一种甲肝病毒定量检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明是一种甲肝病毒定量检测试剂盒。具体为：设计并验证了甲肝病毒特异性检测的引物对；通过对实时荧光定量PCR体系的优化，找到了适合定性和定量检测甲肝病毒的最佳荧光定量PCR条件；检测试剂盒中附带有制作标准曲线的标准物质和质控品，可以消除样本间的差异干扰，最大程度上保证定量检测的精确度和准确性，突破了以往甲肝病毒的检测方法上精确度低和不确定性大等缺点；该检测方法灵敏度高，最低检测极限可达10拷贝/μL；同时，该试剂盒重复性好，6次重复实验，组内组间差异无显著性差异（p<0.05）。本方法可以快速、准确地得到样本中甲肝病毒的精确含量。
【专利说明】一种甲肝病毒定量检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于生物分析测试和环境监测【技术领域】，具体涉及一种甲肝病毒核酸定量检测试剂盒，具有极高的灵敏度和精确度。
【背景技术】
[0002]甲型肝炎病毒(!fepatitis A virus，HAV)是一种重要的食源性肠道病毒，能够导致人类严重肝炎。该病毒隶属于小RNA病毒科肝病毒属，病毒颗粒无囊膜，呈二十面体对称结构，直径为27-32nm，其中包含一条正链RNA基因组，长度约为7.5kb。HAV主要通过粪口传播，人与人之间的直接接触或食用被污染的食物和水被认为是HAV传播的最主要方式(Koopmans&Duizer, 2004)。在全世界范围内，每年大约有100万人感染HAV，但是其中有50%病例的感染源不确定(Lee, Lee, Ha, Cheon, &Choi, 2012),甲肝给人民的生命健康造成严重威胁，因此，甲肝病毒的检测和溯源研究非常重要。
[0003]被携带甲肝病毒的粪便污染的生鲜农产品和即食食品是这类病毒性疾病暴发的主要来源，例如以水果、蔬菜为基础的沙拉、菜泥、混合型水果甜点和饮料等，而这类食品在全球范围内生产量和食用量是非常巨大的。被甲肝病毒污染的食物源在运输和处理过程中，就会造成病毒的广泛传播(Lynch, Painter, Woodruff, &Braden, 2006)。此外,用于养殖和制造饮用水的水环境也是甲型肝炎暴发的主要来源之一。人们为了保持鲜嫩的口感，常常不经过加热而直接食 用生的或半熟的贝类，容易造成甲型肝炎的流行。1988年，上海暴发了一次医学史上规模最大的甲肝大流行，即系食用遭甲型肝炎病毒污染水中养殖的毛蚶造成。
[0004]甲肝病毒等肠道病毒自身物理、化学性质比较稳定，在环境和食物中能长期存活，但是却不能复制，在被污染的环境和食物中的病毒含量比较低(10-100感染颗粒)，并且呈现非随机性传播(Cliver, Ellender, &Sobsey, 1983),因此，鉴定甲型肝炎暴发的病毒来源经常会比较困难。但是一旦被人体摄入，即使低剂量的病毒也可导致人类疾病(WenLietal.，1998)，严重危害人类健康。所以开发一种高灵敏度的甲肝病毒的检测方法至关重要。经典的细胞培养法检测周期长，灵敏度低，不适于环境和食物中甲肝病毒的检测。目前，国际上多采用RT-PCR (反转录-PCR)的方法，但是反转录-PCR只能定性检测却不能定量检测病毒，而且其灵敏度不高。而实时荧光定量PCR (Real-time PCR)具有灵敏度高、重复性好、特异性高等优点，利用荧光信号对整个PCR过程进行实时监测，同时还能够对病毒进行定量分析。本发明提供一种高灵敏度、高准确性的甲肝病毒定量检测试剂盒。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高、准确性好和精确度高的定量检测甲肝病毒的试剂盒，该试剂盒为甲肝病毒高效快速的检测与监控提供技术支持。
[0006]本发明解决其技术问题采用以下的技术方案:
[0007]本发明提供的甲肝病毒特异性检测试剂盒，是一种用于甲肝病毒定性和定量检测的试剂盒，该试剂盒中设有荧光定量PCR试剂；PCR酶预混液；据甲肝病毒目标基因片段序列设计的上游、下游引物，其序列分别是SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2。
[0008]所述试剂盒还可以设有标准品和质控品，其中:标准品为一系列含有ΙΟ1、^)2、^)3、104、105、IO6UO7拷贝/ μ I的甲肝病毒质粒分子标准物质，数量为7个；或者标准品为一系列含有IO1UO2UO3,104、105、106、107、IO8拷贝/ μ I的甲肝病毒质粒分子标准物质，数量为8个。质控品为浓度为1027533拷贝/ul的甲肝病毒标准物质。
[0009]所述甲肝病毒目标基因片段序列可以为甲肝病毒基因组中编码VP1-VP3衣壳蛋白中一段长112bp的保守区域序列。
[0010]本发明提供的上述甲肝病毒定量检测试剂盒用于甲肝病毒定性和定量检测，其检测方法包括以下步骤:
[0011](I)分别提取质控品和待测样品的基因组:
[0012]所得基因组纯度为
^-260/280:1.8 ~ 2.0，且浓度不小于10.5ng/ μ I ;精确称取质控
品和待测样品；
[0013](2)反转录:
[0014]将基因组RNA反转录成cDNA ；
[0015](3)荧光定量PCR检测:
[0016]将标准品、质控品核酸和待测样品cDNA分别进行荧光定量PCR ;根据标准品的不同浓度和测得的Ct值制作标准曲线，通过该标准曲线对待测样品进行定量。
[0017]所述的反转录体系可以为125ng 的 RNA template、20 μ M 的 Random hexamerprimer0.5 μ L>20 μ M Oligo (dt) 0.5 μ L>5 μ L5Xreaction buffer (Promega)、20U/ μ LRibolockribo nuclease inhibitorlμ L(TaKaRa)>2.5mM dNTP mix5 μ L (TaKaRa)、
Iμ L200U/ μ L M-MLV Reverse transcriptase (Promega),总体积 25 μ I。
[0018]所述荧光定量PCR反应体系可以为:2XSYBR Green MixlOul，20 μ M上游引物0.5ιι1,20μΜ下游引物0.5ul,模板lul，去离子水补足20ul体系。
[0019]所述荧光定量PCR扩增中反应程序可以为:第一步95°C 3分钟；第二步，95°C 10秒，55°C 30秒40个循环。
[0020]本发明与现有技术相比主要有以下效果:
[0021](I)设计优化甲肝病毒检测引物和实时荧光定量PCR体系，找到了适合甲肝病毒定量检测最佳的荧光定量PCR体系；用流感病毒、丙肝病毒、艾滋病毒的特异性检测引物以及本发明设计的甲肝病毒检测引物对甲肝病毒基因组进行扩增，证实其检测特异性良好；
[0022](2)检测试剂盒中附带有制作标准曲线的标准物质和质控品，可以消除样本间的差异干扰，最大程度上保证定量检测精确度和准确性；突破了以往甲肝病毒的检测方法上精确度低和不确定性大等缺点，可以确保检测结果的准确性和可溯源性；
[0023](3)灵敏度高:
[0024]最低可以定量检测到10拷贝/ μ L的甲肝病毒特异性基因，并能定量检测到20拷贝的甲肝病毒特异性基因。
[0025](4)重复性好:
[0026]从实施例给出的实验结果可证实，以4个梯度稀释的甲肝病毒基因组为样本，每个样本分别进行6次重复实验，组内组间差异无显著性(ρ〈0.05)，说明该试剂盒重复性好。【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1是甲肝病毒检测基因片段引物特异性验证的荧光定量PCR扩增曲线图。
[0028]图2是甲肝病毒标准品的标准曲线(其中图中的横坐标是模板起始拷贝数(浓度)的对数，纵坐标是Ct值)。
[0029]图3是甲肝病毒基因组的标准曲线(其中图中的横坐标是模板起始拷贝数(浓度)的对数，纵坐标是Ct值)。
[0030]图4是甲肝病毒基因组的标准曲线(其中图中的横坐标是模板起始拷贝数(浓度)的对数，纵坐标是Ct值)。
【具体实施方式】
[0031]下面结合实施例及附图对本发明作进一步说明，但不限定本发明。
[0032]实施例1:荧光定量PCR引物设计及特异性验证
[0033]通过查阅甲肝病毒的相关资料，用Beacon Designer7软件设计SYBR Greenreal-time PCR引物。选取甲肝病毒基因组中编码VP1-VP3衣壳蛋白的保守区域，设计甲肝病毒基因组中编码VP1-VP3衣壳蛋白的保守区域基因片段的上游、下游引物，其序列分别是 SEQ ID NO:1 ~SEQ ID NO:2 (表 I),扩增子长度为 112bp ;用 Bio-Rad CFX Manager 仪器在43.0°C -63.(TC的范围进行温度梯度荧光定量PCR，优化退火温度为55°C，并判定引物效果。
[0034]以甲肝病毒基因组cDNA为模板，用非甲肝病毒引物如流感病毒、丙肝病毒、艾滋病毒的特异性检测引物进行荧光定量PCR扩增(表2)。从图1的扩增曲线图中可以看出，用甲肝病毒引物扩增的曲线是呈现“S”型；而用非甲肝病毒引物扩增的曲线则趋近于一条直线。说明甲肝病毒检测引物具有很好的特异性。
[0035]实施例2:标准曲线的绘制
[0036]将标准品用ddH20稀释至1.0X IO7拷贝/ μ L后，依次进行10倍倍比稀释，以不同浓度的稀释物作为模板，标准曲线取1iUO2UO3UO4UO5UO6UO7拷贝/μ L的7个点。如图2所示，不同稀释度甲肝病毒标准品(IO-1O7拷贝/ μ L)，扩增曲线分明，间距均匀。标准曲线线性关系良好Υ=-3.3275Χ+40.799，R2=0.9988，扩增效率为99.77%，检测极限低至10拷贝/ μ L。
[0037]将标准品用ddH20稀释至1.0X IO8拷贝/ μ L后，依次进行10倍倍比稀释，以不同浓度的稀释物作为模板，标准曲线取IO1UO2UO3' IO4、ΙΟ5、ΙΟ6、107、IO8拷贝/ μ L的8个点。如图3所示，不同稀释度甲肝病毒标准品(IO-1O8拷贝/ μ L)，扩增曲线分明，间距均匀。标准曲线线性关系良好Υ=_3.2978Χ+40.638，R2=0.9992，检测极限低至10拷贝/ μ L。
[0038]实施例3:提取病毒RNA，反转录。
[0039]提取病毒RNA:在装有甲肝病毒的EP管中加入Trizol和氯仿(各成分添加的体积比为:病毒液:Trizol:氯仿=1: 2: 1)，震荡30秒，在冰上静置5min后，12000r/min，4°C离心15min ;轻轻吸取上层水相，置于新的EP管中，余下部分丢弃。在盛装水相液体的EP管中加入等体积的异丙醇和IuL Glyco Blue Coprecip (Invitrogen),混匀后在_20°C冰箱中放置2min后，12000r/min，4°C离心IOmin ;弃去上清液，沉淀用200ml75%乙醇(Rnase-free water配制)洗漆，12000r/min,4°C离心IOmin ;再弃去上清液，让沉淀的RNA在室温下自然干燥；用20 μ L Rnase-free water溶解RNA。
[0040] 反转录的体系和条件为:125ng的RNA template (用Rnase-freewater补足12 μ L)>0.5 μ L 的 Random hexamer primer (20 μ M)>0.5 μ L 的 Oligo (dt) (20 μ Μ)。混合均匀后，将反应管置于PCR仪中，70°C，5min后，马上冰浴5min，继续向反应管中加 入:5uL 的 5Xreaction buffer (Promega) > I μ L 的 Ribolockribo nucleaseinhibitor(20U/y L, TaKaRa)、5μ L 的 dNTP mix (2.5mM, TaKaRa)、I μ L 的 M-MLV Reversetranscriptase (200U/ μ L, Promega)。混合均匀，置于PCR仪中，42°C,60min ;95°C,5min,反应完成后将产物置于_20°C储存备用。
[0041 ] 实施例4:荧光定量PCR体系优化
[0042]荧光定量PCR反应体系见表3。调整PCR扩增体系中的引物和DNA模板使用量，得到最优化的反应体系。进行PCR体系优化，得到适合甲肝病毒核酸扩增的最佳条件(表4)。
[0043]实施例5:荧光定量PCR体系重复性验证
[0044]提取好的甲肝病毒基因组测定浓度后进行梯度稀释，通过实时荧光定量PCR做标准曲线，来验证拷贝数和Ct值间是否存在良好的线性关系，其反应体系是否适合样品的定量检测。根据实时荧光定量PCR得到的Ct值与对应模板浓度的关系，绘制标准曲线(图4)。实验结果显示:甲肝病毒核酸扩增曲线效果很好，其标准曲线的R2为0.9952、斜率为-3.42，其扩增效率为96% ；甲肝病毒核酸扩增效果和稳定性良好，此反应体系适合于甲肝病毒的定量检测。
[0045]从表5可看出以4个梯度稀释的甲肝病毒基因组为样本，每个样本分别进行6次重复实验，组内组间差异无显著`性(P〈0.05)。证实甲肝病毒基因的扩增重复性很好。
[0046]实施例6:甲肝病毒的定性和定量检测
[0047]具体步骤如下:
[0048](I)用Trizol法提取待测样品和质控品核酸，分别测定所提核酸的纯度和浓度。所得核酸纯度应为A26(i/28(1:1.8~2.0，且浓度不小于10.5ng/y I。
[0049]质控品为定值为1027533拷贝/ μ I (U=94362)的甲肝病毒标准物质，用移液器精确量取待测样品和质控品。
[0050](2)将不同浓度例如17Uo6Uo5Uo4Uo3Uo2Uo1拷贝/ y I的甲肝病毒质粒分子标准物质和待测样品核酸及质控品核酸作为模板，按照表3进行PCR体系的配制，然后进行荧光定量PCR扩增。配制PCR体系，模板分别是7个标准品、待测样品核酸和质控品核酸；甲肝病毒检测基因片段引物对用ddH20溶解配制成浓度为20 μ M的工作液；每个样品做三个重复试验。标准品和待测样品的Ct值见表6和表7。最低可以定量检测到10拷贝/μ L的甲肝病毒特异性基因，并能定量检测到20拷贝的甲肝病毒特异性基因。
[0051]检测试剂盒中附带有制作标准曲线的标准物质和质控品，可以消除样本间的差异干扰，最大程度上保证定量检测精确度和准确性；突破了以往甲肝病毒定量的检测方法上精确度低和不确定性大等缺点。
[0052](3)样品的定量检测结果及质控:
[0053]根据每个标准品的浓度和测得的Ct值可以得出标准曲线，以及待测样品核酸和质控品核酸的Ct值，根据标准曲线计算得出待测样品和质控品的拷贝数，通过使用质控品监控整个实验流程和确保实验数据的准确和可靠。由表7和图2可知，根据公式一:y=-3.3275x+40.799，可以算出待测样品的核酸浓度为919679拷贝/ μ I。结果表明，质控品的浓度在标准曲线的线性范围内，能够较好地测定目标样品中甲肝病毒的含量。
[0054]表1甲肝病毒VP1-VP3衣壳蛋白保守区域基因片段引物序列
[0055]
【权利要求】
1.一种甲肝病毒定量检测试剂盒，其特征是一种用于甲肝病毒定性和定量检测的试剂盒，该试剂盒中设有荧光定量PCR试剂；PCR酶预混液；据甲肝病毒目标基因片段序列设计的上游、下游引物，其序列分别是SEQ ID NOiUSEQ ID N0:2。
2.如权利要求1所述的甲肝病毒定量检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒还设有标准品和质控品，其中:标准品为一系列含有101、102、103、104、105、106、IO7拷贝/ U I的甲肝病毒质粒分子标准物质，数量为7个；质控品为浓度为1027533拷贝/ul的甲肝病毒标准物质。
3.如权利要求1所述的甲肝病毒定量检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒还设有标准品和质控品，其中:标准品为一系列含有IO1UO2' 103、104、105、IO6、107、IO8拷贝/ μ I的甲肝病毒质粒分子标准物质，数量为8个；质控品为浓度为1027533拷贝/ul的甲肝病毒标准物质。
4.如权利要求1所述的甲肝病毒定量检测试剂盒，其特征在于所述甲肝病毒目标基因片段序列为甲肝病毒基因组中编码VP1-VP3衣壳蛋白中一段长112bp的保守区域序列。
5.权利要求1至4中任一权利要求所述甲肝病毒定量检测试剂盒的用途，其特征是该试剂盒用于甲肝病毒定性和定量检测，其检测方法包括以下步骤: (O分别提取质控品和待测样品的基因组: 所得基因组纯度为 ^-260/280:1.8 ~ 2.0，且浓度不小于10.5ng/ μ I ;精确称取质控品和待测样品； (2)反转录: 将基因组RNA反转录成cDNA ； (3)荧光定量PCR检测: 将标准品、质控品核酸和待测样品cDNA分别进行荧光定量PCR ;根据标准品的不同浓度和测得的Ct值制作标准曲线，通过该标准曲线对待测样品进行定量。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于反转录体系为125ng的RNAtemplate、20 μ M 白勺 Random hexamer primer0.5 μ L>20 μ M Oligo (dt) 0.5μ L>5u L5X reactionbuffer (Promega)>20U/μ L Ribolockribo nuclease inhibitorlμ L(TaKaRa)>2.5mM dNTPmix5 μ L (TaKaRa)、I μ L200U/μ L M-MLV Reverse transcriptase (Promega),总体积25μ I。
7.如权利要求5所述的用途，其特征在于所述荧光定量PCR反应体系为:2XSYBRGreenMixlOul ,20 μ M上游引物0.5ul，20 μ M下游引物0.5ul，模板Iul，去离子水补足20ul体系。
8.如权利要求5所述的用途，其特征在于所述荧光定量PCR扩增中反应程序为:第一步95°C 3分钟；第二步，95°C 10秒，55°C 30秒40个循环。
【文档编号】C12Q1/68GK103805716SQ201410037885
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年1月26日 优先权日:2014年1月26日
【发明者】陈全姣, 隋志伟, 乔煜婷, 高志敏, 赵丽华 申请人:中国科学院武汉病毒研究所