专利名称：：皂苷类化合物及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及皂苷类化合物，尤其是涉及一类具有抗血小板聚集及抗血小板炎症的皂苷类化合物及其在制备治疗血栓及动脉粥样硬化药物的应用。
背景技术：
：人类血小板主要包括下列不同的ADP受体P2X^P2Y^P2Y12等。P2X工主要与血小板内Ca2+动员和空间构像改变有关。P2Y是ADP诱导血小板聚集反应中的主要受体，ADP与Gq蛋白藕连的P2Yi受体结合，提高细胞内(^2+浓度。与Gi蛋白藕连的P2Y12受体结合，激活PI3激酶并活化丝氨酸_苏氨酸蛋白激酶B(Akt)，进而激活肌球蛋白轻链激酶，使特异的底物蛋白，包括板影蛋白和肌球蛋白轻链的丝/苏氨酸残基磷酸化，诱导GPIIb/IIIa簇集和构象改变，使纤维蛋白原(Fg)结合位点暴露，血小板通过Fg桥联而聚集。P2Y12受体信号还能抑制血小板的腺苷酸环化酶的活化，降低了血小板中cAMP的水平，诱发血小板的聚集(1.HollopeterG，JantzenH，VincentDetal.IdentificationoftheplateletADPreceptortargetedbyantithromboticdrugs.Nature,2001;409:202-207;2.RileyAB，TafreshiMJ，HaberSLPrasugrel:anovelantiplateletagent.AmJHealthSystPharm，2008;65(11):1019—1028;3.StoreyRF，HustedS，HarringtonRA，etal.InhibitionofplateletaggregationbyAZD6140,areversibleoralP2Y12rec印torantagonist,comparedwithclopidogrelinpatientswithacutecoronarysyndromes.JAmCollCardiol，2007;50(19):1852-1856;4.StoreyRF，WilcoxRG，H印tinstallS.Comparisonofth印harmacodynamiceffectsoftheplateletADPreceptorantagonistsclopidogrelandAR_C69931MXinpatientswithischaemicheartdisease.Platelets.2002;3(7):407-413)。当血小板被激活时，颗粒膜和质膜融合为颗粒膜蛋白，导致P-选择素(CD62P)在细胞膜上表达。P选择素具有黏附分子的活性，参与介导活化内皮细胞或血小板与中性粒细胞的黏附，促进白细胞与血小板的黏附及在血栓部位的聚集。血小板质膜表面糖蛋白IIb/IIIa(CD41/CD61)仅在血小板活化时才发生构象变化而显露出来。因此，CD62P、CD41/CD61可作为测定血小板活化的分子标志物(5.ErlandsenSL，GreetBittermannA，WhiteJ，etal.High-resolutionCryoFESEMofindividualcelladhesionmolecules(CAMs)intheglycocalyxofhumanplatelets-detectionofP-selectin(CD62P)，GPHXcomplex(CD42A/CD42Balpha,Bbeta)，andintegrinGPIIbIIIa(CD41/CD61)byimmunogoldlabelingandstereoimaging.JHistochemCytochem2001;49(7):809-819;6.WasilukA，ManturM，Szcz印anskiM，etal.TheeffectofgestationalageonplateletsurfaceexpressionofCD62Pinpretermnewborns.Platelets2008;19(3):236-238;7.CurversJ，deWildt-EggenJ，HeeremansJ，etal.FlowcytometricmeasurementofCD62P(P_selectin)expressiononplatelets:amulticenteroptimizationandstandardizationeffort.Transfusion2008;48(7):1439—1446)。3活化的血小板在动脉粥样硬化易损斑块的病理进展过程起重要作用，基础研究和临床实践充分证明了在处理冠脉事件中抗血小板治疗的重要性。近年的研究认为，活化的血小板除参与止血及血栓形成作用外，还分泌多种致炎因子，如基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、黏附分子(ICAM-2)、CD40L等，对血管中的白细胞有直接趋化作用，并对动脉粥样斑块炎症的发展起调节作用。炎症促使易损斑块血栓形成，在急性冠脉综合症(ACS)发病机制占重要地位。作为炎症的参与者CD40/CD40L信号系统，近年引起广泛关注，它们可能在动脉粥样硬化的形成、进展及导致斑块不稳定的病理过程中起着重要作用(8.MeabedMH，TahaGM，MohamedSO，etal.Autoimmunethrombocytopenia:flowcytometricdeterminationofplatelet-associatedCD154/CD40LandCD40onperipheralbloodTandBlymphocytes.Hematology2007;12(4):301-307;9.PignatelliP，DiSantoS，CarnevaleR，etal.Th印olyphenolsquercetinandcatechinsynergizeininhibitingplateletCD40Lexpression.ThrombHaemost2005;94(4):888-889;10.JudgeHM，BucklandRJ，HolgateCE，etal.Glycoproteinllb/IliaandP2Y12receptorantagonistsyieldadditiveinhibitionofplateletaggregation,gra皿lesecretion，solubleCD40Lreleaseandprocoagulantresponses.Platelets2005;16(7):398-407;1l丄angerF，IngersollSB，AmirkhosraviA，etal.TheroleofCD40inCD40L_MidMitibody_medi3tedplateletactivation.ThrombHaemost2005;93(6):1137-1146;12.DaviG，FerroniP.CD40-CD40Linteractionsinplateletactivation.ThrombHaemost2005;93(6):1011-1012)。CD40是由277个氨基酸组成的I型跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族。可表达于B细胞、单核/巨噬细胞等免疫细胞以及内皮细胞、血小板等非免疫细胞。CD40L是由261个氨基酸组成的II型跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子家族。主要表达于活化的T细胞和血小板，也可表达于内皮细胞、单核细胞、B细胞等(13.BlannAD，TanKT，TayebjeeMH，etal.SolubleCD40Linperipheralarterydisease.Relationshipwithdiseaseseverity,plateletmarkersandtheeffectsofangioplasty.ThrombHaemost2005;93(3):578-583;14.FreedmanJE.CD40_CD40Landplateletfunction:beyondhemostasis.CircRes2003;92(9):944-946)。血小板活化后表达CD40L，随即脱落至血浆，成为SCD40L，使炎性反应放大，血浆中的SCD40L约95%来自于血小板。SCD40L可抑制内皮细胞迁移，阻止破损斑块管腔面的内皮化，造成动脉管腔再狭窄。因此，许多研究表明血清SCD40L水平对心血管事件的发生是一个有效的、独立的预测指标(15.AndreP，Nannizzi-AlaimoL，PrasadSK，etal.Platelet-derivedCD40L:theswitch-hittingplayerofcardiovasculardisease.Circulation2002;106(8):896-899;16.WeberAA，HermannA，RauchBH，etal.MolecularidentityofplateletCD40ligand(CD40L).ThrombHaemost2001;86(2):718;17.HermannA，RauchBH，Bra皿M，etal.PlateletCD401igand(CD40U__subcellularlocalization,regulationofexpression,andinhibitionbyclopidogrel.Platelets2001;12(2):74—82)。Rr-P-GaPp-GIcR2=-|3-Glc化合物2，化合物2为(25R)-26-氧_P_D_葡萄吡喃糖基_5a-呋甾-3P，12a，22，26-四醇_3-氧-13-D-葡萄吡喃糖基(1—2)[13_D_葡萄吡喃糖基(1—3)]-P_D_葡萄吡喃糖基(1—4)-P-D-半乳吡喃糖苷，分子量为1260，分子式为(]57119603。，结构式为<R2HOR2=-(K5lc化合物3，化合物3为(25R)_26-氧-|3_D_葡萄吡喃糖基_5P-呋甾-20(22)-烯-3|3，12a，26-三醇_3_氧-P_D_葡萄吡喃糖基(1—2)-P_D_半乳吡喃糖苷，分子量为918，分子式为C45H74019，结构式为OR2P"GaP(3-GlcR2=-P-Glc
发明内容本发明的目的在于提供皂苷类化合物及其应用。所述皂苷类化合物为化合物1，化合物1为(25R)-26-氧_P_D_葡萄吡喃糖基_5P-呋甾_3P，12a，22，26-四醇_3-氧-13-D-葡萄吡喃糖基(1—2)-13_D_半乳吡喃糖苷，分子量为936，分子式为Q具A。，结构式为所述皂苷类化合物，包括化合物1、化合物2和化合物3可用于制备治疗血栓及动脉粥样硬化的药物。本发明所述皂苷类化合物，包括化合物1、化合物2和化合物3是采用多种分离手段，从中药或天然药物中提取分离得到的3种新化合物，并呈现浓度依赖性，显示良好的量效关系。这说明，这3种新化合物均具有抗血小板聚集及抗血小板炎症作用，可以作为治疗血栓及动脉粥样硬化药物应用。本发明的使用，将会为攻克这两种临床常见的重大病症提供新的治疗途径。图1为CD40、CD40LmRNA扩增后产物电泳图。图2为皂苷类化合物对CD40表达的荧光定量PCR结果。在图2中，圆320ymo1/L，口80iimol/L，図20iimol/L，口5ymol/L，横坐标为样品，纵坐标为表达强度(lgx)。图3为皂苷类化合物对CD40L表达的荧光定量PCR结果。在图3中，圆320ymo1/L，Q80iimol/L，國20iimol/L，口5ymol/L，横坐标为样品，纵坐标为表达强度(lgx)。具体实施例方式实施例1:化合物的提取分离及结构鉴定1.l仪器、试剂及填料Yanaco熔点测定仪(未校正)；岛津FTIR8900型红外分光光度仪，KBr压片；ESI-MS用BrukerEsquire2000质谱仪测定；核磁共振实验采用BrukerAVANCE-400超导核磁共振仪，在室温条件下测定；旋光度用JascoP-1020旋光仪测定；高效液相色谱仪系统控制器:SCL-薩P，检测器示差检测器RID-10A(SHIMADZU)，二极管阵列检测器:SPD-M10A(SHI廳ZU)，泵:LC-10ATVP(分析型)，LC-8A(制备型)，柱温箱CT0-10ASVP，色谱柱分析型:Shim-packVP-0DS(cp4.6mmX250)(SHIMADZU)，制备型Shim-packPREP-ODS((p20mmX250)(SHIMADZU)。甲醇(色谱纯)中国医学科学院天津协和医学科技公司，甲醇(分析纯)天津康科德科技有限公司，氯仿(分析纯)天津康科德科技有限公司，正丁醇(分析纯)广州化学试剂厂，柱色谱硅胶(200-300目)，硅胶G，硅胶H均购于青岛海洋化工厂，ODS柱色谱填料美国Merck公司1.2化合物的分离纯化新鲜小根蒜鳞茎(4kg)，洗净，蒸透，干燥，简单粉碎，68倍量50%70%乙醇加热回流提取，共2次，每次23h，减压浓縮提取液至无醇味，混悬于700010000ml水中，用等体积正丁醇萃取23次，在406(TC下减压蒸发至干，得正丁醇萃取物浸膏(110g)。将该浸膏通过硅胶柱色谱，以氯仿_甲醇溶剂系统梯度洗脱，得到10个馏分。第6个馏分(16.4g)通过反相ODS柱色谱，以甲醇-水溶剂系统梯度洗脱，得到5个馏分。第2个馏分经过反复高效液相色谱制备得到化合物3(30mg)，第3个馏分经过反复高效液相色谱制备得到化合物1(130mg)和化合物2(28mg)。1.3化合物的结构鉴定化合物1:6白色粉末，Mp:177178°C，[a]D21-3.5°(c0.16，H20)，Liebermann—Burchard和Molish反应阳性，遇E试剂(Ehrlish)显粉红色，提示该化合物为呋甾皂苷类化合物。阳离子ESI-MS(n=3)给出m/z959[M+Na]+，941[M+Na_H20]+，919[M+H_H20]+，797[M+Na_162]+，617[M+Na_H20_162X2]+，595[M+H_H20_162X2]+，433[M+H-H20-162X2-162]+，阴离子ESI-MS(n=3)给出m/z935[M_H]—，773[M-H-162]—，611[M-H-162X2]—，提示该化合物的分子量为936。阳离子HR-ESMS给出937.5075[M+H]+(calcd937.5008)，确认其分子式为C45H7602。。力-NMR给出4个甾体皂苷元上的特征甲基信号，分别为S1.36(d，J=6.8Hz)，1.02(s)，0.99(d，J=6.8Hz)和0.99(s)，后两组氢信号由于单峰和双峰的交叠而形成三重峰，结合HMQC及HMBC谱，可将4个甲基信号分别归属于H-21，H_19，H-27和H-18。在低场区，可以看到3个糖的端基质子信号S5.25(d，J=7.6Hz)，4.80(d，J=7.6Hz)和4.84(d，J=7.6Hz)。"C-NMR谱给出归属于苷元的27个碳信号和归属于糖链部分的18个碳信号，结合DEPT谱，可以确认归属于C-22的特征碳信号S110.7，归属于3个糖的端基碳信号S106.0,104.9和102.3以及归属于4个甲基的碳信号S23.9，17.5，17.4和16.2。除此之外，还包括2个苷元的季碳信号，4个连氧亚甲基信号，9个亚甲基信号，15个连氧次甲基信号，7个次甲基信号。在HMBC谱中，H-19(S1.02)分别与S30.8(t)，34.9(s)，37.0(d)和33.7(d)的碳信号有远程相关，因此将这4个碳信号分别归属于C-l，C-10，C-5和C-9;H-18(S0.99)分别与S71.7(d)，45.8(s)，48.6(d)和54.6(d)的碳信号相关，从而确认C-12，C-13，C-14和C-17的归属，并且可以确认C-12位连有-0H;H-21(S1.36)与S54.6(d)，40.9(d)和110.7(s)碳信号分别有远程相关，因此确定这3个碳信号分别归属为C-17，C-20和C-22;H-27(S0.99)分别与碳信号S28.4(t)，34.3(d)和75.3(t)相关而确认C-24，C-25和C-26的归属。分析水解后苷元的IR图谱可以确认C-25为R型。结合力」HCOSY谱及其他HMBC相关，可将化合物苷元部分的碳氢信号完全归属。通过TOCSY谱，可以区分不同自旋偶合系统的糖信号，因此可以清楚地区分分别归属于3个不同端基质子(S5.25,4.80,4.84)的3组糖上的氢信号，结合HMQC、HMBC和力」HCOSY谱，可以将18个糖上的碳氢信号完全归属。糖链与苷元及糖链间糖的连接方式可以通过分析HMBC谱的相关确认S4.80的端基氢信号与S75.3(t)的碳信号有远程相关，证明其为连接在C-26位上的葡萄糖的端基氢信号；同样，S4.84的端基氢信号与S75.1的碳信号有相关，证明其为连接在C-3位上的半乳糖的端基氢信号；而S5.25的端基氢信号与S81.7的碳信号有远程相关，证明其为连接在C-3位的半乳糖C-2位的端基氢信号；分析葡萄糖和半乳糖的端基质子的偶合常数(J=7.6，7.6，7.6Hz)可以确定3个糖均为P型。取30mg化合物l，完全酸水解后，将乙酸乙酯萃取3次后，将乙酸乙酯部分蒸干，取得化合物的苷元部分(约10mg)。对苷元部分进行NOESY测定，结果发现在苷元的NOESY谱中，归属于C-12的氢信号S3.99与归属于C-18位的氢信号S0.98(s)有明显的相关信号，即H-12处于|3位，也就是说C-12位-0H处于a位。综上所述，确认化合物1为(25R)-26-氧_P_D_葡萄吡喃糖基_5P-呋甾_3P，12a，22，26-四醇_3_氧-P_D_葡萄吡喃糖基(1—2)-P-D-半乳吡喃糖苷，经系统文献查阅发现化合物1为一个未见文献报道的新化合物(具体核磁数据归属见表1)。7[OO33]表1化合物1的^-NMR和13C_NMR数据(氖代吡啶)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>430.9(t)1.80,1.51(o)469.8(d)4.54(o)37.0(d)2.19(o)76.5(d)3.96(o)627.1(t)1.87，1.19(o)662.1(t)4.39，4.43(o)26.7(t)1.89,1.31(o)Glc-1106.0(d)5.25(d,J=7.6)835.9(d)1.66(o)276.8(d)4.06(o)933.7(d)2.11(o)378.0(d)4.16(o)1034.9(s)_—471.7(d)4.29(o)1129.6(t)1.72,1.63(cO78.4(d)3.93(o)1271.7(d)4.21(o)662.8(t)4.38，4.43(o)1345.8(s)——C-26Glc-1104.9(d)4.80(d，>7.6)1448.6(d)2.12(o)275.1(d)4.22(o)1532.5(t)2.13,1.53(o)378.3(d)3.83(o)1681.0(d)5.04(m)471.6(d)3.99(o)1754.6(d)3.22(dd,/=6.8,8.7)78.5(d)4.22(o)1817.5(q)0.99(s)662.8(t)4.37,4.52(o)1923.9(q)1.02(s)2040.9(d)2.29(m)2116.2(q)1.36((!，/=6.8)22110.7(s)-—2337.2(t)2.06,2.04(o)2428.4(t)2.06，1.71(o)2534.3(d)1.94(o)4.00(m),2675,3(t)3.63(dd,./=5.9,9.4)2717.4(q)0.99(d,声6.8)化合物2:白色粉末，Mp:215216°C，[a]D21-28.7°(c0.12，H20)，Liebermann—Burchard9及Molish反应均呈阳性，遇E试剂显粉红色，提示为呋甾皂苷类化合物。同前方法酸水解给出葡萄糖和半乳糖(4:1)。阳离子ESI-MS(n二3)给出m/zl283[M+Na]+，1121[M+Na-162]+，959[M+Na-162X2]+，797[M+Na-162X3]+，779[M+Na-162X3-H20]+;阴离子ESI—MS(n=3)给出m/z1259[M-H]—，1097[M-H-162]—，935[M-H-162X2]—，773[M-H-162X3]—，611[M-H-162X4]—，提示分子量为1260，并且确认结构中至少存在4个六碳糖。阳离子HR-ESIMS给出1283.5891[M+Na]+(calcd1283.5884)，确认其分子式为C57H9603。。在化合物2的^-NMR谱中，高场区给出S1.38(d，J=6.8Hz)，0.99(s)，0.99(d，J=6.8Hz)及0.68(s)的4个特征甲基氢信号，通过分析它们的裂分情况结合HMBC谱可以将其分别归属为C-21，C-18，C-27和C-19。比较H-18和H-19的化学位移发现H-18位在低场，从而确定H-5为a型。在"C-NMR谱中，低场区只给出S110.6的C-22位碳信号和S105.0，104.9，104.8，104.5，102.3的5个糖端基碳信号，提示分子中有5个糖的存在且没有不饱和键。在HMBC谱中，H-18分别与S71.5(d)，48.3(s)，54.5(d)，45.6(d)碳信号相关，提示在C-12位有-OH的存在，将C/D环的化学位移和化合物1相应位置进行比较可以发现二者十分相近，提示C-12羟基的空间取向应该也为a。综合分析DEPT，HMQCZH-111COSY，HMBC谱，结合1D-NMR谱，可以将苷元上其余位置的碳氢信号完全归属。糖链在苷元上的连接位点以及糖链间的连接顺序和连接方式，可以通过TOCSY和HMBC谱来得到确认。在TOCSY谱上，从五个糖的端基氢信号出发，可以分别找到归属于同一个自旋耦合系统的五组质子信号；再结合HMQC谱，从氢信号出发，可以进一步追踪确认分属于五个糖的碳信号；在HMBC谱中，可以看到S4.84和5.12的糖端基氢信号分别与C-3(S77.5)和C-26(S75.3)有远程相关，说明在C_3和C-26位各连有一个糖链，分析其化学位移值可以判断连在C-3的为半乳糖，C-26为葡萄糖。另外一个葡萄糖的端基质子(S5.56)与3位半乳糖的4(S80.2)位相关，而其本身的2，3位的碳信号又与另两个葡萄糖的端基氢信号(S4.76，5.29)有远程相关，从而确定了苷元3位糖链的连接顺序及连接方式。分析葡萄糖和半乳糖的端基质子的偶合常数(J=7.8，7.8，7.8，7.8，7.8Hz)可以确定五个糖均为P型。综合以上分析，化合物2为(25R)_26-氧_P_D_葡萄吡喃糖基_5a-呋甾-313，12a，22,26-四醇-3-氧-P-D-葡萄吡喃糖基(1—2)[P_D_葡萄吡喃糖基(1—3)]-P-D-葡萄吡喃糖基(1—4)-P-D-半乳吡喃糖苷，经系统文献查阅发现化合物2为一个未见文献报道的新化合物(具体核磁数据归属见表2)。[OO41]表2化合物2的^-NMR和13C-NMR数据(氖代吡啶)10<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>化合物3:白色粉末，Mp:170172°C，[a]D2°_13.5°(c0.15，H20)，Liebermann-Burchard及Molish反应均呈阳性，遇E试剂显粉红色，提示为呋甾皂苷类化合物。同前方法酸水解给出葡萄糖和半乳糖(2:1)。阳离子FAB-MS(n=1)给出m/z919[M+H]+，757[M+H_162]+，739[M+H_162_H20]+，595[M+H-162X2]+，577[M+H-162X2_H20]+，415[M+H-162X2-162-H20]+，提示分子量为918，且分子中含有3个六碳糖。阳离子HR-ESMS给出919.4948[M+H]+(calcd919.4903)，确认分子式为C45H74019。在化合物的力-NMR谱中，可以看到归属于甾体皂苷元的4个特征甲基氢信号，但其中只有一个信号列分成为双峰(S1.04，d，J=6.8)，这提示可能是由于&。-(:22位形成双键而使得H-21变成了单峰。在"C-NMR谱中，低场区给出S104.1，152.2的C2。_C22双键特征碳信号，证明了该位置双键的存在。在HMBC谱中，S0.85的氢信号与S72.2(d)，47.l(s)，48.5(d)，56.2(d)的碳信号有远程相关，因此将这些碳信号分别归属为C-12，C-13，C-14和C-17，其中，C-12位连有一个-OH。将化合物3的C/D环的核磁数据与化合物1相应位置进行比较发现，二者的化学位移值很相似，因此确定化合物3在C-12位羟基的空间取向也为a。化合物苷元上其它位置及糖链部分的化学位移通过与化合物1比较，并结合ID及2D-NMR图谱可以将化合物3其它位置的核磁数据完全归属。综上所述，化合物3为(25R)_26-氧_P_D_葡萄吡喃糖基_5P-呋甾-20(22)-烯-3|3，12a，26-三醇_3_氧-P_D_葡萄吡喃糖基(1—2)-P_D_半乳吡喃糖苷，经系统文献查阅发现化合物3为一个未见文献报道的新化合物(具体核磁数据归属见表3)。表3化合物3的^-NMR和13C-NMR数据(氖代吡啶)编号13C化合物3编号化合物313C&131.0(t)1.75,1.91(o)C3Gal陽l102.4(d)4.84(d,/=7.6)227.0(t)2.03,1.46Co)281.7(d)4.58(0)375.2(d)4.30(0)376.8(d)4.21(0)431.0(t)1.80,1.95(0)469.9(d)4.53(0)37.1(d)2.21(0)76.5(d)4.04(0)627.1(t)1.26,1.89(0)662.2(t)4.36,4.41(0)726.8(t)2.04，1.49Co)Glc-1106.0(d)5.28(d,J=7.6)835.7(d)1.44(0)275.5(d)4.05(0)933.8(d)1.49(0)378.1(d)4.17(o)121034.9(s)471.8(d)4.31(o)1129.8(t)1.75，1.68(o)78.5(d)3.86(o)1272.2(d)4.21(m)662.9(t)4.29,4.49(o)1348.5(s)C-26Glc-1104.9(d)4.87(d,/=7.6)1447.1(d)2.19(m)275.2(d)4.03Co)1532.5(t)1.92(o)378.6(d)4.19(o)1684.4(d)4.94(o)471.8(d)4.25(o)1756.0(d)2.90(d，《/=10.4)78.4(d)3.89(o)1815.2(q)0.85(s)662.9(t)4.35,4.58(o)1923.9(q)1.02(s)20104.1(s)2111.9(q)1.67(s)22152.2(s)2334.6(t)2.07,2.12(o)2423.7(t)1.75,2.03(o)2533.5(d)1.88(o)2675.0(t)3.65，4.01(o)2717.4(q)0.94((!，/=6.8)实施例2化合物的抗血小板聚集作用2.1材料化合物1、化合物2、化合物3;ADP(Sigma);AR-C67085MX(N6_(2-methylthioethyl)_2_(3，3，3_trifluoropropylthio)_e，y-dichloromethyleneATP，阳性对照)(AstraZenecaUK)，血小板聚集仪(HelenaPacks-4型，USA)。2.2方法2.2.1富含血小板血浆(PRP)制备健康志愿者，男女各5名，中位年龄31岁。一周内未用过阿司匹林、潘生丁等抗血小板药物。抽取静脉血，以枸橼酸钠(1:6)抗凝，125gX10min离心去除红细胞，用血小板洗涤液(138mmol/LNaC1、2.7mmol/LKCl、12mmol/LNaHC03、0.36mmol/LNaH2P04、5.5mmo1/L葡萄糖和lmmol/LEDTA，pH7.4)清洗两次，再用悬浮液(138mmol/LNaC1、2.7mmol/LKCl、12mmol/LNaHC03、0.36mmol/LNaH2P04、0.49mmol/LMgCl2、5.5mmol/L葡萄糖和0.25g明胶，pH7.4)重悬，调整密度为5X107ml。2.2.2血小板聚集率测定及IC5。计算取PRP400iiL，分别加入溶解于0.9%NaCl的不同浓度的上述6种新化合物50yL预处理15min，以20iimol/LADP诱导血小板聚集，采用比浊法测定诱导lOmin内的最大血13小板聚集率。全部的检测在采血后3h内完成。根据各浓度的最大血小板聚集率以及空白组(0.9%NaCl)的最大血小板聚集率计算聚集抑制率。根据以下公式计算<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>IC5。计算公式:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>其中Xm=lg(最大浓度)，I=lg(最大浓度/相临浓度)，P=阳性抑制率之和，Pm=最大抑制率，pn=最小抑制率。2.2.3统计学方法数据以均数±标准差表示，应用spssl3.O统计软件进行单因素方差分析，两两比较采用t检验。2.3结果3种新化合物对ADP诱导的血小板聚集影响有所不同，化合物2和化合物3可以明显减轻血小板聚集的作用，化合物1的作用比较微弱。3个化合物对血小板聚集的抑制作用体现出很好的量效依赖关系(见表4)。表4化合物对ADP诱导的血小板聚集的抑制率浓度血小板聚集抑制率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>n=4x±s，*P<0.05与空白比较实施例3:化合物抑制血小板相关炎症因子表达的作用3.1主要实验仪器PE9700PCR扩增仪(美国)，PE5700荧光定量PCR扩增仪(美国)。3.2方法按前述方法制备PRP，调整密度为5X108接种于于24孔板中，分别加入化合物1、2和3(每种化合物分别加入5、20、80、320iimol/L)AR-C67085MX(10iimol/L)、或PBS预先孵育15min，然后在室温下加入ADP作用5min后收集各组孔板中的血小板，按以下步骤进行荧光定量PCR检测。为确保数据的有效性，每次实验都设阴性对照和标准品，每个样品都平行做2个复孔。3.3实验操作检测流程主要由两个部分构成RNA的提取、逆转录及定量PCR。简要分述如下RNA提取与鉴定(1).引物设计，按PRMER5设计软件设计。(2).RNA的提取，采用的Trizol—步法提取总RNA。RNA提取方法步骤參去除培养液，每孔加入lmlTrizol，混匀后转入已编号的EP管(编号同培养板)，再加入200ii1氯仿，混匀，静置25min;參4°C，12000rpm，15min;參取500上清液，加入等体积的异丙醇，轻摇混匀，可见絮状物(未见絮状物，并不表示没有RNA);參4°C，12000rpm，15min;參弃去上清液，加入lml75%DEPC水配的酒精漂洗一次；參4°C，8000rpm，lOmin;參弃去上清液，晾干，加入30ii1DEPC水溶解，冷冻备用；(3).RNA浓度测定吸取1ii1抽提的RNA用DEPC水稀释10倍后，在Nanodrop上测定RNA浓度，要求以DEPC水做空白对照，同时记录RNA浓度及其0D260/0D280。(4).RNA电泳检测參取lgAgarose+75ml去离子水煮沸，冷却至7(TC左右加入10mllOXMops和15ml甲醛及EB。倒胶至宽口梳子的胶板上，盖上盖子。參取50ml10X电泳缓冲液(Mops)，用去离子水稀释至500ml，倒入电泳槽中，再在电泳缓冲液中添加EB.參取RNA样品3iil，lOXMops2ii1，最后补充DEPC水至20ii1，65。C变性lOmin后立即冷却至4。C，加入2iillOXRNAloadingbuffer,即可电泳。參先把RNA胶放入电泳槽中，100V作用电泳约5min，再在点样孔中点入处理过的RNA样品，100V左右电泳至溴酚蓝至胶的2/3处，取胶拍照。逆转录简要过程(1).融解反应所需的试剂，上下轻微颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用。(2)RNA-PrimerMix的配置反应。(3).RNA变性混匀RNA-PrimerMix,短暂离心，直接65。C变性lOmin后立即放置冰上。[OO97](4).配置逆转录反应液(参见表5)。表5逆转录反应液15试剂组分体积终浓度RNA-PrimerMix13^15XRTReactionBuffer5jilIX25mMdNTPl^ilImM25U/|alRNaseInhibitor25U200，M-MLVRTase200UDEPCH20争FinalVolume25^1在RNA-PrimerMix反应管内加入以下试剂至总体25iU。(5)逆转录反应混匀反应Mix，短暂离心后42。C反应lh。(6)灭活并保存逆转录产物，反应结束后，85t:灭活处理5min，最后-2(rC保存逆转录产物。定量PCR反应体系参见表6。表6定量PCR反应体系试剂组分体积10XPCRbuffer5^1引物2jJ10mMdNTPs1^110XSYBGreenTaqDNA聚合酶2(al模板反应管内加入纯水至总体积50ii1反应条件94。C2min预变性，94。C45s，52。C60s，共10个循环，然后94。C30s，52°C45s，共30个循环，熔解曲线温度60。C。结果分析简易流程(1)在Results下打开Ampplot窗口，在Analysis菜单下选择Analyze自动分析结果。(2)基线(baseline)确定取610个循环的荧光信号。阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，且ct值=40.0为准。(3)点击Quantitation进入结果分析窗口。在Option选项区域进行基线以及阈值线的调整。(4)将校准品拷贝浓度输入，仪器将自动以校准品拷贝浓度的对数值为横坐标，以其实际测得的Ct值为纵坐标给出标准曲线。标准曲线的拟和度应《-0.980，否则视为定量结果无效。16(5)报告相应的拷贝数。3.4统计学方法数据以均数±标准差表示，应用spssl3.O统计软件进行单因素方差分析，两两比较采用t检验。3.5结果1.RNA电泳显示3条带28S、18S、和5S，以28S为主。A260和A280的比值1.83。经RT-PCR扩增后电泳证实产物为CD40和CD40L(见图1)。2.化合物1、2和3都对ADP激活的血小板CD40、CD40L表达都有一定的抑制作用，且体现出一定的量效关系。其中，化合物2和3在320iimol/L浓度时对ADP激活的血小板CD40、CD40L表达有显著的抑制作用(P<0.05)(见图2和3)。1权利要求皂苷类化合物，其特征在于所述皂苷类化合物为化合物1，化合物1为(25R)-26-氧-β-D-葡萄吡喃糖基-5β-呋甾-3β，12α，22，26-四醇-3-氧-β-D-葡萄吡喃糖基(1→2)-β-D-半乳吡喃糖苷，分子量为936，分子式为C45H76O20，结构式为FSA00000009111800011.tif2.皂苷类化合物，其特征在于所述皂苷类化合物为化合物2，化合物2为(25R)-26-氧_P_D_葡萄吡喃糖基_5a-呋甾-3|3，12a，22，26-四醇_3-氧-13-D-葡萄吡喃糖基(1—2)[13-D-葡萄吡喃糖基(1—3)]-13_D_葡萄吡喃糖基(1—4)-P-D-半乳吡喃糖苷，分子量为1260，分子式为(:57119603。，结构式为3.皂苷类化合物，其特征在于所述皂苷类化合物为化合物3，化合物3为(25R)-26-氧-P_D_葡萄吡喃糖基_5P-呋甾-20(22)-烯_3P，12a，26-三醇-3-氧-13-D-葡萄吡喃糖基(1—2)-P_D_半乳吡喃糖苷，分子量为918，分子式为(:451174019，结构式为Rr-(H3a^p-GlcR2=—P-Glc4.如权利要求1所述化合物1用于制备治疗血栓及动脉粥样硬化的药物:5.如权利要求1所述化合物2用于制备治疗血栓及动脉粥样硬化的药物c6.如权利要求1所述化合物3用于制备治疗血栓及动脉粥样硬化的药物c全文摘要皂苷类化合物及其应用，涉及皂苷类化合物。提供3种皂苷类化合物及其应用。3种皂苷类化合物分别为化合物1分子量为936，分子式为C45H76O20。化合物2分子量为1260，分子式为C57H96O30。化合物3分子量为918，分子式为C45H74O19。化合物1、化合物2和化合物3是采用多种分离手段，从中药或天然药物中提取分离得到的3种新化合物，并呈现浓度依赖性，显示良好的量效关系。这说明，这3种新化合物均具有抗血小板聚集及抗血小板炎症作用，可以作为治疗血栓及动脉粥样硬化药物应用。文档编号A61P9/10GK101775063SQ20101010385公开日2010年7月14日申请日期2010年1月26日优先权日2010年1月26日发明者刘世明,区文超,姚新生,孙翠玲,张晓坤,陈海峰申请人:厦门大学;广州医学院第二附属医院