5yL荧光标记兔抗角蛋白抗体溶液稀释15倍后包被在荧光结合垫上，在37°C下烘干备用;将样品垫、荧光结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次组装在PVC底板上，并切割成4_宽的条状，制得检测试纸，将所述检测试纸放入带干燥剂的铝箔袋中密封储存。
[0021]其中，所述羊毛角蛋白稀释液的制备方法为:将羊毛角蛋白用pH为8.2的Tris-HCl溶液稀释至浓度为0.2mg/mL。所述山羊抗兔抗体稀释液的制备方法为:将浓度为lmg/mL的山羊抗兔抗体溶液用PH为8.2的Tris-HCl溶液稀释至250倍。所述荧光标记兔抗角蛋白抗体溶液稀释所用的稀释溶液包括0.15wt%的吐温-20，1%的牛血清蛋白、5%的蔗糖和余量的pH为8.2的Tris-HCl溶液。
[0022]C)取Ig纺织品痕迹样，溶解于75ml、pH为8.2的Tris-HCl溶液中，搅拌均匀，2h后取一滴上清液滴在组装好的试纸条的样品垫上，设为阳性对照;取PBS7.4缓冲溶液一滴滴在试纸条的样品垫上，设为阴性对照；20min后，在波长为365nm的三用紫外分析仪照射下，用紫外定量仪测得检测线(T)和质控线(C)的荧光强度，结果为阳性对照的T/C=0.63〈阴性对照的T/C=0.80，说明样品中含有羊毛角蛋白，该纺织品痕迹为羊毛织品的痕迹。
[0023]实施例2
一种古代羊毛织品间接竞争法检测试纸的制备方法，其特征在于步骤如下:
A)荧光标记兔抗角蛋白抗体的制备:向2.5mL的浓度为0.02mOl/L(pHS5.5)的I3BS缓冲液中依次加入0.14mg的聚苯乙稀焚光微球(粒径为100]11]1，激发波长为365111]1，发射波长为610nm)、2.6yL的现配的浓度为4mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液和8yL的浓度为0.4mg/mL的兔抗角蛋白抗体溶液，得到A混合液，将所述A混合液在室温下搅拌
1.5h，用体积为A混合液体积I倍的0.5的％的牛血清蛋白溶液封闭25min后在8000 r/min、4°(:条件下离心处理8min，移除上清液，将沉淀加入到体积为兔抗角蛋白抗体溶液30倍的PBS缓冲液中复溶、混匀，制得荧光标记兔抗角蛋白抗体溶液，将所述荧光标记兔抗角蛋白抗体溶液在4°C下保存备用。
[0024]B)试纸条的组装:用喷膜机将5yL羊毛角蛋白稀释液和5yL山羊抗兔抗体稀释液分别喷在硝酸纤维素膜(长2.5cm，宽4mm)的检测线和质控线上，在36°C下烘干备用；将5yL荧光标记兔抗角蛋白抗体溶液稀释20倍后包被在荧光结合垫上，在36°C下烘干备用；将样品垫、荧光结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次组装在PVC底板上，并切割成4_宽的条状，制得检测试纸，将所述检测试纸放入带干燥剂的铝箔袋中密封储存。
[0025]其中，所述羊毛角蛋白稀释液的制备方法