专利名称：纳米粒组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗组合物和应用作为传递载体的纳米粒制剂的方法。纳
亲和部分。纳米粒还任选包含用于立体稳定性和延长循环的亲水聚合物的表面包衣。
背景技术：
纳米粒可以用于多种治疗目的，特别是用于通过全身施用纳米粒将治疗剂携带至靶细胞。
由于多种原因，可能希望应用纳米粒^床护治疗剂。为了开发二膦酸盐类药物的治疗作用，必须以某种方式改变药物的分布以便治疗剂可以有效与治疗目标的靶表面特异性相互作用。因此，希望提供治疗性纳米粒组合物。
发明概述
一方面，本发明包括基于纳米粒治疗哺乳动物个体的方法，该方法包
括给个体全身施用纳米粒，所述的纳米粒包含
(i) 聚合物基质；和
(ii) 治疗剂。
聚合物基质给治疗剂提供了保护，该治疗剂在传统制剂中是溶液形式并且快速分布至全身。
基于嚢泡的纳米粒，例如脂质体制剂是另外的用于靶向药物传递的治疗剂的施用方法。在二膦酸盐的情况中，令人惊奇的是发现了此类嚢泡制剂实际上可以引起低钙血症，这是由于全身施用后嚢泡中的钩与周围的介质隔离的原因。这最终可能引起中毒(参见脂质体专利)。如本发明所述，在基于聚合物基质的纳米粒的情况中，所述的钙离子的隔离将被避免并且因此希望此类制剂提供与基于嚢泡的系统比较更优越的安全性。另一方面，本发明包括基于纳米粒治疗哺乳动物个体的方法，该方法
包括给个体全身施用纳米粒，所述的纳米粒包含
(i) 聚合物基质；
(ii) 治疗剂；
(iii) 用于立体稳定性和延长循环的亲水聚合物包衣；以及任选
(iv) 有效与治疗目标的耙表面特异性结合的亲和部分。 亲水聚合物包衣包含或者在纳米粒中与聚合物基质表面组分共价连接
或者通过电荷相互作用吸附在聚合物基质表面上的聚合物链。 在一个实施方案中，聚合物基质包含钩离子。
在一个实施方案中，当治疗剂施用于靶区域时，亲和部分是在靼区域 有效与受体特异性结合的配体，并且纳米粒包含包埋形式的治疗剂。该实 施方案的实例是治疗实体瘤，其中亲和部分有效与肿瘤特异性受体或抗原 特异性结合，纳米粒的平均粒径为约10 nm至约500 nm之间并且包含包 埋的药物。
在一个实施方案中，聚合物基质包含乳酸和乙醇酸的共聚物。
发明详述
I.纳米并立组合物
用于基于纳米粒治疗的纳米粒具有至少一个具有外表面的外层。可以
理解的是纳米粒可以包含另外的层。在一种情况中，外层或者包含共价连
接的亲水聚合物，其依次与靼部分共价连接。在另外的情况中，外层包含 一端与靶部分共价连接并且另一端也通过静电相互作用与电荷部分共价连
接的亲水聚合物。电荷部分选自多种氨基酸或基于氨基酸的聚合物，其与 聚合物基质具有相反的电荷。
纳米粒包含聚合物基质，该聚合物基质包含在暴露用于与耙相互作用 之前有效保护治疗剂免于渗漏的二价阳离子。二价阳离子基质增加了包嚢 的有效性和治疗剂的药物载量并且通过包埋药物降低了治疗剂穿过纳米粒 的通透性。二价阳离子基质有助于包埋高溶解性的治疗剂。另外，二价阳 离子可以易于将治疗剂更有效地传递至肿瘤。
在一个实施方案中，将钙离子掺入至纳米粒中在靶标作用之前帮助保持活性药物免于M。
施用于靶细胞或靶区域的治疗剂包埋于纳米粒中。如本文所应用的，
治疗剂、化合物和药物可以互^L应用。
包埋的治疗剂可以是任何可以包埋于聚合物基质中的大量治疗剂，包 括水溶性物质、亲脂化合物或可以例如通过静电连接与嚢泡外表面稳定连 接的物质。示例性的水溶性化合物包括二膦酸盐类药物。治疗剂的实例是 取代的烷二膦酸，特别是式(I)的杂芳基烷二膦酸，及其盐、所述化合物的
制剂、包含它们的药物组合物以及其作为药物的用途
po3h2
—r2
r1——c h.
po，h.
其中
Rl是5-元杂芳基，其包含作为杂原子的2-4个N-原子或者1或2个 N-原子以及1个O-或S-原子，并且其是未取代的或者是被以下基团C-取 代的低级烷基、苯基或被低级烷基、低级烷氧基和/或面素取代的苯基， 或低级烷氧基、羟基、二-低级烷基氨基、低级烷l^克代和/或囟素，和/或 是在N-原子上N-取代的，其可以被低级垸基、低级烷氧基和/或卣素取代； 并且
R2是氬、羟基、 、低级烷^^克代或卣素。
包含2-4个N-原子或者1或2个N-原子以及1个O-或S-原子作为杂 原子的5-元杂芳基的实例是咪唑基(例如咪唑-l-基、咪唑-2-基或咪唑-4-基)、吡唑基(例如吡唾-l-基或吡唑-3-基)、蓉峻基(例如蓬唑-2-基或塞峻-4-基)，或者更少优选噁唑基(例如噁唑-2-基或噁唑-4-基)、异喷、唑基(例如异 ，懲唑-3-基或异嗜、唑-4-基)、三唑基(例如1H-l，2，4-三唑-l-基、4H-l，2，4-三哇 -3-基或4H-l,2，4-三唑-4-基或2H-l，2，3-三唑-4-基)、四唑基(例如四唑-5-基)、 蓉二唑基(例如1，2,5-蓉二唑-3-基)和嗜、二唑基(例如1，3,4-嗜、二唑-2-基)。这 些基团可以包含一个或多个相同的或不同的、优选一个或两个相同的或不 同的取代基，所述的取代基选自上文提及的基团。基团Rl(如上所述未取 代的或取代的)是例如咪唑-2-基或咪唑-4-基，其是未取代的或者被苯基或
8如上所述被取代的苯基C-取代，或者被d-C4烷基(例如甲基)C-或N-取代， 并且典型地是咪唑-2-基、l-CrC4烷基咪唑-2-基(例如l-曱基咪唑-2-基)或 者2-或5-C广C4烷基咪唑-4-基(例如2-或5-甲基咪喳-4-基)；未取代的噻唑 基(例如噻唑-2-基)；或lH-l，2，4-三唑基，其是未取代的或被C广C4烷基(例 如曱基)取代，例如l-C广C4烷基-lH-l,2，4-三唑-5-基(例如1-甲基-lH-l,2，4-三唑-5-基)；或者咪唑-l-基、吡唑基-l-基、lH-l，2，4-三唑-l-基、4H-1,2，4-三唑-4-基或四哇-l-基，它们是未取代的或者被苯基或如上所述被取代的苯 基C-取代或者被d-C4烷基(例如甲基)C-取代，例如咪唑-l-基、2-、 4-或 5-C广C4烷基咪唑-l-基(例如2-、 4-或5-甲基咪唑-l-基)、吡唑-l-基、3-或 4-d-d烷基吡唑-l-基(例如3-或4-曱基吡唑-l-基)、1H-l，2，4-四唑-l-基、 3-C广C4烷基-lH-l，2，4-三唑-l-基(例如3-甲基-lH-l，2，4-三唑-l-基)、 411-1，2，4-三唑-1-基、3-<:1画<:4烷基-411-1，2,4-三唑-4-基(例如3-曱基画411-1，2，4-三唑-4-基)或1H-l，2，4-四唑-l-基。
下文被术语"低级，，限定的基团或化合物应当被理解为典型地指的是 包含至多7个(包括7个)碳原子、优选至多4个(包括4个)碳原子的那些。 通用术语具有例如以下含义
低级烷基是例如d-C4烷基，例如曱基、乙基、丙基或丁基，并且也 可以是异丁基、仲丁基或叔丁基，并且可以进一步是Cs-C7烷基，例如戊 基、己基或庚基。
苯基-低级烷基是例如苯基-d-C4烷基，优选l-苯基-CVC4烷基，例如苄基。
低级烷氧基是例如d-C4烷氧基，例如曱氧基、乙氧基、丙氧基、异 丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基或叔丁氧基。
二-低级烷基氨基是例如二-C广C4烷基^，例如二曱基M、 二乙基
氨基、N-乙基-N-甲基氨基、二丙基氨基、N-甲基-N-丙基氨基或二丁基氨基。
低级烷l^fu代是例如C广C4烷^i^克代，例如甲^^克代、乙J^危代、丙 !^危代或丁基硫代，并且也可以是异丁基疏代、仲丁基硫代或叔丁基硫代。
卤素是例如具有至多35(包括35)原子数的卣素，包括例如氟、氯或溴。
9式(I)化合物的盐特别是其与可药用碱的盐，例如衍生自Ia、 Ib、 IIa 和lib族的无毒金属盐，例如碱金属盐，优选钠盐或钾盐，碱土金属盐， 优选钾盐或镁盐，铜盐、铝盐或锌盐，以及与氨或有机胺或季铵碱的铵盐， 所述的氨或有机胺或季铵碱例如游离或C-羟基化的脂肪族胺，优选单-、 二-或三-低级烷基胺(例如甲基胺、乙基胺、二甲基胺或二乙基胺)、单-、 二-或三(羟基-低级烷基)胺(例如乙醇胺、二乙醇胺或三乙醇胺)、三(羟基甲 基)氨基曱烷或2-羟基-叔丁基胺，或N-(羟基-低级烷基)-N，N-二-低级烷基 胺或N-(多羟基-低级烷基)-N-低级烷基胺(例如2-(二甲基氨基)乙醇或D-葡 糖胺)，或季脂肪族氩氧化铵，例如四丁基氢氧化铵。
在该关系中，还应当提及的是式(I)化合物也可以以内盐的形式获得， 条件是基团Rl具有足够的碱性。因此，这些化合物也可以通过用强质子 酸处理转化为相应的酸加成盐，所述的强质子酸例如氢卣酸、硫酸、磺酸(例 如甲磺酸或对甲^t酸)或M磺酸(例如N-环己基M磺酸)。
在一个实施方案中，治疗剂是式(I)化合物，及其盐，特别是内盐和其 与碱的可药用盐，
其中
Rl是咪唑基、吡唑基、2H-l，2，3-三唑基、1H-l，2,4-三唑基或4H-1，2，4-三唑基、四唑基、喁唑基、异鳴唑基、喁二唑基、瘗唑基或瘗二唑基，其 是未取代的或者被一个或两个选自下列的基团C-取代低级烷基、低级烷 氧基、苯基或依次被一个或两个选自低级烷基、低级烷氧基和/或卣素的基 团取代的苯基、羟基、二-低级烷基氨基、低级烷基硫代和/或卣素，和/或 是在N-原子上N-取代的，其可以被低级烷基或苯基-低级烷基(其是未取代 的或者被一个或两个选自低级烷基、低级烷氧基和/或卣素的基团取代)取 代；并且
R2是氢、羟基、氨基、低级烷1^克代或卤素。
在一个实施方案中，治疗剂是式(I)化合物，及其盐，特别是内盐和其 与碱的可药用盐， 其中
Rl是咪唑基、吡唑基、2H-l，2，3-三唑基或4H-l，2，4-三唑基、四唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、噻唑基或噻二唑基，其是未取代的或者被
一个或两个选自下列的基团C-取代低级烷基、低级烷氧基、苯基或依次 被一个或两个选自低级烷基、低级烷氧基和/或卣素的基团取代的苯基、羟 基、二-低级烷基氨基、低级烷l^克代和/或卣素，和/或是在N-原子上N-取代的，其可以被低级烷基或苯基-低级烷基(其是未取代的或者被一个或 两个选自低级烷基、低级烷氧基和/或囟素的基团取代)取代；并且 R2是氢、羟基、氨基、低级烷J^克代或卤素。
在一个实施方案中，治疗剂是式(I)化合物，及其盐，特别是内盐和其 与碱的可药用盐， 其中
Rl是咪唑基(例如咪唑-l-基、咪唑-2-基或咪唑-4-基)、4H-l，2,4-三唑基 (例如4H-l，2，4-三唑-4-基)或瘗唑基(例如瘗唑-2-基)，该基团是未取代的或 者被一个或两个选自下列的基团C-取代CrC4烷基(例如甲基)、C,-C4烷
氧基(例如甲氧基)、苯基、羟基、二-C广C4烷基氨基(例如二甲基氨基或二
乙基氨基)、CrC4烷基硫代(例如甲基硫代)和/或具有至多35(包括35)原子 数的卣素(例如氯)，和/或是在N-原子上N-取代的，其可以被d-C4烷基(例 如甲基)或苯基-CrC4烷基(例如千基)取代；并且 R2优选是羟基或较少优选氢或氨基。
在一个实施方案中，治疗剂是式(I)化合物，及其盐，特别是可药用盐， 其中
Rl是咪哇-2-或-4-基，其是未取代的或者被苯基C-取代或者被d-C4 烷基(例如甲基)C-或N-取代，例如咪唑-2-基、l-C广C4烷基咪唑-2-基(例如 l-甲基咪唑-2-基)，或者2-或5-d-C4烷基咪唑-4-基(例如2-或5-甲基咪唑 -4-基，或者是未取代的噻唑基(例如噻唑-2-基)，或者是1H-l，2，4-三唑基(其 是未取代的或者被d-C4烷基(例如曱基)取代，例如l-C广C4烷基-lH-l，2，4-三唑-5-基(例如l-甲基-lH-l，2，4-三唑-5-基))；并且
R2是羟基或较少优选氢。
在一个实施方案中，治疗剂是式(I)化合物，及其盐，特别是可药用盐， 其中Rl是咪峻陽l画基、p比喳-l-基、lH誦l，2，4画三唑-l-基、4H画l，2,4-三峻-4-基 或四唑-l-基(其是未取代的或者被苯基或d-C4烷基(例如曱基)C-取代)，例 如咪唑-l-基、2-、 4-或5-d-C4烷基咪唑-l-基(例如2-、 4-或5-甲基咪唑-1-基)、p比哇-1-基、3-或4-C广C4烷基吡唑-l-基(例如3-或4-曱基吡唑-l-基)、 111-1，2，4-四唑-1-基、3-(:1-(:4烷基-111-1，2，4-三唑-1-基(例如3-曱基-111-1，2，4-三哇腳l-基)、4H-l，2，4-三唑-l國基、3画d-C4烷基-4H-l，2，4-三唑-4-基(例如3-曱基-4H-l，2，4-三唑-4-基)或1H-四哇-l-基；并且
R2是羟基或较少优选氢。
在一个实施方案中，治疗剂是式(I)化合物，及其盐，特别是可药用盐， 其中
Rl是咪唑基(其是未取代的或者被d-C4烷基(例如甲基)取代)，例如 咪唑-l-基、咪唑-2-基、l-甲基咪唑-2-基、咪唑-4-基或者2-或5-曱基咪唑-4-基；并且
R2是羟基或较少优选氢。
在本发明优选的实施方案中，纳米粒包含用于治疗实体瘤的包埋的药 物，例如喳来膦酸。
纳米粒的外表面可以包含亲水聚合物的表面包衣，所述的亲水聚合物 包含亲水聚合物链，其优选浓密填充以形成有效保护纳米粒表面组分的刷 子样包衣。根据本发明，亲水聚合物链在化学上与纳米粒聚合物连接或者 无需任何化学键而吸附。
纳米粒的外表面可以包含亲和部分，该部分有效与基于纳米粒治疗目 标的靼标、例如生物表面例如细胞膜、细胞基质、组织或或乾表面或耙区 域特异性结合。亲和部分通过共价连接以及与纳米粒的表面组分和/或亲水 聚合物包衣的静电相互作用而与纳米粒外表面结合。亲和部分是有效与靼 标上携带的配体结合分子特异性结合并且具有高亲和力的配体。例如，在 一个实施方案中，亲和部分有效与实体瘤中过表达的肺瘤特异性抗原和/ 或受体结合，并且在另外的实施方案中，亲和部分有效与炎症部位的细胞 结合。在另外的实施方案中，亲和部分是维生素、多肽或多糖或蛋白质效 应器。
12本发明的纳米粒用于给靶标施用治疗剂。治疗剂包埋于纳米粒中。 本发明的纳米粒组合物主要包含聚合物基质。此类聚合物基质的纳米
粒组合物
(a) 可以通过乳化形成；
(b) 沉淀或表面沉积方法；或
(c) 可以通过本领域已知的其它纳米粒制备方法形成。
形成纳米粒基质的聚合物包括聚交酯、聚乙醇酸交酯以及前述聚合物 的共聚物(通常称为聚乳酸乙醇酸或PLGA)、聚氛基酸、聚氨基酸共聚物、 葡糖胺基葡聚糖、富含脂质的(lipidated)葡糖胺基葡聚糖等。
另外，选择聚合物以获得特别程度的流动性或硬度，控制纳米粒在血 浆中的稳定性并且控制纳米粒中包埋的物质的释方文速率。由聚合物确定的 纳米粒的硬度也可以在纳米粒与靶细胞融合中发挥作用，其将在下文中描 述。
本发明的纳米粒可以包含亲水聚合物包衣，该包衣包含与纳米粒表面 连接的聚合物链。所述的亲水聚合物链掺入至纳米粒中，包含约l-20摩尔 百分比的亲水聚合物-聚合物基质结合物。适合用于聚合物包衣的亲水聚合 物包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯基甲基醚、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、 聚羟基丙基^恶唑啉、聚羟基丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲 基丙烯酰胺、聚羟基丙基甲基丙烯酸酯、聚羟基乙基丙烯酸酯、羟曱基纤 维素、羟乙基纤维素、聚乙二醇、聚丙三醇和聚天冬酰胺、透明质酸、聚 氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆)、卵磷脂、聚乙烯醇。
在优选的实施方案中，亲水聚合物是聚乙二醇(PEG)，优选具有 500-10,000道尔顿之间、更优选2,000-10,000道尔顿之间并且最优选 1,000-5,000道尔顿之间分子量的PEG链。
在另外优选的实施方案中，亲水聚合物是聚丙三醇(PG)，优选具有 400-2000道尔顿之间、更优选500-1,000道尔顿之间并且最优选600-700 道尔顿之间分子量的PG链。
本发明的纳米粒组合物可以包含亲和部分。亲和部分通常有效与靼标， 即生物表面例如靶细胞表面或膜、细胞表面受体、细胞基质、斑块区域等
13特异性结合。亲和部分通过直接与聚合物基质的聚合物组分连接或者通过 与亲水聚合物链连接而与纳米粒表面连接，其将在下文描述。
在一个实施方案中，亲和部分是有效在靶区域与受体特异性结合的配 体，更特别的是，它是与靶细胞上的受体结合的配体。适合该目的的配体 的非限制性实例在表1中列出。
表l配体-受体对和相关的耙细胞
叶酸盐叶酸盐受体上皮癌、骨髓干细胞
水溶性维生素维生素受体多种细胞
磷酸吡,醇(PyridoxylCD4CD4+淋巴细胞
phosphate)肝细胞
载脂蛋白血管内皮细胞
胰岛素胰岛素受体
转铁蛋白转移受体内皮细胞(脑)
半乳糖脱唾液酸糖蛋白肝细胞
Sialyl-Lewis*E,P选择蛋白活化的内皮细胞
VEGFFk-1，2肿瘤上皮细胞
碱性FGFFGF受体肿瘤上皮细胞
EGFEGF受体上皮细胞
VCAM-1A^2-整联蛋白血管内皮细胞
ICAM-10^2-整联蛋白血管内皮细胞
PECAM-1/CD31Ov卩3-整联蛋白血管内皮细胞
纤连蛋白OvP3-整联蛋白活化的血小板
骨桥蛋白Ov卩i和OvPs-整联蛋白动脉粥样硬化斑块中
的平滑肌细胞
基质蛋白的RGD序列OCv!33-整联蛋白肿瘤内皮细胞、血管
平滑肌细胞
表1中列出的配体在本发明的一个实施方案中可以用于将纳米粒耙向
至特别的靶细胞。例如，在聚合物基质中与聚合物连接或者与PEG链的末 端连接的叶酸盐配体可以掺入至纳米粒中。本文所用的PEG链指的是具有
14选择长度(分子量)的PEG链以便当配体掺入至纳米粒中时，其通过亲水聚
合物链的表面包衣被掩盖或保护。对于将包埋的治疗剂施用于靼细胞，例
如施用肿瘤剂治疗上皮癌，掺入至纳米粒的表面连接的叶酸盐配体有效与
上皮细胞的叶酸盐受体结合。
亲和部分是具有细胞结合活性的短肽并且有效与配体竟争受体位点。 配体-受体细胞结合事件的抑制引起了感染过程的阻止。
包含包埋的物质的聚合物基质根据众所周知的方法制备，例如上文描 述的那些方法，典型的是乳化、复乳化和微嚢化。待传递的化合物或者包 含在有机介质中(在亲脂化合物的情况中)或者包含在水介质中(在水溶性治 疗剂的情况中)。可选择的是，治疗剂可以在施用于个体之前装入形成的基 质中。
II.纳米粒的制备
A. 可辨，;故的聚合物包衣的制备
亲水聚合物链通过键与纳米粒连接，该键可以响应选择的刺激而裂解。 在一个实施方案中，该键是肽键、酯键或二硫键。
肽-连接的化合物例如通过将聚烷基醚(例如PEG)与胺偶联而制备。末 端带帽的PEG用羰基二咪唑偶联试剂活化，以形成活化的咪唑化合物。然 后，活化的PEG与示例性三肽的N-末端胺偶联。然后，肽胺基可以用于 通过常规的碳二亚胺偶联试剂、例如二环己基碳二亚胺(DCC)将羧基偶联。
酯连接的化合物可以例如通过应用醇通过酸酐偶联试剂将聚合物酸 (例如聚乳酸)与聚烷基醚的末端醇基偶联而制备。可选择的是，包含内酯 键和适合的末端基团(例如伯胺基团)的短键片段可以用于将聚烷基醚与基 质形成聚合物通过酰胺键或氨基曱酸酯键偶联。
B. 亲和部分的连接
如上所述，本发明的纳米粒可以包含与PEG-包衣的纳米粒表面连接 的亲和部分。亲和部分通过与纳米粒表面组分直接连接或通过短的间隔臂 或链与纳米粒连接，这取决于该部分的性质。
可获得多种将分子(例如亲和部分)与聚合物基质的表面连接的方法。 在一个优选的方法中，亲和部分通过下述偶联反应与聚合物偶联以形成亲和部分-聚合物结合物。该结合物用于纳米粒的形成。在另外的方法中，将 活化用于共价连接或亲和部分的其它相互作用(即静电相互作用)的基质形 成聚合物掺入至纳米粒中。
通常，部分与间隔臂的连接可以通过将基质形成聚合物(典型的是
PEG)衍生化而实现。将配体与活化的PEG链连接的方法在本领域中描述 (Allen等人，1995; Zalipsky, 1993; Zalipsky, 1994; Zalipsky, 1995a; Zalipsky, 1995b)。在这些方法中，mPEG的惰性末端曱氧基用适合结合反 应的活化的官能度代替，所述的官能度例如氨基或酰肼基。末端官能的 PEG与脂质、典型的是DSPE连接。官能的PEG-聚合物衍射物应用于纳 米粒的形成并且在纳米粒形成前或后，预期的配体与PEG链的反应性末端 连接。在前述方法中，与聚合物组分共价连接的作用取决于所用的聚合物 而实现。因此，在另外的方法中，双官能聚合物可以用于将一端的華巴部分 与另 一端的电荷部分共价连接。选择电荷部分以便使电荷与用于形成聚合 物基质的聚合物组分的电荷相反。 C.纳米粒的制备
纳米粒可以通过多种技术制备，例如乳化或复乳化。典型的是，将聚 合物溶于有机溶剂中并且将药物溶于有机溶剂或水相中(取决于在这两相 中的相对溶解度)。形成水包油乳化并且溶剂快速^l使聚合物沉淀为纳米 粒。该方法通常可应用在与聚合物相同的溶剂中溶解的疏水药物。对于亲 水药物，可以应用水包油包水复乳化(w/o/w)方法。粒径通过能量输入、例 如通过超声确定。
用于形成本发明的纳米粒的基质聚合物优选以基质的约20-98%存在。 适合制备本发明的纳米粒的另外的纳米粒制备方法是溶剂注入方法。 在该方法中，将溶于溶剂中的聚合物混合物在搅拌下注入至水介质中以形 成纳米粒。通过适合的技术、例如透析或蒸发将溶剂除去。
优选制备具有在选择的粒径范围内的基本均匀粒径的纳米粒，所述的 选择的粒径范围典型的是在约10
nm至约500 nm之间，优选50 nm至约 300 nm并且最优选80 nm至约200 nm。如果希望，可以将纳米粒干燥，例如通过蒸发或冻干并且可以悬浮于 任何预期的溶剂中。当将纳米粒冻干时，在冻干前或在纳米粒形成过程中 可以加入非还原性糖以提供稳定性。此类糖是甘露醇、蔗糖、海藻糖
(trehlaose)。其它稳定剂可以包括氨基酸，例如甘氨酸。
具有二价阳离子基质的纳米粒可以通过在纳米粒制备过程中加入包含
二价阳离子的溶剂而制备。
纳米粒可以通过将溶液温和涡旋而再悬浮于水溶液中。再水化可以在 室温或在其它适合纳米粒和它们的内部成分的组合物的温度下进行。 III.治疗方法
一方面，本发明包括基于纳米粒治疗哺乳动物个体的方法，该方法包 括给个体全身施用纳米粒，所述的纳米粒包含
(i) 二价阳离子基质；和
(ii) 治疗剂。
二价阳离子基质给治疗剂提供了保护，否则该治疗剂在货架上并且一 旦引入至体内可能渗漏出传统的脂质体制剂。另一方面，本发明包括基于 纳米粒治疗哺乳动物个体的方法，该方法包括给个体全身施用纳米粒，所 述的纳米粒包含
(i) 二价阳离子基质；
(ii) 治疗剂；
(iii) 用于稳定性和延长循环的亲水聚合物包衣；和任选
(iv) 有效与治疗目标的靶表面特异性结合的亲和部分。
亲水聚合物包衣包含或者共价连接或者表面吸附于纳米粒中的表面聚 合物组分的聚合物链。施用的纳米粒全身循环直至获得纳米粒的预期的生 物分布，从而将亲和剂暴露于靶表面。
在优选的实施方案中，纳米粒用于治疗实体瘤。纳米粒包含包埋形式 的抗肿瘤药物并且通过有效与肺瘤特异性抗原特异性结合的亲和部分革巴向 于肺瘤区域。例如，纳米粒可以通过在纳米粒中包含VEGF配体而乾向于 肿瘤的血管内皮细胞，用于选择性与Flk-1，2受体(在增殖性肺瘤内皮细胞 中表达)连接。
17在该实施方案中，纳米粒的粒径为约10-200 nm之间、优选50-150 nm 并且最优选80-120 nm。在该粒径范围内的纳米粒显示能够通过肿瘤血管 系统内皮细胞系中存在的"间隙"i^V肿瘤[Yuan等人(1995)。
在一个实施方案中，治疗剂选自式(I)化合物。式(I)化合物及其盐具有 有价值的药理学性质。特别的是，它们对温血动物的钙代谢具有显著的调 节作用。最特别的是，它们在大鼠的骨吸收中发挥显著的抑制作用，其可 以在ActaEndrocinol，第78巻，第613-24页(1975)中描述的试验方法中证 明，通过皮下施用剂量范围为约0.01-1.0 mg/kg后PTH诱导的血浆4丐水平 的增加来证明，以及在TPTX(甲状腺甲状旁腺切除术)的大鼠模型中，通过 皮下施用剂量为约0.0003-1.0 mg后维生素D;j诱导的血钓过多证明。由 Walker 256肺瘤诱导的胂瘤钓血症也在口服施用约1.0-100 mg/kg后被抑 制。另外，当根据Newbould，Brit J Pharmacol,第21巻，第127页(1963) 和Kaibara等人，J Exp Med，第159巻，第1388-96页(1984)在试验方法中 皮下施用剂量为约0.001-1.0 mg/kg时，式(I)化合物及其盐发挥在佐剂性关 节炎的大鼠中显著抑制关节炎病症的进程的作用。因此，它们非常适合用 作治疗以下疾病的药物与钙代i射损伤有关的疾病，例如关节的炎性病症、 骨质疏松症的关节软骨变性过程、牙周炎、甲状旁腺功能亢进和血管或假 体移植物的4丐沉积。在治疗其中观察到溶解性差的钓盐的异常沉积的疾病 中也获得了很好的结果，例如在关节炎疾病、例如强直性脊推炎(ancylosing spondilitis)、神经炎、滑嚢炎、牙周炎和肌腱炎、纤维发育不良、骨关节 炎或动脉硬化，以及那些其中硬的机体组织的异常分解是主要症状的疾病， 例如遗传性低磷酸酯酶症、关节软骨的变性状态、不同起源的骨质疏松、 佩吉特病和纤维性骨营养不良以及肿瘤诱导的溶骨病症。
施用纳米粒、例如静脉内施用纳米粒后并且过去足够时间以^吏纳米粒 分别于个体并且渗入肿瘤中后，纳米粒的亲和部分提供了结合并且内化进 入靶细胞中。在一个实施方案中，亲水表面包衣通过pH敏感键与纳米粒 连接，并且納米粒渗入肿瘤后该键释放，这是由于肿瘤区域的含氧量低的 性质引起的。
从前述，应当理解的是本发明的多种特征和目标是如何实现的。本发明的纳米粒提供了靶向纳米粒的方法。亲水表面包衣降低了纳米粒的摄入， 对于纳米粒的分布实现了长的血液循环时间。分布后，纳米粒连接的亲和 部分以多价存在并且与靶结合。
以下实施例i兌明了制备、表征和应用本发明的纳米粒的方法。实施例 决不旨在限制本发明的范围。尽管本发明已经描述了特别的实施方案，但 是本领域技术人员应当显而易见的是可以进行多种改变和修饰而不脱离本 发明。
实施例
在以下实施例中，通过复乳化方法制备纳米粒。所有的样品通过在水
或5%甘露醇(或其它适合的填充剂，即蔗糖)的存在下超声、蒸发、浓缩和 冻干处理。
其中，以下实施例没有任何二价阳离子而制备并且该制剂提供了在基 质中非常低的药物载量。 实施例A
1. ZOL446 30 mg/mL(2.8。/。PVA/tris緩冲液pH 8)
2. PLGA， 50:50，卯，OOO MW 30 mg/mL(在二氯甲烷中)
3. PVA 3。/。(tris緩冲液pH8+氯化钓) 通过超声将步骤1的药物溶液加入至步骤2的聚合物溶液中。将初乳
加入至步骤3的PVA溶液中并且继续超声。通过蒸发溶剂、洗涤和浓缩收 集纳米粒。在水或5%甘露醇的存在下将产物冻干。 实施例B
1. ZOL446 30 mg/mL(2.8。/。PVA/tris緩冲液pH 8)
2. PLGA， 50:50, 50,000 MW 30 mg/mL(在二氯甲烷中)
3. PVA 3。/。(tris緩冲液pH8+氯化钙) 通过超声将步骤1的药物溶液加入至步骤2的聚合物溶液中。将初乳
加入至步骤3的PVA溶液中并且继续超声。通过蒸发溶剂、洗涤和浓缩收 集纳米粒。在水或5%甘露醇的存在下将产物冻干。 实施例C
1. ZOL446 30 mg/mL(2.8。/。PVA/tris緩冲液pH8)
192. PLGA， 50:50, 10,000 MW 30 mg/mL(在二氯甲烷中)
3. PVA 2。/。(tris緩冲液pH8+氯化钙) 通过超声将步骤1的药物溶液加入至步骤2的聚合物溶液中。将初乳
加入至步骤3的PVA溶液中并且继续超声。通过蒸发溶剂、洗涤和浓缩收 集纳米粒。在水或5%甘露醇的存在下将产物冻干。 实施例D
1. ZOL446 10mg/mL(l。/。PVA/tris緩冲液pH8)
2. PLGA， 50:50, 10,000 MW 50 mg/mL(在乙酸乙酯中)
3. PVA 5。/0(tris緩冲液pH8+氯化钙) 通过超声将步骤1的药物溶液加入至步骤2的聚合物溶液中。将初乳
加入至步骤3的PVA溶液中并且继续超声。通过蒸发溶剂、洗涤和浓缩收 集纳米粒。在水或5%甘露醇的存在下将产物冻干。 实施例E
1. ZOL446 30mg/mL(2.8。/。PVA/tris緩冲液pH8)
2. PLGA， 50:50，卯,000 MW 30 mg/mL(在二氯甲烷中)
3. PVA 3Q/o(tris緩冲液pH8) 通过超声将步骤1的药物溶液加入至步骤2的聚合物溶液中。将初乳
加入至步骤3的PVA溶液中并且继续超声。通过蒸发溶剂、洗涤和浓缩收 集纳米粒。在水或5%甘露醇的存在下将产物冻干。 实施例F
1. ZOL446 10 mg/mL(2.8。/。PVA/tris緩冲液pH 8)
2. PLGA， 50:50， 140,000 MW 50 mg/mL(在乙酸乙酯中)
3. PVA 1。/0(tris緩冲液pH8+氯化钙) 通过超声将步骤1的药物溶液加入至步骤2的聚合物溶液中。将初乳
加入至步骤3的PVA溶液中并且继续超声。通过蒸发溶剂、洗涤和浓缩收 集纳米粒。在水或5%甘露醇的存在下将产物冻干。 实施例G
1. ZOL446 0.4 mg/mL(l。/o泊洛沙姆，0.1 N HC1)
2. PLGA， 50:50， 75,000 MW 4mg/mL(在丙酮中)
203.泊洛沙姆 1%
通过混合将步骤2的聚合物溶液加入至步骤1的药物溶液中。将丙酮 蒸发并且收集纳米粒。在5%甘露醇的存在下将产物冻干。
权利要求
1. 给哺乳动物个体施用治疗剂的方法，该方法包括给个体全身施用纳米粒组合物，该纳米粒组合物包含聚合物基质以及二价阳离子，包含治疗剂。
2. 权利要求l的方法，其中全身施用后聚合物基质不使4丐从周围介质隔离，因此防止了低4丐血症。
3. 权利要求l的方法，其中所述的治疗剂是水溶性的。
4. 权利要求3的方法，其中所述的治疗剂是式(I)化合物及其可药用盐<formula>formula see original document page 2</formula>其中Rl是5-元杂芳基，其包含作为杂原子的2-4个N-原子或者1或2个N-原子以及1个O-或S-原子，并且其是未取代的或者是被以下基团C-取代的低级烷基、苯基或4皮低级烷基、低级烷氧基和/或卣素取代的苯基，或低级烷氧基、羟基、二-低级烷基氨基、低级烷基硫代和/或卣素，和/或是在N-原子上N-取代的，其可以被低级烷基、低级烷氧基和/或卣素取代；并且R2是氬、羟基、氨基、低级烷1^克代或卤素。
5. 权利要求4的方法，其中所述的治疗剂是唑来膦酸。
6. 权利要求l的方法，其中聚合物基质包含钩离子。
7. 权利要求l的方法，其中聚合物基质包含PLGA。
8. 权利要求1的方法，其中纳米粒组合物具有平均粒径为约10纳米(nm)至约500 nm。
9. 权利要求l的方法，其中纳米粒组合物进一步包含亲水聚合物。
10. 权利要求l的方法，其中纳米粒组合物进一步包含亲和部分。
11. 给哺乳动物个体施用治疗剂的方法，该方法包括给个体全身施用纳米粒组合物，该纳米粒组合物包含二价阳离子基质，包含治疗剂。是
12. 权利要求ll的方法，其用于给靶细胞施用治疗剂，其中亲和部分有效与靼细胞上的细胞表面受体特异性结合的配体，并且纳米粒进一步包含包埋形式的治疗剂。
13. 权利要求11的方法，其中亲和部分有效与肿瘤特异性受体和/或抗原特异性结合。
14. 权利要求ll的方法，其中所述的治疗剂是水溶性的。
15. 权利要求ll的方法，其中所述的治疗剂是式(I)化合物及其可药用盐:<formula>formula see original document page 3</formula>，其中Rl是5-元杂芳基，其包含作为杂原子的2-4个N-原子或者1或2个N-原子以及1个O-或S-原子，并且其是未取代的或者是被以下基团C-取代的低级烷基、苯基或被低级烷基、低级烷氧基和/或卣素取代的苯基，或低级烷氧基、羟基、二-低级烷基氨基、低级烷基硫代和/或卣素，和/或是在N-原子上N-取代的，其可以被低级烷基、低级烷氧基和/或卣素取代；并且R2是氯、羟基、 、低级烷1^克代或卣素。
16. 权利要求ll的方法，其中所述的治疗剂是唑来膦酸。
17. 权利要求ll的方法，其中二价阳离子包括钩离子。
18. 权利要求ll的方法，其中聚合物基质包含PLGA聚合物。
19. 权利要求ll的方法，其中纳米粒组合物具有平均粒径为约10nm至约500 nm。
20. 权利要求ll的方法，其中纳米粒组合物进一步包含亲水聚合物。
21. 权利要求ll的方法，其中纳米粒组合物进一步包含亲和部分。
22. 纳米粒组合物，该纳米粒组合物包含二价阳离子基质，包含治疗剂。
23. 权利要求22的组合物，其中所述的治疗剂是水溶性的。
24.权利要求22的组合物，其中所述的治疗剂是式(I)化合物及其可药用盐<formula>formula see original document page 4</formula>其中Rl是5-元杂芳基，其包含作为杂原子的2-4个N-原子或者1或2个N-原子以及1个O-或S-原子，并且其是未取代的或者是被以下基团C-取代的低级烷基、苯基或被低级烷基、低级烷氧基和/或卣素取代的苯基，或低级烷氧基、羟基、二-低级烷基氨基、低级烷基硫代和/或卣素，和/或是在N-原子上N-取代的，其可以被低级烷基、低级烷氧基和/或卣素取代；并且R2是氢、羟基、氨基、低级烷基硫代或卣素。
25. 权利要求22的组合物，其中所述的治疗剂是唑来膦酸。
26. 权利要求22的组合物，其中二价阳离子基质包含钩离子。
27. 权利要求22的方法，其中纳米粒组合物进一步包含亲水聚合物。
28. 权利要求22的方法，其中纳米粒组合物进一步包含亲和部分。
29. 纳米粒组合物，该纳米粒组合物包含(a) 治疗剂；(b) 二价阳离子基质；(c) 亲水聚合物包衣；和(d) 4壬选亲和部分。
30. 权利要求29的纳米粒组合物，其中亲和部分是有效与革巴表面的细胞表面受体特异性结合的配体。
31. 权利要求29的纳米粒组合物，其中亲和部分有效与肺瘤特异性受体和/或抗原特异性结合。
32. 权利要求29的纳米粒组合物，其中所述的治疗剂是水溶性的。
33. 权利要求29的纳米粒组合物，其中所述的治疗剂是式(I)化合物及其可药用盐<formula>formula see original document page 5</formula>，其中Rl是5-元杂芳基，其包含作为杂原子的2-4个N-原子或者1或2个N-原子以及1个O-或S-原子，并且其是未取代的或者是被以下基团C-取代的低级烷基、苯基或被低级烷基、低级烷氧基和/或卣素取代的苯基，或低级烷氧基、羟基、二-低级烷基氨基、低级烷^5克代和/或卣素，和/或是在N-原子上N-取代的，其可以被低级烷基、低级烷氧基和/或卣素取代；并且R2是氩、羟基、氨基、低级烷J^危代或卣素。
34. 权利要求29的纳米粒组合物，其中所述的治疗剂是唑来膦酸。
35. 权利要求29的纳米粒组合物，其中二价阳离子基质包含4丐离子。
36. 权利要求29的纳米粒组合物，其中聚合物基质包含PLGA。
37. 权利要求29的纳米粒组合物，其中纳米粒组合物具有平均粒径为约10 nm至约500 nm。
全文摘要
本发明公开了基于纳米粒治疗哺乳动物个体的方法。该方法应用纳米粒和/或具有外表面的纳米粒，所述的外表面包含有效与治疗目标的生物表面特异性结合的亲和部分以及亲水聚合物包衣。亲水聚合物包衣包含或者与聚合物组分共价连接或者与聚合物组分表面吸附的聚合物链。完成预期的纳米粒生物分布后，亲和剂与靶表面结合并且帮助纳米粒进入。
文档编号A61K9/51GK101500546SQ200780029804
公开日2009年8月5日 申请日期2007年8月15日 优先权日2006年8月17日
发明者J·L·杰林斯基, S·库马尔, S·托梅尔, W-C·谢 申请人:诺瓦提斯公司