一种用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针及其制备方法和用途
【专利摘要】本发明公开了一种用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针及其制备方法和用途，该探针基于多个金纳米颗粒聚集导致吸光值变化。该探针主要有两大部分组成，其一为生物功能化的磁珠纳米微球颗粒，其二为金纳米颗粒复合溶液，其特征为含有检测抗体(Ab2)或核酸适配体及具有生物酶活性物质表面修饰的磁珠纳米颗粒和可被上述酶催化的底物及金纳米颗粒。该超高灵敏度探针能与疾病生物标识物高效识别，附着于磁珠纳米微球颗粒表面的具有生物酶活性物质可以将其可催化的底物降解为带正电的产物，引起多个金纳米颗粒的聚集，从而导致金纳米颗粒溶液吸光值的变化。本发明方法大大提高了疾病生物标识物的检测灵敏度，并同时具有设备简易、操作简单、且能批量检测的优点。
【专利说明】一种用于疾病标志物或病原体检测的超局灵敏度?米针及其制备方法和用途
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针，其制备方法及所属纳米材料用于肿瘤等疾病生物标识物、或其他疾病病原体检测应用，属于生物医学工程以及纳米医学领域。
【背景技术】
[0002]在疾病体外诊断方面，高特异性、高灵敏度和高通量特性的检测技术是人们一直追求的目标。新的快速检测方法的建立，简化了操作流程，降低检测成本，提高了检测的时效性和准确性。人们利用病原体的快速检出技术可以掌握传染病的流行状况，这对及早做出正确的临床决策意义重大，然而目前在临床生物标志物检测上广泛应用的方法是酶联免疫吸附法(以下简称ELISA)，由于其中等程度的敏感性，只有生物标志物的水平已经达到临界阈值浓度后才能检测，限制了其用于疾病早期检测应用。再者，基于聚合酶链式反应(PCR)的检测技术在近几年层出不穷，虽然PCR技术有着超高的灵敏度，然而同时，该技术需要昂贵的实验设备、试剂和技术工人，这些因素大大限制了其广泛应用，尤其是在偏远地区如发展中国家。因此临床上对于可替代PCR技术的超高灵敏检测方法的需求尤为紧迫。正如20世纪70年代的微米技术一样，纳米技术将成为21世纪的主导技术，为生物诊疗领域的发展提供了很大空间。目前光、磁和电响应纳米粒子已经广泛应用于纳米医学、分子影像学等领域。
【发明内容】
[0003]本发明的首要目的在于提供一种用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针；
[0004]本发明的另一目的在于提供一种用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针的制备方法；
[0005]本发明的再一目的是提供一种利用所述的超高灵敏度探针作为疾病标识物或病原体检测系统的应用。
[0006]本发明的目的可以通过如下技术方案实现:
[0007]—种用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针，其特征为含有检测抗体或核酸适配体及具有生物酶活性物质表面修饰的磁珠纳米粒子(0.lmg/ml-5mg/ml,更优选的较窄范围为0.lmg/ml-1.2mg/ml)，和可被上述酶催化的底物(0.1 μ M-100 μ M，更优选的较窄范围为10μΜ-50μΜ)，及金纳米颗粒溶液(ΙηΜ-ΙΟΟηΜ，更优选的较窄范围为InM-1OnM)。
[0008]其中，所述的磁珠纳米微球颗粒包括磁性纳米颗粒、碳纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、乳胶体纳米颗粒、陶瓷纳米颗粒、聚合物纳米颗粒。本发明优选采用磁珠纳米微球颗粒。
[0009]其中，所述的金纳米颗粒包括金纳米粒子、金纳米棒、金纳米星、金纳米囊,金纳米笼或金纳米壳中的至少一种。[0010]其中，所述的抗体或核酸适配体，为一种或多种检测抗体或核酸适配体，其根据检测靶标物质而定。所述的抗体，其为鼠源或人源或羊源或其它动物来源，或为基因工程抗体，如人源抗体、人源化抗体、嵌合抗体或单链抗体等。本发明优选鼠源单克隆抗体。
[0011]其中，所述的将具有酶活性功能的物质与纳米微球颗粒通过化学偶联的方式进行结合，所述偶联可以是炔烃-叠氮法、MBS法、戊二醛法、活泼酯法、碳二亚胺法、卤代硝基苯法及亚胺酸脂法等。本发明优选采用活泼酯法。
[0012]其中，所述的具有酶活性物质包括羧酸酯酶类、硫酯酶类、磷酸单酯酶类磷、磷酸二酯酶类、硫磷酸酯酶等。本发明优选采用乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,以下称AChE)。
[0013]其中，所述的可以被具有酶活性物质所催化的底物包括羧酸酯类、硫酯类、磷酸单酯类、磷酸二酯类、硫磷酸酯类等。本发明优选采用硫代乙酰胆碱(Acetylthiocholine)。
[0014]其中，将抗体或核酸适配体与具有酶活性物质通过化学偶联的方式进行结合，所述偶联可以是炔烃-叠氮法、MBS法、戊二醛法、活泼酯法、碳二亚胺法、卤代硝基苯法及亚胺酸脂法等，本发明优选采用炔烃-叠氮法、活泼酯法。
[0015]用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针制备方法，包括
[0016]I)磁珠纳米微球颗粒溶液中加入过量的酶活性物质，反应0.5-3小时后，分离去除过量的酶活性物质。后加入可发生化学偶联的基团。
[0017]2)将检测抗体或核酸适配体加入化学偶联基团，该基团可与I)中的基团反应。室温下反应0.5-3小时,利用离心方法去除未结合的基团。
[0018]3)将I)与2)分别得到的产物混合，得到生物功能化的磁珠纳米微球颗粒。
[0019]4)混有可被酶活性物质催化的相关底物和金纳米颗粒溶液混合，即得到金纳米颗粒复合溶液。
[0020]5)生物功能化的磁珠纳米微球颗粒和金纳米颗粒复合溶液即组成了用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针。
[0021]更佳地，该用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针的制备方法，包括以下步骤:
[0022]I)取 100 μ L NHS (N-hydroxys μ ccinimide)活化的磁珠纳米颗粒(10mg/mL)于小离心管中，借助于磁力架，用盐酸(lmM，4°C )清洗一遍。后加入100 μ L溶解于PBS中的乙酰胆碱酯酶(lmg/mL)，涡旋混匀30秒。后将该混合物置于振荡器中反应2小时，反应条件为室温。在开始的30分钟，每隔5分钟将小离心管涡旋振荡15秒。剩余的90分钟，每15分钟将小离心管涡旋振荡15秒，从而得到结合了乙酰胆碱酯酶的磁珠纳米颗粒。后加入5 μ LNHS活化的叠氮基团(ImM)，室温反应30分钟，从而得到偶联了叠氮基和乙酰胆碱酯酶的磁珠纳米颗粒。
[0023]2)取ImL检测抗体(lmg/mL)，抗体缓冲环境为PBS (pH = 7.4)，取33 μ LNHS活化的DBCO(dibenzocyclooctyl, IOmM)加入到抗体中，DBCO与抗体的摩尔比为50:1。室温反应30分钟后，加入IMTris-HCl (pH = 8.0)以终止反应，Tris终浓度为50mM，终止反应持续5分钟。即得到偶联了 DBCO的抗体溶液。
[0024]3)取10 μ L偶联了 DBCO的抗体溶液(lmg/mL)加入到ImL偶联了叠氮基和乙酰胆碱酯酶的磁珠纳米颗粒(lmg/mL)中，室温反应2小时，即得到了偶联了抗体和乙酰胆碱酯酶的磁珠纳米颗粒。
[0025]4)硫代乙酰胆碱(20 μ M)和金纳米颗粒(15nm,2.3ηΜ)的混合物即为金纳米颗粒
复合溶液。
[0026]本发明研制出一种用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针及其制备方法。该探针主要有两大部分组成，其一为生物功能化的磁珠纳米微球颗粒，其二为金纳米颗粒复合溶液，其特征为含有检测抗体或核酸适配体及具有生物酶活性物质表面修饰的磁珠纳米粒子和可被上述酶催化的底物及金纳米颗粒。用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针能与疾病标识物或病原体高效识别，附着于磁珠纳米微球颗粒表面的具有生物酶活性物质可以将其可催化的底物降解为带正电的产物，该产物可以引起金纳米颗粒的聚集，从而导致金纳米颗粒溶液吸光值的变化。吸光值变化的程度与样品中的生物标识物的浓度成比例。并且吸光值的变化肉眼可见。
[0027]磁珠纳米颗粒具有较高的惰性，苛刻的环境对其影响小，同时其具有较强的人工可修饰性，在其表面修饰一定的化学基团，从而可以进一步偶联生物活性物质，对其进行功能性改造。磁珠纳米颗粒还具有较大的体表面积，每个磁珠颗粒上可以附着巨大数量的生物活性物质，从而起到信号放大的作用，实现对较低含量靶标物质的检出。在金纳米颗粒溶液中，金纳米颗粒表面附着一层柠檬酸盐，表面带有均匀的负电荷，是金纳米颗粒均匀地分布在溶液中。当有打破这一电荷平衡的物质(带正电荷的物质如巯基基团)出现时，电荷平衡被打破并导致金纳米颗粒的聚集，这个过程可以使得金纳米颗粒溶液从红色变为蓝紫色，同时溶液的吸收光谱发生变化。吸光值变化的程度与样品中的生物标识物的浓度成比例。本发明方法大大提高了疾病生物标识物的检测灵敏度，并同时具有设备简易、操作简单、且能批量检测的优点。
[0028]本发明的有益效果:
[0029]本发明在固相纳米微球上进行生物功能化修饰，附着于其上的大量酶活性物质催化其底物产生可以对金纳米颗粒溶液造成吸光值变化的产物，具有极高的灵敏度，实验证明，相比于ELISA试剂盒，灵敏度提高约IO3倍。
[0030]另外，简单的检测手段也是本发明的一大亮点，肉眼对金纳米颗粒溶液颜色变化的观察与仪器对金纳米颗粒溶液吸光值变化的测量具有极高的符合度，即用肉眼即可观测到极低浓度待检物质的检出。
[0031]再者，该检测探针的检测方法简单，所用试剂耗材成本低，反应载体与ELISA试剂盒相同，微孔板即可满足条件，从而实现对待检物质进行高通量检测，也更利于在临床检测上的推广应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1为生物功能化的磁珠纳米微球颗粒构建示意图。
[0033]图2为乙酰胆碱酯酶催化乙酰胆碱示意图(a)和利用该超高灵敏度探针检测原理图(b)。
[0034]图3为20 μ M硫代乙酰胆碱加入到不同浓度超高灵敏度探针中引起的颜色变化(a)及吸光值的变化(b)及700nm(A700)和520nm(A520)光波长吸光值比值(c)
[0035]图4为20 μ M硫代乙酰胆碱加入到该超高灵敏度检测探针(1.0 X 104particles/mL(以磁珠纳米微球计))引起的金纳米颗粒聚集的透射电镜照片
[0036]图5为标准病原体用该超高灵敏度探针检测的肉眼观测(a)及用该超高灵敏度探针检测的吸光值变化(b)及逆转录聚合酶链式反应(以下简称RT-PCR)检测(c)及ELISA试剂盒检测(d)结果(以肠道病毒71型病毒(以下简称EV71)为例)
[0037]图6为探针检测能力结果图；
[0038]图7为临床样本(EV71感染者、流感患者、健康人群)用该超高灵敏度探针检测(a)和ELISA试剂盒检测结果(b)。
【具体实施方式】
[0039]以下通过具体的制备例和实施例可使本发明得到更清楚地说明:
[0040]一、制备例⑴:以下步骤中的所使用的化学物质为市售商品。
[0041 ] 一种用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针的制备及用于疾病病原体(以EV71为例)的检测方法，包括以下步骤:
[0042]I)取100 μ LNHS活化的磁珠纳米颗粒(10mg/mL)于小离心管中，借助于磁力架，用盐酸(lmM，4°C )清洗一遍。后加入100 μ L溶解于PBS中的乙酰胆碱酯酶(lmg/mL)，涡旋混匀30秒。后将该混合物置于振荡器中反应2小时，反应条件为室温。在开始的30分钟，每隔5分钟将小尚心管润旋振荡15秒。剩余的90分钟，每15分钟将小尚心管润旋振荡15秒，从而得到结合了乙酰胆碱酯酶的磁珠纳米颗粒。后加入5 μ LNHS活化的叠氮基团(ImM)，室温反应30分钟，从而得到偶联了叠氮基和乙酰胆碱酯酶的磁珠纳米颗粒。
[0043]2)取ImL抗EV71的检测抗体(lmg/mL)，抗体缓冲环境为PBS (pH = 7.4)，取33 μ LNHS活化的DB⑶(IOmM)加入到抗体中，DBCO与抗体的摩尔比为50:1。室温反应30分钟后，加入IMTris-HCl (pH = 8.0)以终止反应，Tris终浓度为50mM，终止反应持续5分钟。即得到偶联了 DBCO的抗体溶液。
[0044]3)取10 μ L偶联了 DBCO的抗体溶液(lmg/mL)加入到ImL偶联了叠氮基和乙酰胆碱酯酶的磁珠纳米颗粒(lmg/mL)中，室温反应2小时，即得到了偶联了抗体和乙酰胆碱酯酶的磁珠纳米颗粒(图1)。
[0045]4)硫代乙酰胆碱(20 μ M)和金纳米颗粒(15nm,2.3ηΜ)的混合物即为金纳米颗粒
复合溶液。
[0046]5)将抗 EV71 的捕获抗体(Abl)溶于 100mMNa2C03-NaHC03 (pH9.6)缓冲液中(4 μ g/mL)，取到96孔板孔中(100 μ L/孔)，4°C过夜或常温4小时后，加入PBS冲洗3次，加I %牛血清白蛋白(BSA)进行封闭(37°C，I小时)。
[0047]6)将标准EV71病原体用PBS或者健康人咽拭子样本(以下简称HTS)稀释不同浓度，用单独PBS或HTS作为阴性对照，加入到96孔板孔中(100 μ L/孔)，在37°C下温育I小时。
[0048]7)PBS冲洗3次，每孔加入100 μ L抗体-乙酰胆碱酯酶-磁珠纳米颗粒溶液(0.lmg/mL)，在37°C下温育20分钟。
[0049]8) PBST冲洗3次，每孔加入100 μ L硫代乙酰胆碱(20 μ Μ)和金纳米颗粒(15nm，2.3nM)，用读板仪读取520nm和700nm光波长吸光值。
[0050]制备例(2)[0051]不含有磁珠纳米颗粒微球探针的制备及用于疾病病原体(以EV71为例)的检测方法，包括以下步骤:
[0052]I)取100 μ L溶解于PBS中的乙酰胆碱酯酶(lmg/mL)，加入5 μ LNHS活化的叠氮基团(ImM)，室温反应30分钟。
[0053]2)取ImL抗EV71的检测抗体(lmg/mL)，抗体缓冲环境为PBS (pH = 7.4)，取33 μ LNHS活化的DB⑶(IOmM)加入到抗体中，DBCO与抗体的摩尔比为50:1。室温反应30分钟后，加入IMTris-HCl (pH = 8.0)以终止反应。
[0054]3) Tris终浓度为50mM，终止反应持续5分钟。即得到偶联了 DBCO的抗体溶液取
10μ L偶联了 DBCO的抗体溶液(lmg/mL)加入到ImL偶联了叠氮基和乙酰胆碱酯酶的磁珠纳米颗粒(lmg/mL)中，室温反应2小时，即得到了偶联了抗体和乙酰胆碱酯酶。
[0055]4)硫代乙酰胆碱(20 μ M)和金纳米颗粒(15nm,2.3ηΜ)的混合物即为金纳米颗粒
复合溶液。
[0056]5)将抗 EV71 的捕获抗体(Abl)溶于 100mMNa2C03_NaHC03 (ρΗ9.6)缓冲液中(4 μ g/mL)，取到96孔板孔中(100 μ L/孔)，4°C过夜或常温4小时后，加入PBS冲洗3次，加I %牛血清白蛋白(BSA)进行封闭(37°C，I小时)。
[0057]6)将标准EV71病原体用PBS或者健康人咽拭子样本(以下简称HTS)稀释不同浓度，用单独PBS或HTS作为阴性对照，加入到96孔板孔中(100 μ L/孔)，在37°C下温育I小时。
[0058]7) PBS冲洗3次，每孔加入100 μ L抗体-乙酰胆碱酯酶溶液，在37°C下温育20分钟。
[0059]8) PBST冲洗3次，每孔加入100 μ L硫代乙酰胆碱(20 μ Μ)和金纳米颗粒(15nm，
2.3nM)，用读板仪读取520nm和700nm光波长吸光值。
[0060]二、实施例:
[0061]1、将20μΜ硫代乙酰胆碱加入一种用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针溶液中监测其变化。由于在磁珠纳米微球颗粒上偶联了乙酰胆碱酯酶，加入的硫代乙酰胆碱可以被酶催化降解为硫代胆碱，硫代胆碱会与金纳米表面残留的柠檬酸盐上的负电荷相互作用，电荷平衡被打破，会导致金纳米颗粒的聚集，这个过程可以使得金纳米颗粒溶液从红色变为蓝紫色(图3a)，同时溶液的吸收光谱发生变化(图3b)。在透射电镜的观察下，也可以明显看到金纳米颗粒的聚集(图4)。
[0062]2、用该超高灵敏度探针检测标准病原体，操作步骤见制备例。另与其他检测手段比较。可以看到ELISA试剂盒检测下限约为IO8-1O9拷贝/mL(图5d)，RT-PCR的检测下限约为IO3拷贝/mL(图5c)，该超高灵敏度探针的检测下限约为IO3-1O4拷贝/mL(图5b)，该超高灵敏度探针检测标准病原体结果用肉眼可以观测的检测下限与仪器测量吸光值的变化具有极高的符合度图(5a)。使用该探针检测，仅用肉眼观测就可以达到接近于PCR的检测水平。
[0063]3、用缺失磁珠纳米微球颗粒部分的超高灵敏度探针检测标准病原体，检测步骤与实施例2相同，可以看到此时的探针检测能力约为IO5-1O6拷贝/mL(图6)。
[0064]4、一种用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针检测临床样本(EV71感染者、流感患者、健康人群)，其中临床样本为咽拭子。操作步骤见制备例。所检测的EV71感染者样本为经过RT-PCR确证过的阳性样本，流感患者被确证为感染了甲型流感病毒。从用该探针和利用ELISA试剂盒检测的结果可以明显看出=ELISA试剂盒作为一种中等灵敏度的检测方法，对所有阳性样本均不能检出，对流感患者和健康人群也有较高的特异性(图7b);该用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针由于具有着接近于PCR的检出能力，在34份阳性标本中，检测出28份为阳性，对于5份流感患者和5份健康人群咽拭子标本均检测为阴性，特异性高(图7a)。
[0065]本发明人研制出的一种用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针，该探针具有极高的灵敏度，灵敏度接近于RT-PCR，灵敏度比ELISA试剂盒高约IO3倍，结果判定简单，肉眼即可判定，并且具有优良的特异性。该检测探针的检测方法简单，所用试剂耗材成本低，反应载体与ELISA试剂盒相同，微孔板即可满足条件，从而实现对待检物质进行高通量检测，也更利于在临床检测上的推广应用。本发明所用的磁珠纳米微球颗粒部分亦可缺失，从而使得检测方法更为简单，并具有比ELISA试剂盒灵敏度高约IO2倍的灵敏度。在磁珠纳米微球颗粒部分缺失的情况下，可以将检测抗体或核酸适配体直接标记生物酶活性物质(类似于ELISA试剂盒中的酶标记抗体)，后续检测步骤相同，同样需要加入可以被酶活性物质催化的底物和金纳米颗粒，生成的带正电荷的底物，可以高效的让金纳米颗粒聚集，使得金纳米颗粒溶液吸光值发生变化，从而达到对待检物质的高效检出。虽然缺失了磁珠纳米微球对抗体或核酸适配体的高效富集，损失了一定的灵敏度，但利用金纳米颗粒的信号放大效果，仍然能够达到比ELISA试剂盒灵敏度高约IO2的检测效果。
[0066]本发明所用的磁珠纳米微球颗粒部分包括并不限于磁性纳米颗粒，其他更多可选纳米颗粒包括但不限于碳纳米颗粒、二氧化娃纳米颗粒、乳胶体纳米颗粒、陶瓷纳米颗粒、聚合物纳米颗粒等，制备方法类似。本发明所用的金纳米颗粒包括金纳米粒子、金纳米棒、金纳米星、金纳米囊，金纳米笼或金纳米壳等。其他更多可选酶活性功能的物质包括并不限于乙酰胆碱酯酶等，其他更多可选偶联方法包括并不限于炔烃-叠氮法、活泼酯法等，制备方法类似。
【权利要求】
1.一种用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针，其特征在于，所述的探针包括检测抗体或核酸适配体及0.5mg/ml-5mg/ml具有生物酶活性物质表面修饰的磁珠纳米颗粒,和0.1mM-1OOmM可被上述酶催化的底物,及InM-1OOnM金纳米颗粒溶液；或所述的探针不包括磁珠纳米颗粒，即该探针仅包括检测抗体或核酸适配体及具有生物酶活性物质，和0.1mM-1OOmM可被上述酶催化的底物，及InM-1OOnM金纳米颗粒溶液。
2.如权利要求1所述的用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针，其特征在于，所述的磁珠纳米微球颗粒包括磁性纳米颗粒、碳纳米颗粒、二氧化娃纳米颗粒、乳胶体纳米颗粒、陶瓷纳米颗粒或聚合物纳米颗粒中的至少一种。
3.如权利要求1所述的用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针，其特征在于，所述的具有酶活性物质包括羧酸酯酶类、硫酯酶类、磷酸单酯酶类磷、磷酸二酯酶类、硫磷酸酯酶、乙酰胆碱酯酶中的至少一种。
4.如权利要求1所述的用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针，其特征在于，所述的抗体或核酸适配体，为一种或多种检测抗体或核酸适配体。
5.如权利要求3所述的用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针，其特征在于，可被权利要求3中酶活性物质催化的底物，包括羧酸酯类、硫酯类、磷酸单酯类、磷酸二酷类或硫憐Ife酷。
6.如权利要求1所述的用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针，其特征在于，将具有酶活性功能的物质与纳米微球颗粒通过化学偶联的方式进行结合，所述偶联包括炔烃-叠氮法、MBS法、戊二醛法、活泼酯法、碳二亚胺法、卤代硝基苯法及亚胺酸脂法。
7.如权利要求1所述的用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针，其特征在于，将抗体或核酸适配体与具有酶活性物质通过化学偶联的方式进行结合，所述偶联包括炔烃-叠氮法、MBS法、戊二醛法、活泼酯法、碳二亚胺法、卤代硝基苯法及亚胺酸脂法。
8.如权利要求1所述的用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针制备方法，包括 1)磁珠纳米微球颗粒溶液中加入过量的酶活性物质，反应0.5-3小时后，分离去除过量的酶活性物质，后加入可发生化学偶联的基团； 2)将检测抗体或核酸适配体加入可与I)中所述的基团反应的基团，室温下反应0.5-3小时，利用离心方法去除未结合的基团； 3)将I)与2)分别得到的产物混合，得到生物功能化的磁珠纳米微球颗粒； 4)混有可被酶活性物质催化的相关底物和金纳米颗粒溶液混合，即得到金纳米颗粒复合溶液； 5)生物功能化的磁珠纳米微球颗粒和金纳米颗粒复合溶液即组成了用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针。
9.如权利要求8所述的用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针制备方法，包括: DNHS活化的磁珠纳米微球颗粒溶液中加入过量的乙酰胆碱酯酶，反应0.5-3小时后，分离去除过量的乙酰胆碱酯酶，后加入NHS活化的叠氮基团； 2)将检测抗体或核酸适配体与NHS活化的DBCO混合，室温下反应30分钟，用三羟甲基氨基甲烷终止该反应，终止反应5分钟；利用膜过滤技术将抗体或核酸适配体与未结合的DBCO分离； 3)磁珠纳米微球颗粒-乙酰胆碱酯酶-叠氮基复合物溶液中加入结合了DBCO的检测抗体或核酸适配体溶液，得到纳米微球颗粒-乙酰胆碱酯酶-检测抗体或核酸适配体复合物，即生物功能化的纳米微球颗粒； 4)混有可被乙酰胆碱酯酶催化的硫代乙酰胆碱和金纳米颗粒溶液混合，即得到金纳米颗粒复合溶液； 5)生物功能化的磁珠纳米微球颗粒和金纳米颗粒复合溶液即组成了用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针。
10.如权利要求1所述的用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针的用途，其用于疾病生物标识物 或病原微体检测或制备检测试剂。
【文档编号】G01N21/31GK103926246SQ201410171736
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月25日 优先权日:2014年4月25日
【发明者】刘刚, 陈小元, 刘定斌, 王占通, 杨彩霞 申请人:厦门大学