l双酶切后的pMD19-Tsimple-VP4、pET-32c两种酶 切产物分别进行电泳，胶回收后进行连接，转化至DH5a得到含有重组表达质粒的菌体， 阳性克隆进行菌液PCR鉴定，如图4所示，图中M:2000DNAmarker、1~6:不同可疑菌落 pET-32c-VP4菌液PCR，结果5号为阴性，1~4和6号为阳性；阳性克隆EcoRI和Xhol双酶 切结果如图5所示，图中M: 15000DNAmarker、1~2 :pET-32c-VP4的EcoRI和Xhol双酶切 鉴定。经测序，目的基因VP4序列正确。因此，重组原核表达质粒pET-32c-VP4构建成功。
[0080] 步骤三：制备VP4重组蛋白：
[0081] 1、重组质粒pET-32c-VP4转化至表达菌BL21中
[0082] 将提取的重组质粒pET-32c-VP4转化至感受态宿主菌BL21中，对转化到BL21中 的pET-32c-VP4进行菌液PCR鉴定。
[0083] 2、重组蛋白VP4在宿主菌中的诱导表达
[0084] 重组表达质粒pET-32c-VP4转化至表达菌BL21中并鉴定正确后，进行重组蛋白诱 导表达，VP4重组蛋白诱导表达的条件为：IPTG浓度为0. 6~1. 2mM/L诱导4~12h、温度 为37°C。3、重组蛋白VP4的Westernblot鉴定：
[0085] 用Westernblot方法鉴定重组蛋白，一抗为兔抗DHAV-1血清，二抗为用HRP标记 的羊抗兔IgG，具体操作步骤如下：将诱导表达后含重组蛋白VP4的样品进行SDS-PAGE电 泳，分离胶浓度为12%，电泳后取下胶，转膜缓冲液中。常规方法转印。取出印迹好的PVDF 膜，将其浸润在100%甲醇中l〇sec，用水洗膜三次，将膜放在滤纸上干燥，膜从透明变为半 透明。一抗孵育：用含〇. 05%Tween-20的封闭液按1:100比例稀释的兔抗DHAV-1血清， 37°C孵育lh，弃一抗，用PBS洗膜三次，约10min/次。二抗孵育：用含0. 05%Tween-20的 封闭液1:3000稀释HRP标记的羊抗兔IgG，于37°C孵育箱孵育30min，弃二抗，用PBS洗膜 三次，约10min/次。DAB显色：加入DAB显色液避光反应约5min，不宜显色太久，否则背景 色变黑。
[0086] 4、重组蛋白VP4大量表达菌样品的处理：
[0087] 将过夜培养的pET-32c-VP4/BL2菌液按1 :50加入到含1LLB/Amp液体培养基的 锥形瓶中，37°C水浴锅振荡培养约2h~2. 5h，至细菌生长达到对数生长期，即0D_nm值0. 6 左右。按照诱导表达条件的优化中得到的最佳IPTG浓度、最佳时间和最佳温度继续培养后 于4°C离心机中8000r/min离心10min，收集菌体。菌体用20mMTris_Cl(pH8. 0)与原菌液 体积按1:5比例加入，悬浮菌体，超声破碎仪中间歇破碎菌体，每次隔30秒超声一次，直至 菌体变清亮，后将破碎菌液4°C、12000r/min离心10min，pET-32c_VP4/BL2中重组蛋白VP4 由于是可溶性表达，因此将裂解菌液离心后弃沉淀，上清用于Ni2+-NTA琼脂糖凝胶纯化重 组蛋白VP4。
[0088] 5、重组蛋白VP4的亲和纯化：
[0089] 采用Ni2+_NTA琼脂糖凝胶进行纯化，配制相关液体纯化表达的VP4重组蛋白，将收 集的纯化重组蛋白液进行透析及超滤浓缩置4°C，取样进行SDS-PAGE电泳鉴定收集纯化蛋 白的纯度，可置于-20°C备用，也可进行冻干或于_70°C保存。
[0090] 鉴定结果：Westernblot鉴定VP4重组蛋白的结果如6所示，图6中，Μ:预染蛋白 Marker、1:经IPTG诱导的重组蛋白VP4上清样，VP4重组蛋白能被DHAV-1血清识别，表明 VP4重组蛋白具有良好的反应原性。如图7所示，亲和纯化方式得到纯度和浓度都较高的目 的重组蛋白VP4,图7中，M:蛋白Marker、l:经IPTG诱导的未纯化重组蛋白VP4上清样、2 : 纯化的VP4重组蛋白、3:lmg/ml的1 %BSA。
[0091] 实施例2VP4重组蛋白的表达形式分析及诱导表达条件优化
[0092] 1、表达形式的分析：
[0093] (1)取鉴定正确的表达菌划线接种于含Amp的LB固体培养基，挑单菌落经LB液体 培养基37°C复壮过夜，取2mL菌液接种100mlLB/Amp，37°C水浴锅振荡2. 5~3h，至0D6Mnni 约 0· 6〇
[0094] (2)加入IPTG至终浓度均为0· 4mmol/L，37°C水浴诱导表达4h。
[0095] (3)菌液 4°C、8000r/min离心lOmin，弃上清。
[0096] ⑷加入10mLρΗ8· 0的20mMTris-HCl悬浮菌体，冰浴条件下，超声破碎30sec/ 次，每次间隔30sec，数次，直至菌液清亮为止，经4°C、12000r/min离心lOmin，分别收集上 清和沉淀；沉淀用再2mL8M尿素反复吹打溶解，4°C，8000r/min离心lOmin收集上清得沉 淀溶解物。
[0097] (5)取上清和沉淀溶解物各80yL，加入20yL含β-巯基乙醇的5XSDS上样 buffer，水浴煮沸 10min，8000r/min离心 5min，SDS-PAGE电泳观察。
[0098] (6)若在上清中可见目的条带，则为可溶性蛋白，若在沉淀溶解物中，则以包涵体 形式存在。
[0099] 将重组质粒pET-32c_VP4及对应空载质粒分别转化到BL21中扩大培养，加IPTG 诱导，冰浴超声破碎后得到的上清和包涵体样品处理后，SDS-PAGE电泳结果如图8所示，图 8中，Μ为蛋白Marker、泳道1~3依次为：空pET32c载体转BL21制样；pET-32c-VP4转BL21 超声破碎后的上清；pET-32c-VP4转BL21超声破碎后的包涵体。诱导的含pET-32c-VP4的 BL21表达菌上清中存在VP4表达蛋白条带，大小约为30Kda，沉淀中未出现明显目的VP4表 达蛋白条带，即表达载体pET-32c-VP4在宿主菌BL21中以可溶性形式表达VP4重组蛋白。
[0100] 2、表达条件的优化
[0101] (1)IPTG浓度的优化
[0102] 将含重组质粒pET-32c-VP4的表达宿主菌BL21新鲜菌液lmL接种于50mLLB/Amp 液体培养基中，37°C摇床振荡培养大约2. 5h至0D_nni值为0. 6左右，加入IPTG使其终浓度 为：0· 2mmol/L、0. 4mmol/L、0. 6mmol/L、0. 8mmol/L、1.Ommol/L和 1. 2mmol/L诱导表达 4h，对 样品进行处理后，SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝染、脱色观察。
[0103] (2)诱导时间的优化
[0104] 将含重组质粒pET-32c-VP4的表达宿主菌BL211mL接种于50mLLB/Amp液体培养 基中，37°C摇床振荡培养至0D_nm约0. 6左右，加入IPTG至上述试验得出的最佳浓度，在 分别诱导2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h和16h后，对样品进行处理，SDS-PAGE电泳。
[0105](3)诱导温度的优化
[0106] 将含重组质粒pET-32c-VP4的表达宿主菌BL211mL接种于50mLLB/Amp液体培养 基中，37°C摇床振荡培养至0D_nm约0. 6左右，加入IPTG至终浓度为上述试验得出的最佳 IPTG浓度和最佳诱导时间，然后在25°C、30°C、37°C条件下诱导培养，对样品进行处理后， SDS-PAGE电泳。
[0107] 如图9、10和11所示，经不同IPTG浓度、不同诱导表达时间和不同温度优化后，得 出含重组表达质粒pET-32c-VP4以BL21为宿主菌表达VP4重组蛋白的最佳表达条件是： IPTG浓度0. 6mM/L诱导4h，温度为37°C(其中IPTG浓度在0. 6~1. 2mM/L及诱导时间在 4~12h时，目的蛋白表达量变化不大），图9中：Μ为蛋白Marker、1~6为IPTG诱导浓度 0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. 0 和 1. 2mmol/L;图 10 中：Μ为蛋白Marker、泳道 1 ~8 依次为：诱导 时间2、4、6、8、10、12、14和16h;图11中：Μ为蛋白Marker、泳道1~3依次为：诱导温度 25°C、37°C和30°C的上清，4~6依次为诱导温度25°C、37°C和30°C的包涵体。
[0108] 实施例3
[0109] 一种用于检测1型鸭甲肝病毒抗体的ELISA试剂盒，包括ELISA板、PBST缓冲液、 封闭液、酶标二抗、显色液以及终止液，所述ELISA试剂盒还包括权利要求1所述的1型鸭 甲肝病毒VP4重组蛋白。
[0110] 所述的封闭液为含1 %脱脂奶粉的PBS缓冲液；所述的酶标二抗为HRP标记的兔 或羊抗鸭IgG稀释液。
[0111] 一种制备ELISA试剂盒的方法，包括以下步骤：
[0112] 步骤一：包被：1型鸭甲肝病毒VP4重组蛋白原包被酶标ELISA板，所述VP4重组 蛋白的最佳包被浓度为3. 375μg/ml，100μL/孔，37°C孵育3h后转入4°C过夜，次日PBST 缓冲液洗板3~5次，每次3min，拍干；
[0113] 步骤二：封闭：加入含1 %脱脂奶粉150μL/孔于37°C封闭lh，按照步骤一的方法 洗板，拍干；
[0114] 步骤三：待检血清孵育：加入1:160稀释待检血清，