一种生物功能化的纳米微球颗粒联合氯金酸-金纳米颗粒探针及其制备方法和用途
【专利摘要】本发明公开了一种生物功能化的磁珠纳米微球颗粒联合氯金酸-金纳米颗粒探针及其制备方法和用途。探针分两部分，一为生物功能化的磁珠纳米微球颗粒，二为含有氯金酸和金纳米颗粒的复合溶液。其特征为含有检测抗体及具有生物酶活性物质表面修饰的磁珠纳米颗粒和可被上述酶催化的底物及含有氯金酸和金纳米颗粒复合溶液。该探针能与待检测物质高效识别，位于磁珠表面的生物酶活性物质催化其的底物产生过氧化氢，在过氧化氢和氯金酸存在的情况下，无色的金纳米溶液中的单个金纳米颗粒粒径会增大，从而导致金纳米颗粒溶液吸光值改变。本发明方法大大提高了疾病标识物或病原微生物的检测灵敏度，可定量,宽线性范围，并具有操作简单、批量检测的优点。
【专利说明】一种生物功能化的纳米微球颗粒联合氯金酸-金纳米颗粒探针及其制备方法和用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种生物功能化的磁珠纳米微球颗粒联合氯金酸-金纳米颗粒探针，其制备方法及所属纳米材料用于肿瘤等疾病生物标识物、病原体检测应用，属于生物医学工程以及纳米医学领域。
【背景技术】
[0002]在疾病体外诊断方面，高特异性、高灵敏度和高通量特性的检测技术是人们一直追求的目标。新的快速检测方法的建立，简化了操作流程，降低检测成本，提高了检测的时效性和准确性。人们利用病原体的快速检出技术可以掌握传染病的流行状况，这对及早做出正确的临床决策意义重大，然而目前在临床生物标志物检测上广泛应用的方法是酶联免疫吸附法(以下简称ELISA)，由于其中等程度的敏感性，只有生物标志物的水平已经达到临界阈值浓度后才能检测，限制了其用于疾病早期检测应用。再者，基于聚合酶链式反应(PCR)的检测技术在近几年层出不穷，虽然PCR技术有着超高的灵敏度，然而同时，该技术需要昂贵的实验设备、试剂和技术工人，这些因素大大限制了其广泛应用，尤其是在偏远地区如发展中国家。因此临床上对于可替代PCR技术的超高灵敏检测方法的需求尤为紧迫。正如20世纪70年代的微米技术一样，纳米技术将成为21世纪的主导技术，为生物诊疗领域的发展提供了很大空间。目前光、磁和电响应纳米粒子已经广泛应用于纳米医学、分子影像学等领域。
【发明内容】
[0003]本发明的首要目的在于提供一种生物功能化的磁珠纳米微球颗粒联合氯金酸-金纳米颗粒探针；
[0004]本发明的另一目的在于提供一种新的生物功能化磁珠纳米微球颗粒联合氯金酸-金纳米颗粒探针的制备方法；
[0005]本发明的再一目的是提供一种利用所述的生物功能化磁珠纳米微球颗粒联合氯金酸-金纳米颗粒探针作为疾病标识物或病原微生物检测系统的应用。
[0006]本发明的目的可以通过如下技术方案实现:
[0007]—种生物功能化的磁珠纳米微球颗粒联合氯金酸-金纳米颗粒探针，其特征为含有检测抗体及具有生物酶活性物质表面修饰的磁珠纳米粒子(0.5mg/ml-5mg/ml,更优选的较窄范围为0.8mg/ml-l.2mg/ml)，和可被上述酶催化的底物(0.1mM-lOOmM，更优选的较窄范围为ImM-1OmM)，及氯金酸(10 μ M-lOmM，更优选的较窄范围为100 μ M-1mM)-金纳米颗粒溶液(InM-lOOnM，更优选的较窄范围为InM-1OnM)。
[0008]或所述的探针不包括磁珠纳米颗粒，即该探针仅包括检测抗体及具有生物酶活性物质，和可被上述酶催化的底物(ImM-lOOmM，更优选的较窄范围为ImM-1OmM)，及氯金酸(1μΜ-10πιΜ，更优选的较窄范围为100 μ M-1mM)-金纳米颗粒(ΙηΜ-ΙΟΟηΜ，更优选的较窄范围为InM-1OnM)溶液。
[0009]其中，所述的磁珠纳米微球颗粒包括磁性纳米颗粒、碳纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、乳胶体纳米颗粒、陶瓷纳米颗粒、聚合物纳米颗粒。本发明优选采用磁珠纳米微球颗粒。
[0010]其中，所述的金纳米颗粒包括金纳米粒子、金纳米棒、金纳米星、金纳米囊,金纳米笼或金纳米壳中的至少一种。
[0011]其中，所述的抗体，为一种或多种检测抗体，其根据检测靶标物质而定。其浓度可以为 Iy g/ml-50mg/ml,优选为 100 μ g/ml-lOmg/ml,更优选为 500 μ g/ml_5mg/ml ;所述的抗体，其为鼠源或人源或羊源或其它动物来源，或为基因工程抗体，如人源抗体、人源化抗体、嵌合抗体或单链抗体等。本发明优选鼠源单克隆抗体。
[0012]其中，所述的将具有酶活性功能的物质与纳米微球颗粒通过化学偶联的方式进行结合，所述偶联可以是炔烃-叠氮法、MBS法、戊二醛法、活泼酯法、碳二亚胺法、卤代硝基苯法及亚胺酸脂法等。本发明优选采用活泼酯法。其中，所述的具有酶活性物质包括糖氧化酶类、羧酸酯酶类、硫酯酶类、磷酸单酯酶类磷、磷酸二酯酶类、硫磷酸酯酶等。本发明优选采用葡萄糖氧化酶(GOx)。
[0013]其中，所述的可以被具有酶活性物质所催化的底物包括糖类、羧酸酯类、硫酯类、磷酸单酯类、磷酸二酯类、硫磷酸酯类等。本发明优选采用β-D-葡萄糖。
[0014]其中，将抗体与具有酶活性物质通过化学偶联的方式进行结合，所述偶联可以是炔烃-叠氮法、MBS法、戊二醛法、活泼酯法、碳二亚胺法、卤代硝基苯法及亚胺酸脂法等，本发明优选采用炔烃-叠氮法、活泼酯法。
[0015]生物功能化的磁珠纳米微球颗粒联合氯金酸-金纳米颗粒探针制备方法，包括
[0016]1)0.5mg/ml-5mg/ml磁珠纳米微球颗粒溶液中加入过量的酶活性物质，反应
0.5-3小时后，分离去除过量的酶活性物质。后加入可发生化学偶联的基团。
[0017]2)将检测抗体加入可与I)中化学偶联基团反应的另一基团。室温下反应0.5-3小时，利用离心方法去除未结合的基团。
[0018]3)将I)与2)分别得到的产物混合，得到生物功能化的磁珠纳米微球颗粒。
[0019]4)混有可被酶活性物质催化的0.1mM-1OOmM相关底物和含有10 μ M-1OmM氯金酸和InM-1OOnM金纳米颗粒的溶液混合，即得到金纳米颗粒复合溶液；
[0020]5)生物功能化的磁珠纳米微球颗粒和金纳米颗粒复合溶液即组成了生物功能化的纳米微球颗粒联合氯金酸-金纳米颗粒探针。
[0021]更佳地，生物功能化的磁珠纳米微球颗粒联合氯金酸-金纳米颗粒探针的制备方法，包括以下步骤:
[0022]I)取 100 μ L NHS (N-hydroxys μ ccinimide)活化的磁珠纳米颗粒(10mg/mL)于小离心管中，借助于磁力架，用盐酸(lmM，4°C )清洗一遍。后加入100 μ L溶解于PBS中的葡萄糖氧化酶(3mg/mL)，涡旋混匀30秒。后将该混合物置于振荡器中反应2小时，反应条件为室温。在开始的30分钟，每隔5分钟将小离心管涡旋振荡15秒。剩余的90分钟，每15分钟将小离心管涡旋振荡15秒，从而得到结合了葡萄糖氧化酶的磁珠纳米颗粒。后加入5 μ LNHS活化的叠氮基团(ImM)，室温反应30分钟，从而得到偶联了叠氮基和葡萄糖氧化酶的磁珠纳米颗粒。
[0023]2)取ImL检测抗体(lmg/mL)，抗体缓冲环境为PBS (pH = 7.4)，取33 μ LNHS活化的DBCO(dibenzocyclooctyl, IOmM)加入到抗体中，DBCO与抗体的摩尔比为50:1。室温反应30分钟后，加入IMTris-HCl (pH = 8.0)以终止反应，Tris终浓度为50mM，终止反应持续5分钟。即得到偶联了 DBCO的抗体溶液。
[0024]3)取10 μ L偶联了 DBCO的抗体溶液(lmg/mL)加入到ImL偶联了叠氮基和葡萄糖氧化酶的磁珠纳米颗粒(lmg/mL)中，室温反应2小时，即得到了偶联了抗体和葡萄糖氧化酶的磁珠纳米颗粒。
[0025]4) β-D-葡萄糖(5mM)和氯金酸(0.6mM)金纳米颗粒(5nm,8.3nM)的混合物即为金纳米颗粒复合溶液。
[0026]本发明研制出一种生物功能化的磁珠纳米微球颗粒联合氯金酸-金纳米颗粒探针及其制备方法。该探针主要有两大部分组成，其一为生物功能化的磁珠纳米微球颗粒，其二为金纳米颗粒复合溶液，其特征为含有检测抗体及具有生物酶活性物质表面修饰的磁珠纳米粒子和可被上述酶催化的底物及金纳米颗粒。磁珠纳米微球颗粒联合氯金酸-金纳米颗粒探针能与疾病病原体生物标识物高效识别，附着于磁珠纳米微球颗粒表面的具有生物酶活性物质可以将其可催化的底物降解为带正电的产物，该产物可以引起金纳米颗粒的聚集，从而导致金纳米颗粒溶液吸光值的变化。吸光值变化的程度与样品中的生物标识物的浓度成比例。并且吸光值的变化肉眼可见。
[0027]磁珠纳米颗粒具有较高的惰性，苛刻的环境对其影响小，同时其具有较强的人工可修饰性，在其表面修饰一定的化学基团，从而可以进一步偶联生物活性物质，对其进行功能性改造。磁珠纳米颗粒还具有较大的体表面积，每个磁珠颗粒上可以附着巨大数量的生物活性物质，从而起到信号放大的作用，实现对较低含量靶标物质的检出。在金纳米颗粒溶液中，金纳米颗粒表面附着一层柠檬酸盐，表面带有均匀的负电荷，使金纳米颗粒均匀地分布在溶液中。较低浓度的小粒径金纳米颗粒溶液是无色的，随着金纳米颗粒粒径的增加，金纳米颗粒溶液颜色会发生改变，伴随着吸光值的变化。该过程可以通过如下反应实现:在过氧化氢和氯金酸的存在下，过氧化氢会氧化氯金酸，其产生金会附着在原本的金纳米颗粒表面，从而导致金纳米颗粒粒径的增加。金纳米颗粒溶液从无色变为有色的这一过程，吸光值发生变化，吸光值变化的程度与样品中的生物标识物的浓度成比例。本发明方法大大提高了疾病生物标志物的检测灵敏度，可对疾病生物标识物进行定量，具有较宽的线性范围，并同时具有设备简易、操作简单、且能批量检测的优点。
[0028]本发明的有益效果:
[0029]本发明在固相纳米微球上进行生物功能化修饰，附着于其上的大量酶活性物质催化其底物产生过氧化氢，过氧化氢可以氧化氯金酸，产物附着在小颗粒的金纳米颗粒上，造成金纳米颗粒粒径的增大，低浓度的小粒径金纳米颗粒是无色的，随着粒径的增大，金纳米颗粒颜色发生变化，从而吸光值发生变化，吸光值的变化与相关疾病标识物或病原微生物的浓度成正比，从而实现对疾病标识物或病原微生物的检出。该方法具有极高的灵敏度，实验证明，相比于ELISA试剂盒，灵敏度提高约IO4倍。
[0030]另外，该探针可以实现对待检物质的定量检测，并且线性范围可覆盖5个数量级。
[0031]另外，简单的检测手段也是本发明的一大亮点，肉眼对金纳米颗粒溶液颜色变化的观察与仪器对金纳米颗粒溶液吸光值变化的测量具有极高的符合度，即用肉眼即可观测到极低浓度待检物质的检出。[0032]再者，该检测探针的检测方法简单，所用试剂耗材成本低，反应载体与ELISA试剂盒相同，微孔板即可满足条件，从而实现对待检物质进行高通量检测，也更利于在临床检测上的推广应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0033]图1为生物功能化的磁珠纳米微球颗粒构建示意图。
[0034]图2为利用生物功能化的磁珠纳米微球颗粒联合氯金酸-金纳米颗粒探针检测原理图。
[0035]图3为不同浓度过氧化氢加入含有氯金酸-金纳米颗粒溶液中，引起的颜色变化
(a)，及吸光值的变化(b)及530nm(A530)光波长吸光值变化(C)。
[0036]图4为不同浓度过氧化氢加入到含有氯金酸-金纳米颗粒溶液中引起的金纳米颗粒粒径增加的投射电镜照片。
[0037]图5为利用生物功能化的磁珠纳米微球颗粒联合氯金酸-金纳米颗粒探针检测梯度稀释的前列腺特异抗原(PSA)肉眼观测(a)及吸光值变化(b)结果图。
[0038]图6为在磁珠纳米微球颗粒部分缺失的情况下，吸光值变化结果图。
[0039]图7为利用生物功能化的磁珠纳米微球颗粒联合氯金酸-金纳米颗粒探针(a)和商品化试剂盒(b)检测临床样品(前列腺癌患者，健康人群)结果比较图。
[0040]图8为利用生物功能化的磁珠纳米微球颗粒联合氯金酸-金纳米颗粒探针和商品化试剂盒对前列腺癌患者样品进行定量结果比较图。
【具体实施方式】
[0041]以下通过具体的制备例和实施例可使本发明得到更清楚地说明:
[0042]制备例1:以下步骤中的所使用的化学物质为市售商品。
[0043]生物功能化的磁珠纳米微球颗粒联合氯金酸-金纳米颗粒探针的制备及用于疾病标识物或病原微生物(以疾病标志物PSA为例)的检测方法，包括以下步骤:
[0044]I)取 100 μ L NHS (N-hydroxys μ ccinimide)活化的磁珠纳米颗粒(10mg/mL)于小离心管中，借助于磁力架，用盐酸(lmM，4°C )清洗一遍。后加入100 μ L溶解于PBS中的葡萄糖氧化酶(3mg/mL)，涡旋混匀30秒。后将该混合物置于振荡器中反应2小时，反应条件为室温。在开始的30分钟，每隔5分钟将小离心管涡旋振荡15秒。剩余的90分钟，每15分钟将小离心管涡旋振荡15秒，从而得到结合了葡萄糖氧化酶的磁珠纳米颗粒。后加入5uL NHS活化的叠氮基团(ImM)，室温反应30分钟，从而得到偶联了叠氮基和葡萄糖氧化酶的磁珠纳米颗粒。
[0045]2)取 ImL PSA 检测抗体(lmg/mL)，抗体缓冲环境为 PBS (pH = 7.4)，取 33 μ L NHS活化的DBCO(Dibenzocyclooctyl, IOmM)加入到抗体中，DBCO与抗体的摩尔比为50:1。室温反应30分钟后，加入IMTris-HCl (pH = 8.0)以终止反应，Tris-HCl终浓度为50mM，终止反应持续5分钟。即得到偶联了 DBCO的抗体溶液。
[0046]3)取10 μ L偶联了 DBCO的抗体溶液(lmg/mL)加入到ImL偶联了叠氮基和葡萄糖氧化酶的磁珠纳米颗粒(lmg/mL)中，室温反应2小时，即得到了偶联了抗体和葡萄糖氧化酶的磁珠纳米颗粒。[0047]4) β-D-葡萄糖(5mM)和氯金酸(0.6mM)金纳米颗粒(5nm,8.3nM)的混合物即为金纳米颗粒复合溶液。
[0048]5)将抗PSA 的捕获抗体(Abl)溶于 100mMNa2C03-NaHC03 (pH9.6)缓冲液中(4 μ g/mL)，取到96孔板孔中(100 μ L/孔)，4°C过夜或常温4小时后，加入PBS冲洗3次，加1%牛血清白蛋白(BSA)进行封闭(37°C，1小时)。
[0049]6)将标准PSA样品用PBS或者牛血清稀释不同浓度，用单独PBS或牛血清作为阴性对照，加入到96孔板孔中(100 μ L/孔)，在37°C下温育I小时。
[0050]7)PBS冲洗3次，每孔加入100 μ L抗体-葡萄糖氧化酶-磁珠纳米颗粒溶液(0.lmg/mL)，在37°C下温育20分钟。
[0051 ] 8) PBST冲洗3次，每孔加入100 μ L5mM β -D-葡萄糖(溶于柠檬酸_Na2HP04，pH =5.0)，在35°C下温浴10分钟。
[0052]9)后加入50 μ I氯金酸(0.6mM)和5nm金纳米颗粒(8.3nM)混合溶液，在35°C下温浴20分钟，用读板仪读取530nm光波长吸光值。
[0053]制备例(2)
[0054]不含有磁珠纳米颗粒微球探针的制备及用于疾病标识物或病原微生物(以疾病标志物PSA为例)的检测方法，包括以下步骤:
[0055]I)取100 μ L溶解于PBS中的葡萄糖氧化酶(3mg/mL)，加入5 μ L NHS活化的叠氮基团(ImM)，室温反应30分钟。
[0056]2)取ImL检测抗体(lmg/mL)，抗体缓冲环境为PBS (pH = 7.4)，取33 μ L NHS活化的DBCO(IOmM)加入到抗体中，DBCO与抗体的摩尔比为50:1。室温反应30分钟后，加入IMTris-HCl (pH = 8.0)以终止反应，Tris-HCl终浓度为50mM，终止反应持续5分钟。即得到偶联了 DBCO的抗体溶液。
[0057]3)取10 μ L偶联了 DBCO的抗体溶液(lmg/mL)加入到ImL偶联了叠氮基和葡萄糖氧化酶溶液中室温反应2小时，即得到了偶联了抗体和葡萄糖氧化酶偶联的复合物。
[0058]4) β-D-葡萄糖(5mM)和氯金酸(0.6mM)金纳米颗粒(5nm,8.3nM)的混合物即为金纳米颗粒复合溶液。
[0059]5)将抗 PSA 的捕获抗体(Abl)溶于 IOOmMNa2CO3-NaHCO3 (pH9.6)缓冲液中(4 μ g/mL)，取到96孔板孔中(100 μ L/孔)，4°C过夜或常温4小时后，加入PBS冲洗3次，加I %牛血清白蛋白(BSA)进行封闭(37°C，1小时)。
[0060]6)将标准PSA样品用PBS或者牛血清稀释不同浓度，用单独PBS或牛血清作为阴性对照，加入到96孔板孔中(100 μ L/孔)，在37°C下温育I小时。
[0061]7) PBS冲洗3次，每孔加入100 μ L抗体-葡萄糖氧化酶溶液，在37°C下温育20分钟。
[0062]8) PBST冲洗3次，每孔加入100 μ L5mM β -D-葡萄糖(溶于柠檬酸_Na2HP04，pH =
5.0)，在35°C下温浴10分钟。
[0063]9)后加入50 μ I氯金酸(0.6mM)和5nm金纳米颗粒(8.3nM)混合溶液，在35°C下温浴20分钟，用读板仪读取530nm光波长吸光值。
[0064]实施例1
[0065]将不同浓度过氧化氢加入制备例(I)所述的含有氯金酸-金纳米颗粒溶液中，可以清晰看到发生的变化，随着过氧化氢浓度的增高，氯金酸-金纳米颗粒溶液颜色变得越深(图3a)，吸光图谱的变化(图3b)以及在530nm光波长吸光值的变化(图3c)。在透射电镜下也可以看到不同浓度过氧化氢加入到含有氯金酸和5nm金颗粒溶液中引起的金纳米颗粒粒径增大(图4)。
[0066]实施例2
[0067]利用生物功能化的磁珠纳米微球颗粒联合氯金酸-金纳米颗粒探针对极低浓度梯度的PSA(分别为0、10、102、103、104、105fg/ml)进行检测，检测操作步骤见制备例(I)。可以看到该探针可以检测低至fg级别。并且定量检测线性范围宽达10fg-100000fg。(图5)灵敏度可以比ELISA试剂盒高约100000倍(ELISA试剂盒灵敏度约10ng/ml)。
[0068]实施例3
[0069]在磁珠纳米微球颗粒部分缺失的情况下，对临床样本进行定量检测，检测能力可达fg级(图6)，灵敏度可以比ELISA试剂盒高约100倍(ELISA试剂盒灵敏度约10ng/ml)。
[0070]实施例4
[0071]利用生物功能化的磁珠纳米微球颗粒联合氯金酸-金纳米颗粒探针检测临床样本(前列腺癌患者血清，健康人群血清)，操作步骤见制备例(1)，并以商品化ELISA试剂盒作为对照试剂。商品化试剂盒检测方法为该ELISA试剂盒的说明书，对12份前列腺癌患者血清检出10份阳性，对健康人群血清没有检出。而利用本发明制备例(I)的探针对12份前列腺癌患者血清均检测为阳性，没有漏检，对健康人群血清同样没有检出(图7)。说明该探针在检测试剂标本时亦可发挥出高灵敏检出的能力，对商品化试剂盒不能检出的样品能够补充检出，并且特异性良好。
[0072]实施例5
[0073]利用生物功能化的磁珠纳米微球颗粒联合氯金酸-金纳米颗粒探针检测生物标准品建立的定量方法和商品化ELISA定量试剂盒对临床样本进行定量比较，商品化试剂盒检测方法为该ELISA试剂盒的说明书。
[0074]结果发现本发明制备例(I)的探针与定量试剂盒的定量结果极为接近(图8)，表明该探针可以对临床样本进行精确定量。
[0075]本发明研制出的一种新的生物功能化磁珠纳米微球颗粒联合氯金酸-金纳米颗粒探针，该探针具有极高的灵敏度，对疾病标识物或病原微生物的检测能力可达fg级，灵敏度比ELISA试剂盒高约10000倍，结果判定简单，肉眼可实现简单判定，利用仪器可以实现对疾病标识物或病原微生物的精确定量，并且定量的线性范围可宽达5个数量级，该探针且具有优良的特异性。该检测探针的检测方法简单，所用试剂耗材成本低，反应载体与ELISA试剂盒相同，微孔板即可满足条件，从而实现对待检物质进行高通量检测，也更利于在临床检测上的推广应用。本发明所用的磁珠纳米微球颗粒部分亦可缺失，从而使得检测方法更为简单，并具有比ELISA试剂盒灵敏度高约100倍的灵敏度。
[0076]在磁珠纳米微球颗粒部分缺失的情况下，可以将检测抗体或核酸适配体直接标记生物酶活性物质(类似于ELISA试剂盒中的酶标记抗体)，后续检测步骤相同，同样需要加入可以被酶活性物质催化的底物和氯金酸-金纳米颗粒，过氧化氢和氯金酸反应的产物附着在金纳米颗粒上，造成金纳米颗粒粒径的增加，使得金纳米颗粒溶液吸光值发生变化，从而达到对待检物质的高效检出。虽然缺失了磁珠纳米微球对抗体或核酸适配体的高效富集，损失了一定的灵敏度，但利用金纳米颗粒的信号放大效果，仍然能够达到比ELISA试剂盒灵敏度高约100倍的检测效果。
[0077]本发明所用的磁珠纳米微球颗粒部分包括并不限于磁性纳米颗粒，其他更多可选纳米颗粒包括但不限于碳纳米颗粒、二氧化娃纳米颗粒、乳胶体纳米颗粒、陶瓷纳米颗粒、聚合物纳米颗粒等，制备方法类似。本发明所用的金纳米颗粒包括金纳米粒子、金纳米棒、金纳米星、金纳米囊，金纳米笼或金纳米壳等。其他更多可选酶活性功能的物质包括并不限于葡萄糖氧化酶等，其他更多可选偶联方法包括并不限于炔烃-叠氮法、活泼酯法等，制备方法类似。
【权利要求】
1.一种生物功能化的磁珠纳米微球颗粒联合氯金酸-金纳米颗粒探针，其特征在于所述的探针包括检测抗体及0.5mg/ml-5mg/ml具有生物酶活性物质表面修饰的磁珠纳米颗粒，和0.1mM-1OOmM可被上述酶催化的底物，及10 μ M-1OmM氯金酸-1nM-1OOnM金纳米颗粒溶液；或所述的探针不包括磁珠纳米颗粒，即该探针仅包括检测抗体及具有生物酶活性物质,和ImM-1OOmM可被上述酶催化的底物,及I μ M-1OmM氯金酸-1nM-1OOnM金纳米颗粒溶液。
2.如权利要求1所述的生物功能化的磁珠纳米微球颗粒联合氯金酸-金纳米颗粒探针，其特征在于，所述的磁珠纳米微球颗粒包括磁性纳米颗粒、碳纳米颗粒、二氧化娃纳米颗粒、乳胶体纳米颗粒、陶瓷纳米颗粒或聚合物纳米颗粒中的至少一种。
3.如权利要求1所述的生物功能化的磁珠纳米微球颗粒联合氯金酸-金纳米颗粒探针，其特征在于，所述的金纳米颗粒包括金纳米粒子、金纳米棒、金纳米星、金纳米囊，金纳米笼或金纳米壳中的至少一种。
4.如权利要求1所述的生物功能化的磁珠纳米微球颗粒联合氯金酸-金纳米颗粒探针，其特征在于，所述的具有酶活性物质包括糖氧化酶类、羧酸酯酶类、硫酯酶类、磷酸单酯酶类磷、磷酸二酯酶类、硫磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶中的至少一种。
5.如权利要求4所述的生物功能化的磁珠纳米微球颗粒联合氯金酸-金纳米颗粒探针，其特征在于，可被权利要求4中酶活性物质催化的底物，包括糖类、羧酸酯类、硫酯类、磷酸单酯类、磷酸二酯类或硫磷酸酯中的至少一种。
6.如权利要求1所 述的生物功能化的磁珠纳米微球颗粒联合氯金酸-金纳米颗粒探针，其特征在于，所述的抗体为一种或多种检测抗体，抗体为人源或动物来源，或为基因工程抗体。
7.如权利要求1所述的生物功能化的磁珠纳米微球颗粒联合氯金酸-金纳米颗粒探针，其特征在于，将具有酶活性功能的物质与纳米微球颗粒通过化学偶联的方式进行结合，所述偶联包括炔烃-叠氮法、MBS法、戊二醛法、活泼酯法、碳二亚胺法、卤代硝基苯法及亚胺酸脂法中的一种或其结合。
8.如权利要求1所述的生物功能化的磁珠纳米微球颗粒联合氯金酸-金纳米颗粒探针，其特征在于，将抗体与具有酶活性物质通过化学偶联的方式进行结合，所述偶联包括炔烃-叠氮法、MBS法、戊二醛法、活泼酯法、碳二亚胺法、卤代硝基苯法及亚胺酸脂法中的一种或其结合。
9.如权利要求1至8任一项所述的生物功能化的磁珠纳米微球颗粒联合氯金酸-金纳米颗粒探针制备方法，包括如下步骤: 1)0.5mg/ml-5mg/ml磁珠纳米微球颗粒溶液中加入过量的酶活性物质，反应0.5-3小时后，分离去除过量的酶活性物质，后加入可发生化学偶联的基团； 2)将检测抗体加入可与I)中所述的基团反应的另一基团，室温下反应0.5-3小时，利用离心方法去除未结合的基团； 3)将I)与2)分别得到的产物混合，得到生物功能化的磁珠纳米微球颗粒； 4)混有可被酶活性物质催化的0.1mM-1OOmM相关底物和含有10 μ M-1OmM氯金酸和InM-1OOnM金纳米颗粒的溶液混合,即得到金纳米颗粒复合溶液； 5)生物功能化的磁珠纳米微球颗粒和含有氯金酸和金纳米颗粒复合溶液即组成了生物功能化的纳米微球颗粒联合氯金酸-金纳米颗粒探针。
10.如权利要求1至8任一项所述的磁珠纳米微球颗粒联合氯金酸-金纳米颗粒探针的用途，其用于制备疾 病标识物或病原微生物检测试剂。
【文档编号】G01N21/31GK103940765SQ201410171205
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月25日 优先权日:2014年4月25日
【发明者】刘刚, 陈小元, 刘定斌, 王占通, 王浩鹏 申请人:厦门大学