河八王的一种dna指纹图谱及其获取方法与专用引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，尤其涉及河八王的一种DNA指纹图谱及其获取方法与 专用引物。
【背景技术】
[0002] 甘蔗是我国最主要的糖料作物，蔗糖产量占全国食糖总产量的90%以上，在数 十年"高贵化"育种进程中，甘蔗遗传基础变得逐渐狭窄。因此，加大力度利用甘蔗野 生资源拓宽甘蔗遗传基础被认为是甘蔗育种获突破的关键途径之一。河八王[Narenga porphyrocoma(Hance)Bor]是河八王属（Narenga Bor)的一个野生种，又名草鞋密，具有耐 瘦、耐旱、粗生、早熟、分蘖力强等优良性状。传统的育种选择是对表型性状的变异进行选 择，但有些重要性状无法在早期检测出来，分子标记技术就可以利用幼苗进行DNA多态性 检测，根据与目的基因相关的标记进行选择，能提高选择的准确度，缩短育种周期，提高育 种效率和选择的可靠性，相当简便。
[0003] 扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP)是基于 PCR技术扩增基因组DNA限制性片段，基因组DNA先用限制性内切酶切割，然后将双链接头 连接到DNA片段的末端，接头序列和相邻的限制性位点序列，作为引物结合位点。它结合了 RFLP和PCR技术特点，具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性。AFLP目前广泛用于 植物群体遗传分析及系统发育分析研究，在更高分类水平和自然植物群体间基因漂移研究 上特别有用。现有技术构建作物基因组DNA指纹图谱使用的方法主要是分子标记结合聚丙 烯凝胶电泳检测法，存在着谱带数偏少，需要用到较多的引物的问题，为了有效利用河八王 的丰富资源，需要建立河八王的AFLP分子标记技术体系。
【发明内容】
[0004] 针对上述技术问题，本发明提供了河八王的一种DNA指纹图谱及其获取方法与专 用引物。
[0005] 对此，本发明所采用的技术方案为：
[0006] -种获取河八王DNA指纹图谱的专用引物，由引物对Narenga 1、引物对Narenga 2、引物对Narenga 3组成；
[0007] 所述Narenga 1是序列表的SEQ NO :1和SEQ NO : 2组成的引物对；
[0008] 所述Narenga 2是序列表的SEQ NO :3和SEQ NO :4组成的引物对；
[0009] 所述Narenga 3是序列表的SEQ NO :5和SEQ NO :6组成的引物对。
[0010] Narenga 1 ：
[0011] 正向引物：GAC TGC GTA CCA ATT CACG(SEQ NO :1)
[0012] 反向引物：GAT GAG TCC TGA GTA ACAT(SEQ NO :2)
[0013] Narenga 2 ：
[0014] 正向引物：GAC TGC GTA CCA ATT CACG(SEQ NO :3)
[0015] 反向引物：GAT GAG TCC TGA GTA ACAG(SEQ NO :4)
[0016] Narenga 3 ：
[0017] 正向引物：GAC TGC GTA CCA ATT CAAC(SEQ NO :5)
[0018] 反向引物：GAT GAG TCC TGA GTA ACAC(SEQ NO :6)
[0019] 本发明还提供了一种获取河八王DNA指纹图谱的方法，包括如下步骤：
[0020] 步骤Sl :提取河八王的基因组DNA ;
[0021] 步骤S2 :采用内切酶EcoR I和Mse I对所述河八王的基因组DNA进行酶切，得到 酶切产物；
[0022] 步骤S3 :将所述酶切产物连接上接头引物，扩增得到连接产物；所述接头引物为 SEQ NO :7 和 SEQ NO :8, SEQ NO :9 和 SEQ NO : 10 ;具体为：
[0023] E-F :5' -CTCGTAGACTGCGTACC-3' (SEQ NO ： 7)和 E_R:5' -AATTGGTACGCAGTC-3'（SEQ N0:8) ;M-F:5' -GACGATGAGTCCTGAG-3'（SEQ N0:9)和]?-1?:5'-TACTCAGGACTCAT-3' （SEQ N0:10)
[0024] 步骤S4 :预扩增反应，采用预扩增引物对所述连接产物进行预扩增反应，其中，所 述预扩增引物为SEQ NO :11和SEQ NO : 12 ;
[0025] E-P:5' -GACTGCGTACCAATTCA-3'（SEQ NO :11)
[0026] M-P:5'-GATGAGTCCTGAGTAAC-3'（SEQ NO :12)
[0027] 步骤S5 :选择性扩增反应，采用权利要求1所述的引物对Narenga 1、引物对 Narenga 2和引物对Narenga 3进行选择性扩增，得到AFLP扩增产物；
[0028] 步骤S6 :对所述AFLP扩增产物进行毛细管电泳检测扩增产物，分离DNA标记，显 示河八王的DNA指纹图谱。
[0029] 作为本发明的进一步改进，步骤S4中，所述预扩增反应程序为预变性94°C 30s， 56°C 30s，72°C 80s，循环 30 次。
[0030] 作为本发明的进一步改进，所述预扩增反应体系为：10ng/yl的DNA 2μ1， Pre-ampmix 1 μ l，2.5mM dNTPs 0.5 μ 1，10XPCR buffer 2.5 μ 1，Taq DNA polymease 0· 5 μ 1，ddH20 18. 5 μ I ;
[0031] 作为本发明的进一步改进，步骤S5中，所述选择性扩增反应程序为预变性94°C变 形30s，65°C退火30s，72°C延伸80s，1个循环；然后以每循环复性温度逐级降低0. 7°C梯度 进行14个循环；最后以94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸80s，循环23次。
[0032] 作为本发明的进一步改进，所述选择性扩增反应体系为：预扩增稀释样品 2 μL，10XPCR buffer 2.5 μL，2. 5mM dNTPs 0.5 μL，正向引物（IOmM) ΙμL，反向引物 (IOmM) 1 μ 1，Taq DNA polymease 0· 5 μ 1，ddH20 17. 5 μ 1〇
[0033] 作为本发明的进一步改进，所述河八王的基因组DNA来自河八王的任何部位。
[0034] 作为本发明的进一步改进，所述河八王的基因组DNA来自河八王的叶片。
[0035] 本发明还提供了一种获取河八王DNA指纹图谱的试剂盒，其特征在于：所述试剂 盒含有权利要求1所述的引物对Narenga 1、引物对Narenga 2和引物对Narenga 3三个引 物对，即 SEQ NO :1 和 SEQ NO :2 引物对、SEQ NO :3 和 SEQ NO :4 引物对和 SEQ NO :5 和 SEQ NO :6引物对。
[0036] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0037] 第一，采用本发明技术方案的获取河八王DNA指纹图谱的专用引物所获得的河八 王DNA指纹图谱的多态性高、特异性好，重复性好；谱带在IOObp~400bp之间，分布集中、 均匀，便于鉴别；
[0038] 第二，构建的河八王基因组DNA指纹图谱具有唯一性，能够有效而精确的鉴别不 同的河八王种质资源。
[0039] AFLP标记本身是检测性灵敏的技术，本发明结合使用了毛细管电泳技术，使得结 果更灵敏、精确；进一步利用3对专用引物就已能获得104条谱带，可有效构建河八王基因 组DNA指纹图谱。根据概率公式l/2n可知，带型全部相同的概率为4. 93X 10 32,置信概率 达99. 99%，具有唯一性。
【附图说明】
[0040] 图1是本发明一种实施例的引物Narenga 1对河八王广西河1的毛细管电泳结 果；
[0041] 图2是本发明一种实施例的引物Narenga 2对河八王广西河1的毛细管电泳结 果；
[0042] 图3是本发明一种实施例的引物Narenga 3对河八王广西河1的毛细管电泳结 果；
[0043] 图4是本发明一种实施例的利用3对AFLP专用引物构建的河八王种质资源分子 身份证，图中，黑框表示谱带存在，1-15分别代表15份河八王种质资源编号；E5/M3为引物 对 Narenga 1，E5/M2 为引物对 Narenga 2 :E1/M1 为引物对 Narenga 3。
【具体实施方式】
[0044] 下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。
[0045] 材料：从广西不同生态地区采集河八王无性系15份，如表1所示。同时利用GPS 仪器测量采集点的海拔和经炜度，供试材料保存于广西农业科学院甘蔗研究所种质资源圃 内。
[0046] 表1 15份河八王种质资源的名称及来源
[0048] 操作流程：提取基因组DNA - AFLP扩增一毛细管电泳一统计分析一获得DNA指纹 图谱。具体方法和过程如下：
[0049] 步骤Sl :河八王基因组DNA提取及纯度检测：
[0050] 分别取植物材料生长良好的幼嫩叶片，采用SDS方法分别提取其基因组DNA作为 模板，并用1 %琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度，放置于4°C冰箱保存