一种提高渔用浸泡疫苗免疫效果的佐剂及鱼类浸泡免疫方法
【专利摘要】本发明属于水生生物疾病免疫防治领域，尤其涉及一种提高渔用浸泡疫苗免疫效果的佐剂及鱼类浸泡免疫方法。所述佐剂包括以下重量份数的组分：氮酮、皂草苷、乙醇酸、甘油、葡萄糖苷。本发明还提供了一种鱼类浸泡免疫方法，其包括以下步骤：A)将上述佐剂与水混合得到佐剂溶液；取一部分上述佐剂溶液与疫苗溶液混合均匀，得浸泡免疫溶液；B)将待免疫鱼类放入佐剂溶液中浸泡后捞起，用水清洗；C)将处理后的待免疫鱼类移入浸泡免疫溶液中，充气浸泡。本发明佐剂能有效提高浸泡免疫过程中进入鱼体的疫苗量，显著提高草鱼出血病活疫苗(GCHV?892株)的免疫效果，其具有操作方便，成本低，对鱼类安全等优点。
【专利说明】
一种提高渔用浸泡疫苗免疫效果的佐剂及鱼类浸泡免疫方法
技术领域
[0001] 本发明属于水生生物疾病免疫防治领域，尤其涉及一种提高渔用浸泡疫苗免疫效 果的佐剂及鱼类浸泡免疫方法。
【背景技术】
[0002] 草鱼是我国重要的淡水养殖鱼类之一，在我国淡水养殖中占重要地位。草鱼饲料 来源广、生长速度快，肉质鲜美，深受广大养殖者和消费者喜爱。但是，草鱼病害多、养殖成 活率低，妨碍了草鱼养殖业的发展。草鱼出血病是一种严重危害草鱼鱼种的病毒性疾病，其 流行范围广、传播速度快，死亡率高，每年都对草鱼养殖业造成巨大的经济损失。长期以来， 草鱼出血病的防治技术研究一直是我国水产养殖病害防治技术研究的重要内容。
[0003] 草鱼出血病的主要症状是上下颂、口腔、眼眶周围、鳍条基部、鳃及鳃盖充血，眼球 突出；剥去鱼的皮肤，可看见肌肉有点状或块状充血、出血，甚至全身肌肉呈鲜红色;肠壁充 血或出血，肠内无食物，肠道周围脂肪、肠系膜、胆囊、鳃、脾、肾、肝也有出血点或血丝症状。 该病的症状分为三种类型:红鳍红鳃盖型、红肌肉型和肠炎型。
[0004] 草鱼出血病毒是病毒性草鱼出血病的致病病原，是中国分离的第一种鱼类病毒， 隶属呼肠孤病毒科，水生动物呼肠孤病毒属，直径70~80nm，二十面体球形颗粒，含有11个 片段的双链RNA。不同地区存在不同的毒株。目前已报道了 10个分离株，该病毒主要引起中 国淡水养殖主要品种草鱼在鱼种阶段发生出血病，因其寄生在鱼体组织细胞中，具有很强 的抗药性，所以难用药物治疗。
[0005] 目前，草鱼出血病的预防方法已普遍采用疫苗免疫的方法，包括注射用疫苗、浸泡 疫苗及口服疫苗等。国内的鱼用疫苗产品制剂种类不多，在鱼类疫苗研究方面多侧重于注 射用疫苗。注射疫苗对草鱼出血病防治效果明显，但注射免疫工作量大、工作效率低，且会 对鱼体造成伤害;而在浸泡免疫过程中，抗原需要克服鱼类体表黏液、鳞片及皮肤的障碍， 才能进入机体，免疫效果差。
[0006] 基于上述现状，提供新型浸泡疫苗佐剂，进一步改善鱼类疫苗浸泡方法，提高鱼类 疫苗免疫效果，是草鱼养殖业快速发展所必须的。
【发明内容】
[0007] 本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种提高渔用浸泡疫苗免疫效果的佐剂 及鱼类浸泡免疫方法。其能有效提高浸泡免疫过程中进入鱼体的疫苗量，从而显著提高草 鱼出血病活疫苗(GCHV-892株)的免疫效果，且其成本低，对鱼类安全。
[0008] 为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种提高渔用浸泡疫苗免疫效果的 佐剂，所述佐剂包括以下重量份数的组分:氮酮〇. 01-1份、皂草苷2-5份、乙醇酸3.5-6份、甘 油10-20份、葡萄糖苷0.5-3份。
[0009] 优选地，所述佐剂包括以下重量份数的组分:氮酮0.01份、皂草苷2份、乙醇酸3.5 份、甘油1 〇份、葡萄糖苷〇. 5份。
[0010] 优选地，所述佐剂包括以下重量份数的组分:氮酮〇. 05份、皂草苷3份、乙醇酸5份、 甘油15份、葡萄糖苷2份。
[0011] 优选地，所述佐剂包括以下重量份数的组分:氮酮1份、皂草苷5份、乙醇酸6份、甘 油20份、葡萄糖苷3份。
[0012] 优选地，所述佐剂还包括乳木果油，所述佐剂中乳木果油和氮酮的重量比为1: 0·1_0·6 〇
[0013]优选地，所述佐剂中乳木果油和氮酮的重量比为1:0.3。
[0014] 本发明还提供了一种鱼类浸泡免疫方法，包括以下步骤：
[0015] A)将上述佐剂与去离子水按1:40-60的体积比混合得到佐剂溶液，备用；
[0016] B)取一部分步骤A)所得佐剂溶液与疫苗溶液按照1:120-200的体积比混合均匀， 得浸泡免疫溶液，备用；
[0017] C)先将待免疫鱼类放入步骤A)所得的佐剂溶液中浸泡10-30min后捞起，用水清洗 l_2min;
[0018] D)将经上述步骤C)处理后的待免疫鱼类移入步骤B)所得的浸泡免疫溶液中，充气 浸泡30-60min，即完成免疫。
[0019]优选地，所述步骤A)中佐剂与去离子水的体积比为1:45-55。
[0020]优选地，所述步骤B)中所述佐剂溶液与疫苗溶液的体积比为1:150-200。
[0021 ]优选地，所述步骤B)中所述佐剂溶液与疫苗溶液的体积比为1:160。
[0022] 与现有技术相比，本发明具有如下技术优势：
[0023] 本发明渔用浸泡疫苗佐剂能有效提高浸泡免疫过程中进入鱼体的疫苗量，从而显 著提高草鱼出血病活疫苗(GCHV-892株)对草鱼的免疫保护，其免疫方法简单，成本低，对鱼 类安全，有利于大规模生产。
【具体实施方式】
[0024] 本领域技术人员应理解，以下实施例中所公开的技术代表本发明人发现的在本发 明的实践中发挥良好作用的技术。然而，在所公开的具体实施方案中可以做出许多改变，并 仍然获得相同或相似的结果，而不脱离本发明的精神和范围。
[0025] 实施例1: 一种提高渔用浸泡疫苗免疫效果的佐剂
[0026]所述佐剂由以下重量份数的组分组成:氮酮0.01份、皂草苷2份、乙醇酸3.5份、甘 油10份、葡萄糖苷0.5份。
[0027]实施例2: -种提高渔用浸泡疫苗免疫效果的佐剂
[0028]所述佐剂由以下重量份数的组分组成：氮酮0.05份、皂草苷3份、乙醇酸5份、甘油 15份、葡萄糖苷2份。
[0029] 实施例3: -种提高渔用浸泡疫苗免疫效果的佐剂
[0030] 所述佐剂由以下重量份数的组分组成：氮酮1份、皂草苷5份、乙醇酸6份、甘油20 份、葡萄糖苷3份以及乳木果油0.3份。
[0031 ]实施例4: 一种提高渔用浸泡疫苗免疫效果的佐剂
[0032]所述佐剂由以下重量份数的组分组成:氮酮0.08份、皂草苷4份、乙醇酸4.5份、甘 油12份、葡萄糖苷1.5份以及乳木果油0.0048份。
[0033]鱼类浸泡免疫方法
[0034] A)将上述佐剂与去离子水按1:50的体积比混合得到佐剂溶液，备用；
[0035] B)取一部分步骤A)所得佐剂溶液与疫苗溶液按照1:160的体积比混合均匀，得浸 泡免疫溶液，备用；
[0036] C)将待免疫鱼类放入步骤A)所得的佐剂溶液中浸泡60min后捞起，用水清洗lmin;
[0037] D)将经上述步骤C)处理后的待免疫鱼类移入步骤B)所得的浸泡免疫溶液中，充气 浸泡20min，即完成免疫。
[0038] 对比例1: 一种提高渔用浸泡疫苗免疫效果的佐剂 [0039]乙醇酸增至6.5份，其他成分及其重量份数如实施例3。
[0040] 对比例2: -种提高渔用浸泡疫苗免疫效果的佐剂
[0041 ]乳木果油的重量份数增至1份，其他组分及重量份数与实施例3相同。
[0042]对比例3:鱼类浸泡免疫方法
[0043] S1:取佐剂与去离子水按1:50的体积比混合均匀得佐剂溶液，备用；
[0044] S2:取步骤S1所得佐剂溶液与疫苗溶液按1:160的体积比混合得浸泡免疫溶液，备 用；
[0045] S3:将待免疫鱼类放入步骤S2所得的浸泡免疫溶液中充气浸泡60min，即完成免 疫。
[0046] 对比例4:鱼类浸泡免疫方法
[0047] S1:取佐剂与去离子水按1:50的体积比混合均匀得佐剂溶液，备用；
[0048] S2:将待免疫鱼类放入步骤S1所得的佐剂溶液中浸泡20min后捞起，用水清洗 lmin；
[0049] S4:将经上述步骤S2处理后的待免疫鱼类移入疫苗溶液中，充气浸泡60min，即完 成免疫。
[0050] 毒性试验
[0051 ]( - )试验鱼:8-10g草鱼苗40尾/组，共6组。
[0052](二)试验分组：
[0053]将本发明实施例1-4以及对比例1-2组所得佐剂与水按照1:50的体积比混合均匀 得佐剂溶液，分别命名为实施例1组、实施例2组、实施例3组、实施例4组、对比例1组以及对 比例2组佐剂溶液。
[0054](三)处理方法:取6组草鱼苗分别移入实施例1-4组以及对比例1-2组佐剂溶液中 浸泡半小时，观察记录各组草鱼苗在浸泡7天后的状态及死亡情况。
[0055](四）试验结果。
[0056]试验结果:各组草鱼苗在浸泡后7天未出现不正常状态，也未出现死亡的情况。
[0057] 不同浸泡免疫方法对草鱼出血病疫苗免疫保护效果的影响试验
[0058] 1.材料：
[0059] 1.1试验鱼：8-10g草鱼苗450尾，试验前暂养2周，观察摄食活动状态，确认健康后 用于试验，试验期间水温(26 ± 1) °C。
[0060] 1.2疫苗溶液与强毒的制备:草鱼出血病病毒GCHV接种草鱼肾细胞(CIK)，28°C培 养6-8天，收集细胞与上清液即得疫苗溶液。强毒使用健康草鱼制备，健康草鱼注射感染含 有草鱼出血病病毒的组织液，4-7天后鱼体出现症状，收集患典型草鱼出血病的病鱼组织， 取病鱼脾、肾等内脏组织研磨，组织液经离心、过滤除菌后得强毒，用于免疫攻毒试验。
[0061 ] 2试验分组
[0062] 空白对照组:试验鱼不经任何表面处理直接攻毒；
[0063] 试验①组:取实施例3所述佐剂按照对比例3所述浸泡免疫方法对试验鱼进行浸泡 免疫；
[0064] 试验②组:取实施例3所述佐剂按照对比例4所述浸泡免疫方法对试验鱼进行浸泡 免疫；
[0065] 试验③组:取实施例3佐剂按照本发明提供的浸泡免疫方法对试验鱼进行浸泡免 疫。
[0066] 试验④组:试验鱼不经任何表面处理，直接用1.2制备的疫苗溶液浸泡20min免疫。 [0067] 以上每组设3个平行组，每个平行组30尾草鱼苗。
[0068] 2.1免疫后攻毒:免疫后15天各组用1.2制备的草鱼出血病病毒强毒液攻毒，攻毒 采用注射感染方式。
[0069] 2.2试验结果:攻毒15天后，统计各组存活率，结果见表1。
[0070] 表1免疫相对保护率
[0073] 注:相对免疫保护率计算方法:RPS= (1-试验组死亡率/对照组死亡率）X 100%
[0074] 由上表可知，各组平均相对保护率从高到低排序为：试验③组>试验①组>试验 ②组>试验④组，其中，试验③组的平均相对保护率为64.8%，高于试验①组的50.0%以及 试验②组的46.5%。试验结果表明，利用本实施例3的佐剂对鱼体进行预处理后，再经由佐 剂与疫苗溶液混合而成的浸泡免疫溶液浸泡，能显著提高浸泡疫苗对鱼体的免疫保护作 用。
[0075] 本发明佐剂对疫苗免疫效果的影响
[0076] 1.材料
[0077] 1.1试验鱼：8-10g草鱼苗210尾，试验前暂养2周，观察摄食活动状态，确认健康后 用于试验，试验期间水温(26 ± 1) °C。
[0078] 1.2病毒株:草鱼出血病病毒GCHV-892株，购自肇庆大华农生物药品有限公司。
[0079] 1.3佐剂:本发明实施例1-4以及对比例1-2所得佐剂。
[0080] 1.4疫苗溶液的制备:草鱼吻端成纤维细胞(PSF)按常规方法传代，传代后细胞汇 合度达到80 % -90 %时接种GCHV-892病毒株，28 °C培养5-6天，待转瓶内细胞病变完全，收集 细胞液进行无菌检验和支原体检验，并取样检测其病毒含量(TCID5Q)，病毒含量(TCID 5q)等 于或大于1X108时，留样备用。
[0081 ] 2试验方法
[0082] 将上述210尾草鱼苗平均分为7组，每组30尾。取本发明实施例1-4以及对比例1-2 所得佐剂分别先与水按1:50的体积比混合得实施例1-4以及对比例1-2组佐剂溶液，取上述 一部分各组佐剂溶液分别与疫苗溶液按照1:160的体积比混合均匀得实施例1-4以及对比 例1-2组浸泡免疫溶液，标记好，备用。取其中6组草鱼苗先分别放入本发明实施例1-4以及 对比例1-2组佐剂溶液中浸泡20min后捞起，用水清洗lmin，然后将经上述处理后的6组草鱼 苗分别对应放入上述各组浸泡免疫溶液中充气浸泡;取剩下1组草鱼苗先放入养殖用水中 浸泡20min，后移入疫苗溶液中浸泡作为对照组。
[0083] 2.3采样
[0084] 于浸泡1〇111丨11、2〇111丨11、4〇111丨11、5〇111丨11、6〇111丨11、1.511、211、311时分别对各组浸泡鱼苗取 样，每个取样点取3-5尾鱼的肾脏混为一个样品，样品收集在RNA保存液中，待样品全部取完 后测定鱼体内疫苗的相对含量，记录并分析。
[0085] 2.4试验结果如表2。
[0086]表2不同条件处理后鱼体内草鱼出血病活疫苗的相对含量
[0087]
[0088]
[0089] 注:疫苗相对含量的计算方法：以GCHV的特异性基因 VP6在鱼体肾脏中的表达量为 测定指标，采用Roche Light cycler480 PCR仪测定各样品中VP6基因的表达量。具体步骤 如下：将采集好的样品分别提取RNA，随即用试剂盒反转录成cDNA，设计VP6基因和草鱼18S 基因的实时定量PCR引物，18S作为内参基因。使用Τ0Υ0Β0公司实时定量PCR试剂盒进行分 析，每孔PCR体系如下:Mix 5yL、上游引物0.4yL、下游引物0.4yL，模板cDNA lyL，加灭菌水 至10此，每个样品做四个重复。
[0090] 试验结果表明：实施例1-4组鱼体内疫苗的相对含量在不同的时间点的检测结果 都明显高于对比例1-2组，其中尤以实施例3组效果最优，故实施例3组为本发明最佳实施 例。
[0091] 由于已经通过以上较佳实施例描述了本发明，在本发明的精神和/或范围内，任何 针对本发明的替换/或组合来实施本发明，对于本领域的技术人员来说都是显而易见的，且 包含在本发明之中。
【主权项】
1. 一种提高渔用浸泡疫苗免疫效果的佐剂，其特征在于，所述佐剂包括以下重量份数 的组分:氮酮0.01-1份、皂草苷2-5份、乙醇酸3.5-6份、甘油10-20份、葡萄糖苷0.5-3份。2. 如权利要求1所述的提高渔用浸泡疫苗免疫效果的佐剂，其特征在于，所述佐剂包括 以下重量份数的组分:氮酮0.01份、阜草苷2份、乙醇酸3.5份、甘油10份、葡萄糖苷0.5份。3. 如权利要求1所述的提高渔用浸泡疫苗免疫效果的佐剂，其特征在于，所述佐剂包括 以下重量份数的组分:氮酮0.05份、皂草苷3份、乙醇酸5份、甘油15份、葡萄糖苷2份。4. 如权利要求1所述的提高渔用浸泡疫苗免疫效果的佐剂，其特征在于，所述佐剂包括 以下重量份数的组分:氮酮1份、皂草苷5份、乙醇酸6份、甘油20份、葡萄糖苷3份。5. 如权利要求1所述的提高渔用浸泡疫苗免疫效果的佐剂，其特征在于，所述佐剂还包 括乳木果油，所述佐剂中乳木果油和氮酮的重量比为1: 〇. 1-0.6。6. 如权利要求5所述的提高渔用浸泡疫苗免疫效果的佐剂，其特征在于，所述佐剂中乳 木果油和氮酮的重量比为1:0.3。7. -种鱼类浸泡免疫方法，其特征在于，包括以下步骤： A) 取权利要求1-6任一项所述佐剂与水按1:40-60的体积比混合得到佐剂溶液，备用； B) 取一部分步骤A)所得佐剂溶液与疫苗溶液按照1:120-200的体积比混合均匀，得浸 泡免疫溶液，备用； C) 先将待免疫鱼类放入步骤A)所得的佐剂溶液中浸泡10-30min后捞起，用水清洗1-2min； D) 将经上述步骤C)处理后的待免疫鱼类移入步骤B)所得的浸泡免疫溶液中，充气浸泡 30-60min，即完成免疫。8. 如权利要求7所述的鱼类浸泡免疫方法，其特征在于，所述步骤A)中佐剂与水的体积 比为 1:45-55。9. 如权利要求7所述的鱼类浸泡免疫方法，其特征在于，所述步骤B)中所述佐剂溶液与 疫苗溶液的体积比为1:150-200。10. 如权利要求9所述的鱼类浸泡免疫方法，其特征在于，所述步骤B)中所述佐剂溶液 与疫苗溶液的体积比为1:160。
【文档编号】A61K39/39GK105833266SQ201610263394
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年4月26日
【发明人】吉华松, 欧阳征亮, 陈瑞爱, 王阿明, 高任
【申请人】肇庆大华农生物药品有限公司