专利名称：斑蝥素测定方法
技术领域：
本发明提供一种针对来源于中药的单体化合物在血浆中含量的测定方 法，特别涉及血浆中斑蝥素测定方法。
背景技术：
斑蝥为芫菁科昆虫南方大斑蝥Mylabris phalerata Pallas或黄黑小斑 蝥Mylabris cichorii Linnaeus的干燥全虫，是我国最早被发现的具有抗 癌作用的中药，其性寒味辛，有大毒。据《神农本草经》记载，斑蝥可以治 疗痈疽、溃疡、癣疮等病症，具有攻毒蚀疽、破血散结的作用。现代药学研 究表明其主要活性成分是斑蝥素(cantharidin)，[化学名]1， 2顺式一二 甲基，3， 6—氧桥六氢化邻苯二甲酸酐。1810年法国药学家Robiquet从绿 芫菁Lytta vesicatoria中首次得到斑蝥素晶体现代药理学证明斑蝥素可干 扰癌细胞核酸及蛋白质代谢，能明显抑制多种动物移植性肿瘤，具有抗癌作 用。在临床上，斑蝥素在治疗癌症和一些疑难杂症方面显示出其独特的疗效。 目前国内市场上有复方斑蝥注射液(商品名为艾迪注射液，国药准字 Z52020236，贵州益佰制药股份有限公司)、复方斑蝥胶囊(国药准字 Z19993294;国药准字Z20003270，宝鸡华西制药股份有限公司；国药准字 ZF20000427)，均证实有较好的抗癌作用。
斑蝥素是白色片状晶体，12(TC升华，熔点215 216。C，极微溶于冷水， 微溶于热水，易溶于丙酮(l g: 40 mL)、氯仿(l g: 65mL)、 二氯甲垸、乙 醚(l g: 560 mL)、乙酸乙酯等油脂(l g: 150ml)为邻苯二甲酸酐结构，在酸性条件下稳定，无共轭吸收基团，紫外吸收弱，多采用气相色谱法测定斑
蝥素的体外含量，2005年中国药典规定用气相色谱法测定芫菁虫内斑蝥素含
斑蝥素为毒性抗癌药，临床用量很小，血药浓度很低，目前没有针对临 床使用剂量下的血浆中低浓度斑蝥素的测定方法，建立对低浓度斑蝥素的测 定方法会对斑蝥素各类制剂的质量控制及用药安全具有重大意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种血浆中斑蝥素测定方法，该方法能够高灵敏 度地测定血浆中低浓度斑蝥素的含量。
本发明目的是通过如下技术方案实现
本发明所述的血浆中斑蝥素测定方法，其特征在于为气相色谱-质谱联 用方法(GC-MS);
其中气相色谱条件为采用(20-40) mX (0.20-0. 35)mmX (0. 20-0. 35) Pm的色谱柱；载气惰性气体；进样口温度230-280°C;进样量:0.5-2W， 柱流量0. 5-2ml/min;升温程序50-7(TC保持lmin，以4-8°C/min升温至 200-240°C，保持lmin，以15-25。C/min升温至260-300。C，保持2-4min;
其中质谱条件为离子源温度230-280°C;接口温度230_280°C;电 子轰击能60-90ev;溶剂切除时间3-5min;单离子检测，m/z=70-135。
本发明所述的一种血浆中斑蝥素测定方法，其优选的气相色谱-质谱联
用方法为
其中气相色谱条件:采用30mX0.25mmX0.25nm色谱柱；载气氦气， 纯度:99.999%;进样口温度250°C;进样方式不分流进样；进样量1W， 柱流量lml/min;升温程序6(TC保持lmin，以6tVmin升温至220°C ，保持 lmin,以20。C/min升温至280。C，保持3min;
其中质谱条件为离子源温度25CTC;接口温度250°C;电子轰击能70ev;溶剂切除时间4min;单离子检测，m/z=90-130，其中m/z值优选128 或96.01。
本发明所述的血浆中斑蝥素测定方法，其中血浆处理方法为
血浆加入3-7M的酸；萃取剂选自氯仿，乙酸乙酯，乙醚，二氯甲烷等油脂 或甲苯，甲醇，乙腈中的任意一种；涡旋震荡80-100秒，14000-16000r/min 高速离心10-25min，吸取上清液，微孔滤膜过滤，氮气常温下吹干，用乙酸 乙酯、甲醇、乙腈、氯仿、甲苯、乙醚，二氯甲垸中的任意一种复溶；优选 乙酸乙酯复溶；所述的酸可以为盐酸、磷酸、硫酸中的任意一种。 本发明所述的血浆中斑蝥素测定方法，其中血浆处理方法优选为
犬血浆500W，加入6M的盐酸200W，涡旋30s;萃取剂为2ml，选自氯 仿，乙酸乙酯，乙醚，二氯甲垸等油脂或甲苯，甲醇，乙腈中的任意一种；涡 旋震荡90s， 15000r/min高速离心15min，吸取上清液1600W， 0.25陶微孔 滤膜过滤，吸取过滤液1400W，氮气常温下吹干，用的乙酸乙酯复溶， 进样1W。
所述萃取剂优选乙酸乙酯。
本发明所述的血浆中斑蝥素测定方法，其特征在于在血浆中加入内标物 氯贝丁酯。具体方法为取500ul的含药血浆，加入200ul的6mol/L的 盐酸，涡旋30s，加入10ul的内标液(28ng/ml)加入2ml的乙酸乙酯，涡 旋90s, 15000r/min高速离心15min，吸取上清液1. 6ml， 0. 25u m微孔滤膜 过滤,氮气常温下吹干，100 u 1乙酸乙酯复溶。
本发明提供了对低浓度斑蝥素的测定，对斑蝥素各类制剂的质量控制及 用药安全具有重大意义。在方法中通过对气相条件中程序升温条件的优化， 使斑蝥素和内标完全分开，却不被血样中的杂质干扰，提高了方法的专属性， 从而使用低分辨率的质谱即可完成定量要求。本发明通过对方法中各参数的 筛选，实现了检测低剂量斑蝥素技术目的，具有良好的精密度和准确度。下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。 实验例1萃取环境选择
取4份500W空白血浆，分别配置成含斑蝥素浓度为11. 5Pg/ml的含 药血浆，加入200WHCL (2.0， 3.0， 6.0, 12M)，加入lml乙酸乙酯，60s 涡旋震荡，吸取上清液，氮气吹干，复溶，进样。
表l斑蝥素萃取酸性环境筛选
盐酸(mol/L) 峰面积
4.0 12454917
5.0 13518188
6.0 20213455
8.0 16207734
以斑蝥素的峰面积值比较，峰面积越大说明斑蝥素的量越大，由表1可 见，500 u 1的含药血浆中加入200 u 1不同浓度的盐酸提取斑蝥素，加入200 u 1的6mol/L的盐酸对斑蝥素的提取率最高。
实验例2精密度和准确度试验
取空白血浆500W，配制成斑蝥素浓度分别为2. 14， 85.6， 256. 8ng/ml
的对照品血浆数份，按本发明实施1的"血浆样品处理方法5. 1"项下处理 每个浓度进行5个样本分析，计算回收率，同一样本， 一日内测定5次，计 算日内变异，每日测定1次，计算日间变异，进行气相色谱-质谱分析。表2斑蝥素日内精密度和日间精密度(n=5)
斑蝥素浓曰内曰间
度XSDRSDXSDRSD
(ng/ml)
2. 142. 560. 3915. 222.371.0819.8
85.682. 822. 002.4186. 666.036. 96
256.8241. 7911.404. 72245. 0921.78.86
由表可知，(内标法计算)日内精密度在2.4-15.2%之间，日间精密度在 6.9-19.8%之间，精密度均小于20%，符合药典中的精密度(RSD〈20%)和准 确度(RSD<20%)的规定，表明此方法准确、可靠。
实验例3回收率试验
按照本发明技术方案所述的方法，配制高(256.8 ng/ml)、中(85.6
ng/ml)、低(2. 14 ng/ml)三种浓度的标准溶液，按照本发明技术方案所述 的方法操作，进样，记录色谱图；另取同样浓度标品直接进样，记录色谱图。 平行测定三份，计算相对回收率与绝对回收率。
相对回收率=(处理后测得量/加入量)X100% 绝对回收率=(处理后测得峰面积/直接测得峰面积)X100% 表3斑蝥素的相对回收率与绝对回收率考察(11=5)(内标法计算)
Goncen.Absolute recovery(%)Relative recovery(%)
(ng/ml)Mean (%)SD (%)RSD (%)Mean (%)SD (%)RSD (%)
2. 1479.53.844. 83110. 76.926.25
85.687.43. 333.83101.28.718.61
256. 885.25.816.8293.86. 506. 93
由表3可知，斑蝥素此方法的绝对回收率在80-87%之间，表明本提取方法 符合生物样品提取的要求，可用于斑蝥素的血浆样品的提取；相对回收率在94_111%之间，结果表明此方法准确，可用于斑蝥素血药浓度的检测。
实验例4非内标法标准曲线的建立与线性范围
取离心管数支，分别精密加入斑蝥素对照品标准液后用氮气吹干，加入 比格犬空白血浆500ul，涡旋振荡30s，配成血浆中含斑蝥素分别为2. 14， 4.28， 8.56， 21.4， 42.8， 64.2， 85.6， 171.2， 342.4ng/ml的标准系列浓 度的血浆样品，按本发明实施例1的"血样处理方法5.2"操作，记录色谱 图，以斑蝥素的峰面积对血药浓度做图，采用加权最小二乘法做回归计算， 结果表明血浆中斑蝥素在2. 14-342. 4ng/ml的浓度范围内有良好的线性关 系。
回归方程为-
y二1886, 5x-9266. 5 (2. 14-342. 4ng/ml) ， r=0. 9952 y=1673. 5x+2791 (2. 14-21. 4ng/ml) ， r=0. 9992 y二1965.9x—27293 (21. 4—342. 4ng/ml) ，r=0. 9902， 最低检测限为0. 5ng/ml (信噪比S/N二3)
本发明无内标法建立的犬血浆中微量斑蝥素的GC-MS检测方法，线性范 围是2. 14-342. 4ng/ml，最低检测限是0. 5ng/ml。 实验例5内标法标准曲线的建立与线性范围
取离心管数支，分别精密加入斑蝥素对照品标准液后用氮气吹干，加入 比格犬空白血浆500 u 1，涡旋振荡30s，配成血浆中含斑蝥素分别为2. 14， 4.28， 8.56， 21.4， 42.8， 64.2， 85.6， 171.2， 342.4ng/ml的标准系列浓 度的血浆样品，按本发明实施例1的"血样处理方法5. 1"操作，记录色谱图及斑蝥素和内标峰面积，以斑蝥素对内标物的面积比值对血药浓度做图， 采用加权最小二乘法做回归计算，结果表明血浆中斑蝥素在
2. 14-342. 4ng/ml的浓度范围内有良好的线性关系。 回归方程为
y=1.03X l(T2x +2. 2X 10—3 (2. 14-342. 4ng/ml), r=0. 9999 y二1.01X 10—2x +2.8X1CT3 (2. 14-21. 4ng/ml) ， r=0, 9997 y:1.03X 10—2x—6.4Xl(T3 (21.4—342. 4ng/ml) ， r二O. 9999，最低检测限 为O. 5ng/ml (信噪比S/N=3)
本发明按内标法计算建立的犬血浆中微量斑蝥素的GC-MS检测方法，线 性范围是2. 14-342. 4ng/ml，最低检测限是0. 5ng/ml。
实验例6特异性实验
经优化气相条件，最终斑蝥素的tK (保留时间^18.30s.内标物的"(保
留时间)^18.55s, R(分离度)大于2.5;选择性监测离子m/z-128。附图1所 示为空白血浆的GC-MS总离子流图，可见在如上所述"气相色谱-质谱条件" 下，血浆中的杂质在斑蝥素和内标物的出峰处无干扰。附图2是空白血浆中 加入斑蝥素对照品和内标物对照品，按照本发明血样处理方法项下处理后的 GC-MS的总离子流图，由图可见，两物质分离良好。附图3是比格犬静脉注 射斑蝥素后80min时取血，按照本发明血样处理方法处理后的GC-MS总离子 流图，由图可知，本实验建立的血浆中微量斑蝥素测定方法，检测的是斑蝥 素的原形产物，且在斑蝥素和内标物的出峰处无血浆中杂质的干扰，两峰峰 形良好，符合药典中"生物样品分析要求"中特异性的要求，表明本方法准 确，可靠。
图1所示为选择性监测m/z=128的空白血浆的GC-MS总离子流图。 图2是空白血浆中加入斑蝥素对照品和内标物对照品经本发明血样处理 方法处理后的GC-MS的总离子流图(选择性监测m/z=128)。 A:斑蝥素，B:内标物。
图3是比格犬静脉注射斑蝥素后80min时取血，按照本发明血样处理方 法项下处理后的GC-MS总离子流图(选择性监测m/z二128)。 A:斑蝥素，B:内标物。
下述实施例均能实现上述实验例所述的效果。 实施例l:斑蝥素犬的体内实验
给药剂量确定参考目前临床斑蝥素的使用剂量静注初始量0.5mg/
日，渐增至2mg/日口服初始量0.5mg/日，渐增至4mg/日。
制定给药方案参照《实验动物学》中人用剂量和不同种动物种类间的
剂量换算关系计算。
犬静注给药为34ng/Kg (相当于人静注量lmg/日)，犬口服给药为102
Ug/Kg (相当于人口服量3mg/日)。
1. 药品
斑蝥素原料药(批号070818， 98. 54%，南京青泽医药科技开发有限公
司)
犬雄性，6只，比格犬，北京通利试验动物养殖场。健康，体重(10.8 ±1.11)
2. 给药
2.1静注给药6只犬实验前禁食12h，静脉注射斑蝥素生理盐水溶液，按体 重给药，剂量34ug/Kg。
采血时间为服药前2min，服药后5、 10、 20、 40、 80、 120、 240、 300min，从前肢静脉取血2ml-3ml，肝素抗凝，以4000r/min离心，分离血浆，冷冻备用。
2.2口服给药5只犬实验前禁食12h， 口服斑蝥素自制胶囊，按体重给药， 剂量102 u g/Kg 。
采血时间服药前2min，服药后0.5, 1， 2， 3， 4, 6， 8， 10， 12h从前 肢静脉取血2m1-3ml，肝素抗凝，以4000r/min离心，分离血浆，冷冻备用。
3、 气相条件
仪器型号使用了两种厂家不同型号的GC-MS仪器,具体如下
(1) THERMO DSQ， TRACE气相系统，单四级杆质量分析器。
(2) Agilent 6890N气相系统5973N质谱仪，单四级杆质量分析器。
色谱条件采用Agilent DB-5MS (30mX 0. 250mmX 0. 25 y m)色谱柱； 载气氦气(纯度99.999%)，进样口温度250°C，进样方式不分流进样， 进样量1W，柱流量lml/min，
升温程序60。C保持lmin，以6。C/min升温至220°C,保持lmin，以20 。C/min升温至28(TC，保持3min。
4、 质谱条件离子源温度250°C，接口温度250°C，电子轰击能70ev， 溶剂切除时间4min。
单离子检测，m/z=128。
5、 血样处理方法
从比格犬前腿静脉取血，肝素抗凝，以4000r/min离心，分离血浆，冷 冻备用。
5. 1:取500ul的含药血浆，加入200ul的6mol/L的盐酸，涡旋30s， 加入10ul的内标物溶液(28ng/ml)加入2ml的乙酸乙酯，涡旋90s， 15000r/min高速离心15min，吸取上清液1.6ml， 0. 25 u m微孔滤膜过滤，氮 气常温下吹干，100ul乙酸乙酯复溶，吸取lul用于GC-MS检测。内标物 为氯贝丁酯(Clofibrate)。
5. 2:取500ul的含药血浆，加入200ul的6mol/L的盐酸，涡旋30s， 加入2ml的乙酸乙酯，涡旋90s， 15000r/min高速离心15min，吸取上清液1.6ml， 0.25um微孔滤膜过滤，氮气常温下吹干，100ul乙酸乙酯复溶，吸 取lul用于GC-MS检测。 6、结果
6.1犬单剂量注射斑蝥素后各时间点的血药浓度，如表4、表5所示。 表4犬单剂量注射斑蝥素后的平均血药浓度(n=6)(内标法)
时间(min)_^_^_20 40_80 120 240 300
平均血药浓度
169.8 131.6 111.6 94.1 55.8 29.3 10.3 4.6
(ng/ml)
±SD±24.9±12.3±18.7 ±18.1 ±18.7 ±10.5 ±8.0 ±2.2
表5犬单剂量注射斑蝥素后平均血药浓度-时间图(n=6)(无内标法)
时间(min) 5 10 20 40 80 120 240 300 平均血药浓度
132.0 108.9 90.9 71.4 44.7 19.6 8.4 2.5
(ng/ml)
±SD±26.6 ±20.3 ±16.6 ±14.6 ±10.4 ±7.2 ±3.6 ±1.3
6.2犬单剂量口服斑蝥素后各时间点的血药浓度，如表6、表7所示。
表6犬单剂量口服斑蝥素后的平均血药浓度(11=5)(内标法)
时间(h)_^_^_^_^_4 6 8 10
平均血药浓度
26.2 40.6 41.4 29.822.8 12.9 5.8 3.3
(ng/ml)
±SD±16.6±15.1 ±14.6±14.9 ±16.8 ±7.7 ±2.4 ±1.3
表73号犬单剂量口服斑蝥素后的血药浓度(无内标法)
时间(h)_0.5 1234 6 8 10
血药浓度(ng/ml)13.5 52.6 32.6 27.116.8 7.5 3.2 2.1
136. 3采用非房室模型，计算药物浓度-时间曲线下面积(AUC)、半衰期(T^)、 生物利用度(F)等药物动力学参数，结果如表8、表9所示。
表8斑蝥素两种给药方式的药动学参数(t^5)(内标法)
CantharidinAUC0~t(ng/ml)-hAUCo~t(ng/ml>h/DMRT T1/2(h)Fr
静注217.21± 35.076.38xl0"41.25 0.866100%
口服204.72±36.172.04x10—43.134.9%
表9 3号犬斑蝥素两种给药方式的药动学参数(无内标法)CantharidinAUC0~t(ng/ml).hAUC。—t(ng/ml>h/DMRT T1/2(h)Fr
静注240.716.33xl(T4l扁 0.76100%
口服153.861.38X10—42.8921.3%
按照本发明的检测方法，实现了对比格犬通过单次静脉给药和口服给 药，测定不同时间点犬血浆中的斑蝥素的血药浓度，进而了解斑蝥素的犬体 内的浓度变化趋势，计算斑蝥素在犬体内的药物动力学参数。采用非房室模 型，用统计矩方法分别计算静脉和口服给药的药物浓度-时间曲线下面积，
计算结果发现，斑蝥素的口服生物利用度为静脉给药的34. 9%。
国内外文献均未见临床使用剂量下的斑蝥素体内药物动力学研究报道。 本发明使用GC-MS方法，建立了临床使用剂量下的血浆中微量斑蝥素的测定 方法，进而对其药物动力学展开了研究，获得了相关的药动学参数，为新剂 型的设计提供了试验依据，对斑蝥素各类制剂的质量控制及用药安全具有重 大意义。
权利要求
1、一种血浆中斑蝥素的检测方法，其特征在于为气相色谱-质谱联用方法；其中气相色谱条件为采用(20-40)m×(0.20-0.35)mm×(0.20-0.35)μm的色谱柱；载气惰性气体；进样口温度230-280℃；进样量0.5-2μl，柱流量0.5-2ml/min；升温程序50-70℃保持1min，以4-8℃/min升温至200-240℃，保持1min，以15-25℃/min升温至260-300℃，保持2-4min；其中质谱条件为离子源温度230-280℃；接口温度230-280℃；电子轰击能60-90ev；溶剂切除时间3-5min；单离子检测，m/z＝70-135。
2、 如权利要求1所述的方法，其特征在于为气相色谱-质谱联用方法，其中气相色谱条件采用30mX0.25mmX0. 25um色谱柱；载气氦气，纯度99.999%;进样口温度250°C;进样量1W，柱流量lml/min;升温程序60。C保持lmin，以6°C/min升温至220°C,保持lmin，以20。C/min升温至280。C，保持3min;其中质谱条件为离子源温度250°C;接口温度250°C;电子轰击能70ev;溶剂切除时间4min;单离子检测，m/z=90-130。
3、 如权利要求2所述的方法，其特征在于质谱条件中m/z值为128或96.01。
4、 如权利要求2所述的方法，其特征在于气相色谱条件中进样方式为不分流进样。
5、 如权利要求1-4所述的任意一种方法，其特征在于血浆的处理方法为血桨加入3-7M的酸；萃取剂选自氯仿、乙酸乙酯、乙醚，二氯甲垸、甲苯、甲醇或乙腈中的任意一种；涡旋震荡80-100秒，14000-16000r/min高速离心10-25min，吸取上清液，微孔滤膜过滤，氮气常温下吹干，用乙酸乙酯、甲醇、乙腈、氯仿、甲苯、二氯甲烷、乙醚中的任意一种复溶。
6、 如权利要求5所述的方法，其特征在于血浆的处理方法为血浆500W，加入6M的盐酸200W，涡旋30s;萃取剂为2ml，选自乙酸乙酯、甲醇、乙腈、氯仿、甲苯、乙醚，二氯甲烷中的任意一种；涡旋震荡 90s， 15000r/min高速离心15min,吸取上清液1600W， 0.25Mm微孔滤膜过 滤，吸取过滤液140(Hi1，氮气常温下吹干，用的乙酸乙酯复溶，进样
7、 如权利要求5所述的方法，其特征在于血浆的处理方法中萃取剂为 乙酸乙酯。
8、 如权利要求5所述的方法，其特征在于血桨中加入内标物氯贝丁酯 (Clofibrate)。
全文摘要
本发明公开了一种血浆中斑蝥素测定方法，该方法为气相色谱-质谱联用，其中气相条件为色谱条件载气惰性气体；进样口温度230-280℃；进样方式不分流进样；进样量0.5-2μl，柱流量0.5-2ml/min；升温程序50-70℃保持1min，以4-8℃/min升温至200-240℃，保持1min，以15-25℃/min升温至260-300℃，保持2-4min；其中质谱条件为离子源温度230-280℃；接口温度230-280℃；电子轰击能60-90ev；溶剂切除时间3-5min；SIM检测，m/z＝128。本发明能够检测血浆中低剂量的斑蝥素，具有良好的精密度和准确度。
文档编号G01N30/00GK101487819SQ20081000076
公开日2009年7月22日 申请日期2008年1月16日 优先权日2008年1月16日
发明者党云洁, 朱春燕 申请人:中国医学科学院药用植物研究所