的引物：为 SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2 和 SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4,命名为 A19-F、A19-R 和 S2-F、 S2-R，序列如下：
[0068] A19-F :5,-TTCACCGTCATCGGATAATAGGTGCCA-3'
[0069] A19-R :5'-GGCGGGCTGCATTCTTTACTCTGC-3'
[0070] S2-F :5,-CCTGCTGAGCGATGACCACCA-3'
[0071] S2-R : 5'-CCGCCAGAACATGCGATTTGA-3'
[0072] ②PCR反应液的配制：PCR反应液由牛种布鲁氏菌A19疫苗株或猪种布鲁氏菌S2 疫苗株的引物和含有dNTPs、Mg 2+、双蒸水（CldH2O)的PCR缓冲液组成，PCR反应液的总体积为 44. 5 μ L，每条引物的量为2 μ L(引物浓度为10 μ m〇L/L)，含有dNTPs、Mg'双蒸水（CldH2O) 的PCR缓冲剂的总量为40. 5 μ L，其中双蒸水（CldH2O)为27. 5 μ L。
[0073] (2)阳性质控标准品的制备：
[0074] ①模板DNA的提取：分别对牛种布鲁氏菌疫苗株Α19和猪种布鲁氏菌疫苗株S2的 菌液应用细菌DNA提取试剂盒提取DNA。
[0075] ②PCR扩增：以提取的DNA为模板，按照PCR反应体系：DNA模板5 μ L、DNA聚 合酶0.5以1^、？〇?反应液44.5以1^，？〇?反应条件为：941€3111丨11，94 1€3086(3、601€3086(3、 72°C 30sec，35个循环，72°C 10min，在PCR仪上扩增目的片段，以1. 5%的琼脂糖凝胶电泳 (120V 25min)鉴定PCR目的产物。
[0076] ③重组质粒的构建及阳性质控标准品的建立：将PCR产物进行凝胶纯化回收，然 后连接PEASY-T3载体，转化，提取质粒后双酶切鉴定，将阳性重组质粒进行测序，并进行序 列比对。序列正确的重组质粒即为获得的阳性质控标准品。
[0077] 所说的阳性质控标准品包括牛种布鲁氏菌A19疫苗株阳性质控标准品和猪种布 鲁氏囷S2疫苗株阳性质控标准品。
[0078] 所说的牛种布鲁氏菌A19疫苗株阳性质控标准品由含有562个碱基的核苷酸片段 连接到PEASY-T3载体后的重组质粒构成，所说的猪种布鲁氏菌S2疫苗株阳性质控标准品 由含有539个碱基的核苷酸片段连接到pEASY-T3载体后的重组质粒构成。
[0079] (3)阴性质控标准品：阴性质控标准品为无菌双蒸水，体积为5yL。
[0080] 实施例三、布鲁氏菌疫苗株鉴别试剂盒特异性试验
[0081] 采用本发明的PCR试剂盒分别对牛种布鲁氏菌A19、猪种布鲁氏菌S2、羊种布鲁 氏菌M5-90、绵羊种布鲁氏菌63/290株，犬布鲁氏菌RM6/66株，大肠杆菌0157:H7、小肠结 肠炎耶尔森菌0:9、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、牛分支杆菌基因组DNA进行扩增，并设阳性 与阴性对照，验证PCR反应的特异性，PCR反应条件为：94°C 5min，94°C 30sec、60°C 30sec、 72°C30sec，35个循环，72°C lOmin。反应结束后再进行PCR产物的纯化与测序。
[0082] 牛种布鲁氏菌A19疫苗株鉴别特异性结果如图1所示，琼脂糖凝胶电泳结果中：+ 为阳性质控标准品，1-5 :分别为牛种布鲁氏菌A19、猪种布鲁氏菌S2、羊种布鲁氏菌M5-90、 绵羊种布鲁氏菌63/290株，犬布鲁氏菌RM6/66株均扩增出562bp的条带，而-、6_10 :分 别为阴性质控标准品、大肠杆菌〇157:H7、小肠结肠炎耶尔森菌0:9、沙门氏菌、金黄色葡萄 球菌和牛分支杆菌均无条带。序列测定后序列与峰图比对结果如图3所示，只有A19疫苗 株344点处存在7个核苷酸序列（AGATTTC)的缺失（图3-A)，其他布鲁氏菌株与疫苗株结 果均为图3-B所示。
[0083] 猪种布鲁氏菌S2疫苗株鉴别特异性结果如图2所示，琼脂糖凝胶电泳结果中：+ 为阳性质控标准品，1-5 :分别为猪种布鲁氏菌S2、牛种布鲁氏菌A19、羊种布鲁氏菌M5-90、 绵羊种布鲁氏菌63/290株，犬布鲁氏菌RM6/66株均扩增出539bp的条带，而-、6-10 :分 别为阴性质控标准品、大肠杆菌〇157:H7、小肠结肠炎耶尔森菌0:9、沙门氏菌、金黄色葡萄 球菌和牛分支杆菌均无条带。序列测定后序列与峰图比对结果如图4所示，只有S2疫苗株 在369位点处存在25个核苷酸序列（TCCCTCATAAATGGCTTTCTTCATA)的缺失（图4, A)，其 他布鲁氏菌株与疫苗株结果均为图4-B所示。
[0084] 实施例四、布鲁氏菌阳性临床样本疫苗株的鉴别
[0085] 分别对本实验室保存的布鲁氏菌阳性样本（已经经过PCR扩增测序验证），包括2 份血液样本、2份奶样、2份流产胎儿组织样本以及2份不同奶牛养殖场的牛舍气溶胶样本 进行疫苗株的鉴别，结果如下表所示。
[0086]
【主权项】
1. 一种用于鉴别布鲁氏菌野生菌与疫苗株A19和S2的引物组，其特征在于，包括：用 于鉴别布鲁氏菌疫苗株A19的引物SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2,用于鉴别布鲁氏菌疫苗株 S2 的引物 SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4。2. 权利要求1所述的引物组用于制备鉴别和/检测布鲁氏菌的试剂盒、芯片的应用。3. 包括权利要求1所述的引物组的试剂盒。4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括：PCR反应液、DNA聚合酶、阳性 质控标准品和阴性质控标准品。5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控标准品包括牛种布鲁氏 菌A19疫苗株阳性质控标准品和猪种布鲁氏菌S2疫苗株阳性质控标准品。6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述牛种布鲁氏菌A19疫苗株阳性质控 标准品由SEQ ID NO. 5所示核苷酸片段与pEASY-T3构成的重组质粒组成，所述猪种布鲁氏 菌S2疫苗株阳性质控标准品由SEQ ID NO. 6所示核苷酸片段与pEASY-T3构成的重组质粒 组成。7. -种用于鉴别布鲁氏菌的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 提取待测样本的基因组DNA ; (2) 以提取的样本基因组DNA为模板，进行PCR扩增，所采用的引物为鉴别布鲁氏菌疫 苗株A19的引物SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2,和/鉴别布鲁氏菌疫苗株S2的引物SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4 ; (3) 取PCR产物，以琼脂糖凝胶电泳进行检测，观察是否出现牛种布鲁氏菌疫苗株A19 引物对扩增出的562bp及与之大小对应的条带，和/猪种布鲁氏菌疫苗株S2扩增出的 539bp及与之大小对应的条带； (4) 如果上述PCR检测结果与目的条带不符，则说明模板为布鲁氏菌阴性，目的条带相 符，则为布鲁氏囷。8. -种鉴别布鲁氏菌野毒株与疫苗株A19和S2的方法，其特征在于， (1) 提取待测样本的基因组DNA (2) 以提取的样本基因组DNA为模板，进行PCR扩增，所采用的引物为权利要求1所述 的引物组； (3) 取PCR产物，以琼脂糖凝胶电泳进行检测，观察是否出现牛种布鲁氏菌疫苗株A19 引物对扩增出的562bp及与之大小对应的条带，和猪种布鲁氏菌疫苗株S2扩增出的539bp 及与之大小对应的条带； (4) 如果上述PCR检测结果与目的条带不符，则说明模板为布鲁氏菌阴性，如果PCR检 测条带大小正确，则对阳性条带进行切胶回收纯化，然后再进行序列测定； (5) 结果判定：A19疫苗株鉴别结果判定，对使用SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2引物 对纯化的562bp或与之大小对应的产物进行测序，如果测序结果峰图为单一峰，与SEQ ID No. 5比对后完全匹配，则该样本为A19疫苗株；如果测序结果峰图为单一峰，与SEQ ID No. 5比对后在第344位点处多出7个核苷酸序列，则该样本为除A19疫苗株以外的其他布 鲁氏菌野毒株或疫苗株；如果测序结果与SEQ ID No. 5比对，在峰图的序列第354位后，即 AGATTTCAGA后，出现套峰，则该样本为A19疫苗株和其他布鲁氏菌株混合； S2疫苗株鉴别结果判定，对使用SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4引物对纯化的539bp及 与之大小对应的产物进行测序，如果测序结果峰图为单一峰，与SEQ ID No. 6比对后完全匹 配，则该样本为S2疫苗株；如果测序结果峰图为单一峰，与SEQ ID No. 6比对后在第369位 点处多出25个核苷酸序列，则该样本为除S2疫苗株以外的其他布鲁氏菌野毒株或疫苗株； 如果测序结果与SEQ ID No. 6比对，在峰图序列第369位点后出现套峰，则该样本为S2疫 苗株和其他布鲁氏菌株混合。9. 权利要求7或8所述方法，其特征在于，所述待测样本为血液、奶样、组织样本、气溶 胶样本。10. 权利要求7或8所述方法，其特征在于，PCR扩增条件为：94°C 3min，94°C 30sec、 6(TC 30sec、72°C 30sec，35 个循环，72°C IOmin0
【专利摘要】本发明涉及一种鉴别布鲁氏菌野毒株与疫苗株A19和S2的试剂盒，其中包括用于鉴别布鲁氏菌疫苗株A19的特异性引物对SEQ？ID？No.1和SEQ？ID？No.2；用于鉴别布鲁氏菌疫苗株S2的特异性引物对SEQ？ID？No.3和SEQ？ID？No.4；使用该试剂盒在通过PCR扩增-电泳检测区分布鲁氏菌和其他常规细菌菌株后，对于PCR扩增产物进一步测序分析，通过测序结果能够快速有效的鉴别诊断临床样本中布鲁氏菌A19和S2疫苗株。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105018489
【申请号】CN201510483012
【发明人】何洪彬, 赵贵民, 王洪梅
【申请人】山东省农业科学院奶牛研究中心
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年8月7日