一种猪圆环病毒Ⅱ型灭活疫苗组合物及制备方法
【专利摘要】本发明提出了一种猪圆环病毒Ⅱ型灭活疫苗组合物及制备方法，解决了现有技术中猪圆环病毒2型疫苗成本高、效力低的问题，一种猪圆环病毒Ⅱ型灭活疫苗组合物，所述组合物由以下组分组成：猪圆环病毒Ⅱ型灭活病毒液、中草药佐剂、化学类佐剂，其中所述中草药佐剂由人参、杜仲叶、当归多糖，所述化学类佐剂为白油、吐温20、司盘80、硬质酸铝，所述猪圆环病毒Ⅱ型毒株灭活病毒液与所述中草药佐剂的质量比为1:2～2:1，本发明提出了制备疫苗的方法，将发挥免疫作用的中草药佐剂与猪圆环病毒Ⅱ型灭活病毒液混合均匀，使得疫苗的效力更高，成本低，抗原物质混合佐剂注入机体后，改变了抗原的物理性质，可使抗原物质缓慢的释放，延长了抗原的作用时间。
【专利说明】
一种猪圆环病毒Π 型灭活疫苗组合物及制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及猪用疫苗领域，特别是指一种猪圆环病毒Π 型灭活疫苗组合物及制备 方法。
【背景技术】
[0002] 猪圆环病毒2型(PCV2)是引起猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原。自 1991年在加拿大猪群中暴发以来，PMWS给全世界养猪业造成了巨大的经济损失。PCV2还与 增生性坏死性肺炎、母猪繁殖障碍、猪皮炎与肾病综合征和猪呼吸道疾病综合征相关。据估 计，PCV2相关性疾病(PCVD)，主要是PMWS，在2014年给欧洲造成的损失高达6亿欧元，PCVD同 样给我国养猪业造成了严重的经济损失。
[0003] 目前，传统的PCV2疫苗通常由灭活或被杀死或经修饰的活致病微生物的粗制备物 组成，向疫苗中加入较小剂量的佐剂，来刺激类似的免疫应答，从而减少疫苗的制造成本。 因此，当将疫苗与佐剂组合时可显著增加注射疫苗的效力。
【发明内容】
[0004] 本发明提出一种猪圆环病毒Π 型灭活疫苗组合物及制备方法，解决了现有技术中 猪圆环病毒2型疫苗成本高、效力低的问题。
[0005] 本发明的技术方案是这样实现的：一种猪圆环病毒Π 型灭活疫苗组合物，其特征 在于，所述组合物由以下组分组成:猪圆环病毒Π 型灭活病毒液、中草药佐剂、化学类佐剂， 其中所述中草药佐剂由黄芪多糖、人参、杜仲叶、当归多糖组成，所述化学类佐剂为白油、吐 温20、司盘80、硬质酸铝，所述猪圆环病毒Π 型毒株灭活病毒液与所述中草药佐剂的质量比 为1:2~2:1〇
[0006] 作为优选的技术方案，所述组合物包含以下重量份的原料：
[0007] 20~25份黄芪多糖、10~15份人参、3~6份杜仲叶、20~30份当归多糖、30~50份 猪圆环病毒Π 型灭活病毒液、18~24份白油、12~15份吐温20、6~10份司盘80、4~7份硬质 酉支错。
[0008] 作为优选的技术方案，所述猪圆环病毒Π 型灭活病毒液的毒价为105.5TCID50/ mL〇
[0009] 免疫佐剂的选择对疫苗的效力影响很大，它既可改变免疫反应类型，使体液免疫 转变为细胞免疫，改变免疫球蛋白的种类和亚类，还可改变免疫反应状态，消除免疫耐受性 而产生免疫反应。因此，选择合适的免疫佐剂显得非常重要。
[0010] 本发明的中草药佐剂选用黄芪多糖、人参、杜仲叶、当归多糖，黄芪多糖主要通过 刺激抗原递呈细胞的增殖分化和释放细胞因子来提高机体的免疫力，人参中的活性成分为 皂苷，皂苷能刺激抗原递呈细胞的增殖分化和释放细胞因子来提高机体的免疫力。杜仲叶 为益精气类中草药，可消除机体免疫耐受性而产生免疫反应，当归多糖由葡萄糖、阿拉伯糖 和少量糖醛组成，当归多糖不是直接作用于淋巴细胞，而是在体内首先作用于非特异性免 疫细胞如DC使其得到活化、功能增强，再作用于各种免疫效应细胞。
[0011]硬质酸铝作为佐剂，其作用机理:在黏附抗原后，改变抗原的物理性状，形成库效 应，延长抗原递呈细胞(APC)对抗原的摄取、加工、处理的时间，使免疫细胞对该抗原保持长 时间高水平的应答。
[0012] 吐温20是水相，司盘80是乳化剂，白油作为油相，其作用机制是抗原包被在油相形 成的微结构内，使之形成贮存库而缓慢释放，刺激B淋巴细胞产生抗体。
[0013] 本发明又提出一种猪圆环病毒Π 型灭活疫苗组合物的制备方法，包括以下步骤：
[0014] 1)将中草药佐剂的活性成分进行提取，后用生理盐水溶解，过滤后制成待用液；
[0015] 2)制备猪圆环病毒Π 型灭活病毒液，将所述猪圆环病毒Π 型灭活病毒液加至所述 待用液中，搅拌均匀；
[0016] 3)向白油中添加司盘80和硬质酸铝制成油相混合物，将作为水相的吐温20与所述 油相混合物混匀，得混合液；
[0017] 4)将步骤2)中的产物加入到所述混合液中，离心乳化3min，即得成品。
[0018] 作为优选的技术方案，步骤2)中制备猪圆环病毒Π 型灭活病毒液的过程中包括设 计三对引物用于扩增猪圆环病毒Π 型毒株的全基因序列，所述三对引物分别是：
[0019] PCV2-F1 的基因序列为5，-TGCAGAAGCGTGATTGGAAGAC-3,，
[0020] ?(^2-1?1的基因序列为5，-01^^0：1'111^^了厶了厶0^1'(：-3，；
[0021] ?(^2+2的基因序列为5'-厶6660^6厶厶1'11^厶0：1'1'1'-3'，
[0022] ?(^2-1?2的基因序列为5，-1^0^〇厶6厶61'(：1^厶6了厶6厶-3'；
[0023] PCV2-F3的基因序列为5，-AGGGCCAGAATTCAACCTTAACCTTC-3，，
[0024] ?(^2-1?3的基因序列为5，-6176厶厶1'1'(^66〇0^6(^0：01^1'-3'。
[0025] 本发明提出了制备疫苗的方法，将发挥免疫作用的中草药佐剂与猪圆环病毒Π 型 灭活病毒液混合均匀，使得疫苗的效力更高，成本低，为了让硬质酸铝更好的溶于白油中， 加入了作为乳化剂的司盘80,然后再将白油与吐温20混合，形成油包水型佐剂，与抗原、中 药佐剂混合，抗原物质混合佐剂注入机体后，改变了抗原的物理性质，可使抗原物质缓慢的 释放，延长了抗原的作用时间。
【附图说明】
[0026] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可 以根据这些附图获得其他的附图。
[0027]图1为PCR产物电泳结果；
[0028] 图2为PCV2全基因 Η扩增图；
[0029] 图3为PCV2全基因 Η扩增图。
【具体实施方式】
[0030]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
[0031 ] -种猪圆环病毒Π 型灭活疫苗组合物，其特征在于，所述组合物由以下组分组成： 猪圆环病毒Π 型灭活病毒液、中草药佐剂、化学类佐剂，其中所述中草药佐剂由黄芪多糖、 人参、杜仲叶、当归多糖，所述化学类佐剂为白油、吐温20、司盘80、硬质酸铝，所述猪圆环病 毒Π 型毒株灭活病毒液与所述中草药佐剂的质量比为1:2~2:1。
[0032] 本发明优选所述猪圆环病毒Π 型毒株灭活病毒液与所述中草药佐剂的质量比为 1:1〇
[0033] 作为优选的技术方案，所述组合物包含以下重量份的原料：
[0034] 20~25份黄芪多糖、10~15份人参、3~6份杜仲叶、20~30份当归多糖、30~50份 猪圆环病毒Π 型灭活病毒液、18~24份白油、12~15份吐温20、6~10份司盘80、4~7份硬质 酉支错。
[0035]作为优选的技术方案，所述猪圆环病毒Π 型灭活病毒液的毒价为105'5TCID50/m L〇
[0036] 本发明又提出一种猪圆环病毒Π 型灭活疫苗组合物的制备方法，包括以下步骤：
[0037] 1)将中草药佐剂的活性成分进行提取，后用生理盐水溶解，过滤后制成待用液；
[0038] 2)制备猪圆环病毒Π 型灭活病毒液，将所述猪圆环病毒Π 型灭活病毒液加至所述 待用液中，搅拌均匀；
[0039] 3)向白油中添加司盘80和硬质酸铝制成油相混合物，将作为水相的吐温20与所述 油相混合物混匀，得混合液；
[0040] 4)将步骤2)中的产物加入到所述混合液中，离心乳化3min，即得成品。
[0041] 本发明制备猪圆环病毒Π 型病毒的具体方法：
[0042] 1、病毒分离培养
[0043] 取疑似PCV2感染猪肺脏或淋巴结，加 DMEM研磨，0.22μπι滤膜过滤除菌接种于单层 ΡΚ-15细胞，孵育lh后弃上清，继续培养，盲传20代。反复冻融细胞收集病毒。
[0044] 2、用于全基因组扩增的引物设计与合成
[0045] 设计三对引物PCV2-F1/RUPCV2F2/R2及PCV2F3/R3三对引物（见表1)用于扩增 PCV2全基因组。
[0046] 表1引物及序列
[0047]
[0048] 3、病毒DNA提取
[0049] 根据病毒DNA提取试剂盒使用说明书进行操作，步骤如下：
[0050] 取300yL细胞悬液加入2倍体积的BufferPLY。混合均匀，室温放置15min。向混合液 中加0.5倍体积的无水乙醇，颠倒五次混勾。将上步混合液转入ezBind Columns，12000r/ min离心lmin。加650yL Wash Buffer，12000r/min离心lmin，重复一次。弃掉洗液，空转 ezBind，12000r/min离心2min，将ezHind柱转移至洁净的eppendorf管，加入 15yL ddH20,室 温放置 2min，12000r/min 离心 2min，收获 DNA。
[0051] 4、目的核苷酸克隆测序
[0052]这个步骤包括PCR产物的回收、连接、DH5a大肠杆菌感受态细胞的制备、连接产物 进行转化、质粒DNA的提取、重组质粒的双酶切鉴定、阳性克隆序列测定。
[0053] 5、结果
[0054] 5.1 PCV2-SD核酸片段扩增结果
[0055] 以组织中提取的总DNA为模板，应用两对特异性引物分别进行PCR扩增，经琼脂糖 凝胶电泳后，分别获得了 l〇57bp(A)和1110bp(B)的核酸片段，与预期大小一致，结果见图1。
[0056] 以片段A、B混合物为模板，以PCV2-F3/R3为引物，进行PCR反应，得到PCV2全基因组 H，片段大小1767bp，如图2。
[0057] 5.2 PCR产物的克隆与重组质粒的鉴定
[0058]扩增的PCR产物与pMD 18-T载体连接后，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞， 提取的质粒用S a 1 I和B a m Η I酶切，电泳结果如图3。重组质粒经酶切后，得到17 6 7 b p和 2692bp的核酸片段，与预期大小一致。
[0059] 制备猪圆环病毒Π 型灭活病毒液的方法：
[0060] 将PCV2株接种PK15细胞培养，病毒培养物经3次冻融后收获，经高速离心弃细胞杂 质，再经超速离心适当浓缩病毒，置-70°C冰箱保存备用。
[0061 ] 测定PCV2-SD浓缩病毒液毒价，调整为105.5TCID50/m L，加入甲醛，使甲醛的最终 浓度为0.1%。37°(：恒温摇床灭活18h。分别抽取少量灭活病毒液以1:10稀释后接种于单层 PK15细胞，盲传3代，即得。
[0062]本发明以具体的实施例来解释说明本发明创造。
[0063] 实施例一
[0064] -种猪圆环病毒Π 型灭活疫苗组合物的制备方法，包括以下步骤：
[0065] 1)将20份黄芪多糖、10份人参、3份杜仲叶、20当归多糖中草药佐剂的活性成分进 行提取，后用生理盐水溶解，过滤后制成待用液；
[0066] 2)制备猪圆环病毒Π 型灭活病毒液，将所述猪圆环病毒Π 型灭活病毒液加至所述 待用液中，且以1:2比例混合，搅拌均匀；
[0067] 3)向18份白油中添加6份司盘80和4份硬质酸铝制成油相混合物，将作为水相的12 份的吐温20与所述油相混合物混匀，得混合液；
[0068] 4)将步骤2)中的产物加入到所述混合液中，离心乳化3min，即得成品。
[0069] 实施例二
[0070] -种猪圆环病毒Π 型灭活疫苗组合物的制备方法，包括以下步骤：
[0071] 1)将25份黄芪多糖、15份人参、6份杜仲叶、30当归多糖中草药佐剂的活性成分进 行提取，后用生理盐水溶解，过滤后制成待用液；
[0072] 2)制备猪圆环病毒Π 型灭活病毒液，将所述猪圆环病毒Π 型灭活病毒液加至所述 待用液中，且以1:2比例混合，搅拌均匀；
[0073] 3)向24份白油中添加10份司盘80和7份硬质酸铝制成油相混合物，将作为水相的 15份的吐温20与所述油相混合物混匀，得混合液；
[0074] 4)将步骤2)中的产物加入到所述混合液中，离心乳化3min，即得成品。
[0075] 实施例三
[0076] -种猪圆环病毒Π 型灭活疫苗组合物的制备方法，包括以下步骤：
[0077] 1)将20份黄芪多糖、10份人参、3份杜仲叶、20当归多糖中草药佐剂的活性成分进 行提取，后用生理盐水溶解，过滤后制成待用液；
[0078] 2)制备猪圆环病毒Π 型灭活病毒液，将所述猪圆环病毒Π 型灭活病毒液加至所述 待用液中，且以1:1比例混合，搅拌均匀；
[0079] 3)向18份白油中添加6份司盘80和4份硬质酸铝制成油相混合物，将作为水相的12 份的吐温20与所述油相混合物混匀，得混合液；
[0080] 4)将步骤2)中的产物加入到所述混合液中，离心乳化3min，即得成品。
[0081] 实施例四
[0082] -种猪圆环病毒Π 型灭活疫苗组合物的制备方法，包括以下步骤：
[0083] 1)将25份黄芪多糖、15份人参、6份杜仲叶、30当归多糖中草药佐剂的活性成分进 行提取，后用生理盐水溶解，过滤后制成待用液；
[0084] 2)制备猪圆环病毒Π 型灭活病毒液，将所述猪圆环病毒Π 型灭活病毒液加至所述 待用液中，且以1:1比例混合，搅拌均匀；
[0085] 3)向24份白油中添加10份司盘80和7份硬质酸铝制成油相混合物，将作为水相的 15份的吐温20与所述油相混合物混匀，得混合液；
[0086] 4)将步骤2)中的产物加入到所述混合液中，离心乳化3min，即得成品。
[0087] 实施例五
[0088] -种猪圆环病毒Π 型灭活疫苗组合物的制备方法，包括以下步骤：
[0089] 1)将20份黄芪多糖、10份人参、3份杜仲叶、20当归多糖中草药佐剂的活性成分进 行提取，后用生理盐水溶解，过滤后制成待用液；
[0090] 2)制备猪圆环病毒Π 型灭活病毒液，将所述猪圆环病毒Π 型灭活病毒液加至所述 待用液中，且以2:1比例混合，搅拌均匀；
[0091] 3)向18份白油中添加6份司盘80和4份硬质酸铝制成油相混合物，将作为水相的12 份的吐温20与所述油相混合物混匀，得混合液；
[0092] 4)将步骤2)中的产物加入到所述混合液中，离心乳化3min，即得成品。
[0093] 实施例六
[0094] -种猪圆环病毒Π 型灭活疫苗组合物的制备方法，包括以下步骤：
[0095] 1)将25份黄芪多糖、15份人参、6份杜仲叶、30当归多糖中草药佐剂的活性成分进 行提取，后用生理盐水溶解，过滤后制成待用液；
[0096] 2)制备猪圆环病毒Π 型灭活病毒液，将所述猪圆环病毒Π 型灭活病毒液加至所述 待用液中，且以2:1比例混合，搅拌均匀；
[0097] 3)向24份白油中添加10份司盘80和7份硬质酸铝制成油相混合物，将作为水相的 15份的吐温20与所述油相混合物混匀，得混合液；
[0098] 4)将步骤2)中的产物加入到所述混合液中，离心乳化3min，即得成品。
[0099]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种猪圆环病毒Π 型灭活疫苗组合物，其特征在于，所述组合物由以下组分组成:猪 圆环病毒Π 型灭活病毒液、中草药佐剂、化学类佐剂，其中所述中草药佐剂由黄芪多糖、人 参、杜仲叶、当归多糖组成，所述化学类佐剂为白油、吐温20、司盘80、硬质酸铝，所述猪圆环 病毒Π 型毒株灭活病毒液与所述中草药佐剂的质量比为1:2~2:1。2. 如权利要求1所述的一种猪圆环病毒Π 型灭活疫苗组合物，其特征在于，所述组合物 包含以下重量份的原料： 20~25份黄芪多糖、10~15份人参、3~6份杜仲叶、20~30份当归多糖、30~50份猪圆 环病毒Π 型灭活病毒液、18~24份白油、12~15份吐温20、6~10份司盘80、4~7份硬质酸 错。3. 如权利要求2所述的一种猪圆环病毒Π 型灭活疫苗组合物，其特征在于： 所述猪圆环病毒Π 型灭活病毒液的毒价为105'5TCID50/m L。4. 制备如权利要求1至3中任一项所述的一种猪圆环病毒Π 型灭活疫苗组合物的方法， 其特征在于，包括以下步骤： 1) 将中草药佐剂的活性成分进行提取，后用生理盐水溶解，过滤后制成待用液； 2) 制备猪圆环病毒Π 型灭活病毒液，将所述猪圆环病毒Π 型灭活病毒液加至所述待用 液中，搅拌均匀； 3) 向白油中添加司盘80和硬质酸铝制成油相混合物，将作为水相的吐温20与所述油相 混合物混匀，得混合液； 4) 将步骤2)中的产物加入到所述混合液中，离心乳化3min，即得成品。5. 如权利要求4所述的一种猪圆环病毒Π 型灭活疫苗组合物的制备方法，其特征在于， 步骤2)中制备猪圆环病毒Π 型灭活病毒液的过程中包括设计三对引物用于扩增猪圆环病 毒Π 型毒株的全基因序列，所述三对引物分别是： PCV2-F1 的基因序列为5 '-TGCAGAAGCGTGATTGGAAGAC-3 '， PCV2-R1 的基因序列为5 '-CCGCACCTTCGGATATACTATC-3 ' ； PCV2-F2的基因序列为5 '-AGGGCCAGAATTCAACCTTT-3 '， PCV2-R2的基因序列为5 '-TCCCACAGAGTCTCAGTAGA-3 ' ； PCV2-F3的基因序列为5 '-AGGGCCAGAATTCAACCTTAACCTTC-3 '， PCV2-R3的基因序列为5 '-GTTGAATTCTGGCCCTGCTCCCCGAT-3 '。
【文档编号】A61K39/39GK105833262SQ201610236244
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年4月15日
【发明人】郭洪梅, 李舫, 王成森, 王中杰, 苏丹
【申请人】山东畜牧兽医职业学院