专利名称：用于鉴别鸭瘟病毒的引物组合物及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及动物医学领域，具体涉及用于鉴别鸭瘟病毒的引物组合物及试剂盒。
背景技术：
鸭痕病毒(Duck Enteritis Virus)是引起鸭痕(Duck Plague)的病原,属于一种疱疹病毒，能感染48种以上的雁形目的家禽和野生禽类。鸭瘟，又称鸭病毒性肠炎，是一种急性传染病，其发病率和病死率可达100%，鸭瘟的病变包括血管损伤，胃肠道粘膜的进行性变化，淋巴器官病变和实质性器官的退行性变化。接种鸭瘟弱毒疫苗是控制该病的有效方法。鸭瘟病毒能在三叉神经节形成持续性感染。鸭瘟病毒的诊断方法有病毒中和试验(NT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和PCR试验等。NT、ELISA和普通的PCR方法只能诊断是否是鸭瘟病毒，但无法鉴别鸭瘟病毒是强毒株还是弱毒株。公开的发明专利“一种鉴别鸭瘟病毒强毒与疫苗毒的PCR检测方法”(申请号:201210116719.2)，通过UL2基因差异区分鸭瘟病毒强、弱毒株，但此方法仅能鉴别鸭瘟病毒是强毒还是弱毒，而无法鉴别鸭瘟病毒是欧洲源的强毒，还是中国源的强毒，也无法鉴别是中国的疫苗毒(弱毒)的VAC株或是Clone-03株。
发明内容
本发明的目的是提供用于鉴别鸭瘟病毒的引物组合物，特异性强，能够鉴别样品是否感染鸭瘟病毒；如果样品感染鸭瘟病毒，究竟是欧洲强毒株、中国强毒株、中国疫苗株(弱毒株)VAC株还是中国疫苗株(弱毒株)Clone-03株。本发明的另一目的是提供用于鉴别鸭瘟病毒的试剂盒，能够鉴别样品是否感染鸭瘟病毒；如果样品感染鸭瘟病毒，究竟是欧洲强毒株、中国强毒株、中国疫苗株(弱毒株)VAC株还是中国疫苗株(弱毒株)Clone-03株。本发明的再一目的是提供上述引物组合物的应用。用于鉴别鸭瘟病毒的引物组合物，由上游引物和下游引物组成，所述上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2所示。所述上游和下游引物的浓度为0.01mol/mlo用于鉴别鸭瘟病毒的试剂盒，包括所述引物组合物、PCR缓冲液、dNTPs和ExTaq酶。所述dNTPs 为 dATP、dTTP, dGTP 和 dCTP 的等浓度混合物，所述 dATP、dTTP, dGTP或dCTP的浓度均为2.5Mm。所述弓I物组合物在制备用于鉴别鸭瘟病毒的试剂盒中的应用。一种应用所述引物组合物鉴别鸭瘟病毒的方法:
(1)提取待检样品的DNA；
(2)以步骤(I)中所述DNA为模板，用权利要求1或2所述引物组合物为引物，进行PCR扩增反应，获得PCR产物；(3 )将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，判断所述PCR产物的长度；当PCR产物长度为4430-4460bp时，待检样品感染中国来源的鸭瘟病毒强毒株；当PCR产物长度为3260-3290bp时，待检样品感染欧洲来源的鸭瘟病毒强毒株；当PCR产物长度为920_950bp，待检样品感染中国来源的鸭瘟病毒VAC株；当PCR产物长度为2510-2540bp，待检样品感染中国来源的鸭瘟病毒Clone-03。所述中国来源的鸭瘟病毒强毒株为鸭瘟病毒LH2011株和CHv株中的一种或两种；所述欧洲来源的鸭瘟病毒强毒株为鸭瘟病毒Jansen、Holland、Dll-JW-016和v2085株中的一种或两种以上。步骤(2)中PCR扩增反应的条件为:94°C预变性3min ;94°C变性30sec，52°C退火40sec，72°C延伸 3min40sec，循环 40 次；最后 72°C延伸 IOmin0本发明提供的引物组合物或试剂盒，能够鉴别样品是否感染了鸭瘟病毒；如果感染鸭瘟病毒，究竟是欧洲强毒株、中国强毒株、中国疫苗株(弱毒株)VAC株还是中国疫苗株(弱毒株)Clone-03株。采用本发明的引物组合物或试剂盒鉴别鸭瘟病毒，快速、简便，特异性和敏感性强，而且成本低廉。适用于临床诊断，科学研究，疫苗生产和出入境检测等，应用前景广阔。
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图1为不同毒株鸭瘟病毒的LORFll等位基因序列的比较。图中Jansen、Holland、Dll-Jff-016和v2085株是欧洲鸭瘟强毒株，LH2011和CHv株是中国鸭瘟强毒株，VAC株和Clone-03株是中国疫苗株。该图中，具有相同填充的条带表示相同序列或者仅有个别碱基发生同义或非同义替代的序列；线条引出标注了各段条带的序列长度。图2为应用本发明 试剂盒鉴别鸭瘟病毒毒株的电泳图。图中M:DNA Marker ；Lane1:以鸭瘟病毒v2085株为模板的PCR产物；Lane 2:以鸭瘟病毒LH2011株为模板的PCR产物；Lane 3:以鸭瘟病毒VAC株为模板的PCR产物；Lane 4:以鸭瘟病毒Clone-03株为模板的PCR产物；Lane 5为以鸡胚成纤维细胞为模板的PCR产物。图3为本发明试剂盒特异性试验的电泳图。图中M:DNA Marker ; Lane 1:以鸭瘟病毒V2085株为模板的PCR产物；Lane 2:以鸭瘟病毒LH2011株为模板的PCR产物；Lane3:以鸭瘟病毒VAC株为模板的PCR产物；Lane 4:以鸭瘟病毒Clone-03株为模板的PCR产物；Lane5-14:分别以鸭病毒性肝炎病毒、番鸭细小病毒、禽流感病毒、鸭沙门氏菌、巴氏杆菌、鸭大肠杆菌、鸭疫里默氏菌、传染性法氏囊病病毒、鸡新城疫病毒和鸭坦布苏病毒为模板的PCR产物。图4本发明试剂盒对鸭瘟病毒LH2011株LD5tl敏感性试验的电泳图；其中M-Marker,泳道1-9均为PCR产物，其DNA模板分别提取于:稀释10倍、IO2倍、IO3倍、IO4倍、IO5倍、IO6倍、IO7倍、IO8倍和IO9倍的组织提取物。图5为本发明试剂盒对鸭瘟病毒VAC株TCID5tl敏感性试验的电泳图；其中M-Marker,泳道1-9均为PCR产物，其DNA模板分别提取于:稀释10倍、IO2倍、IO3倍、IO4倍、IO5倍、IO6倍、IO7倍、IO8倍和IO9倍的组织提取物。图6为本发明试剂盒对鸭瘟病毒Clone-03株TCID5tl敏感性试验的电泳图；其中M-Marker,泳道1-9均为PCR产物，其DNA模板分别提取于:稀释10倍、IO2倍、IO3倍、IO4倍、IO5倍、IO6倍、IO7倍、IO8倍和IO9倍的组织提取物。图7为本发明试剂盒对鸭瘟病毒V2085株LD5tl敏感性试验的电泳图；其中M-Marker,泳道1-9均为PCR产物，其DNA模板分别提取于:稀释10倍、IO2倍、IO3倍、IO4倍、IO5倍、IO6倍、IO7倍、IO8倍和IO9倍的组织提取物。图8本发明试剂盒检测鸭组织样本得到的电泳图。图中M:DNA Marker ；Lane I为以鸭瘟病毒v2085株感染鸭的肝脏样品为模板的PCR产物；Lane 2为以鸭瘟病毒LH2011株感染鸭的肝脏样品为模板的PCR产物；Lane 3为以鸭瘟病毒VAC株接种鸭的肝脏样品为模板的PCR产物；Lane 4为以鸭瘟病毒Clone-03株接种鸭的肝脏样品为模板的PCR产物；Lane 5为以健康鸭肝脏样品为模板的PCR产物。
具体实施方式
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实施例1用于鉴别鸭瘟病毒的试剂盒的组成 本发明用于鉴别鸭瘟病毒的试剂盒，包括如下试剂:
(I)引物组合物，由上游引物Primer F和下游引物Primer R组成,其序列如下:
上游引物 Primer F (SEQ ID NO:1): 5，-CATCTCGTGTCAGTTAAAGG-3，，
下游引物 Primer R (SEQ ID NO:2): 5，- AAAACAAGAGTCAAGAGCCG-3，。上游和下游引物的浓度均为0.01mol/mlo制备方法为:由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。引物设计过程:发明人应用Invitrogen软件，参考现公开发表的全部鸭瘟病毒株的LORFll等位基因序列(GenBank登录号:Jansen株，JQ430740.1 !Holland株，JQ595417.1 ;D11-JW-016 株，JQ430739.1 ;V2085 株，JF999965.1 ；LH2011 株，JX885588 ；CHv株，JQ647509.1 ;VAC 株，EU082088.2 ；Clone-03 株，EU294364.1)，在其开放阅读框的上游5bp和下游IOlbp的位置分别设计了引物Primer F和Primer R0鸭瘟病毒Jansen、Holland、Dll-Jff-016和v2085株是欧洲强毒株，鸭瘟病毒LH2011和CHv株是中国强毒株,鸭瘟病毒VAC株和Clone-03株是中国疫苗株(弱毒株)。发明人分析了鸭瘟病毒欧洲强毒株、中国强毒株及中国弱毒株的LORFll等位基因序列，具体见图1。鸭瘟病毒欧洲强毒株的LORFll等位基因的开放阅读框(ORF)为3171bp。鸭瘟病毒中国强毒株的LORFll等位基因序列中则发生了基因片段的插入，使其等位核苷酸序列变为4342bp，同时ORF也发生改变，变为LORFlIA和LORFlIB两个0RF。鸭瘟病毒VAC株(中国疫苗株)的LORFll等位基因大小为828bp，鸭瘟病毒Clone-03 (中国疫苗株)的LORFll等位基因大小为2412bp。另外，发明人发现上述各病毒株LORFll等位基因开放阅读框的上游50bp和下游150bp序列高度同源，因此在其开放阅读框的上游5bp和下游IOlbp的位置分别设计了引物Primer F和Primer R。采用引物Primer F和Primer R，欧洲强毒株的理论扩增长度为3277bp，中国强毒株的理论扩增长度为4448bp，鸭瘟病毒VAC株的理论扩增长度为934bp，鸭瘟病毒Clone-03株的理论扩增长度为2518bp。申请人选择鸭瘟病毒VAC株、Clone-03株，从欧洲来源的强毒株中选择v2085株，从中国来源的强毒株中选择LH2011株，来验证本发明引物组合物及试剂盒的作用、特异性、灵敏度。(2) 10XPCR缓冲液购自大连宝生物工程有限公司。(3) dNTPs,为 dATP、dITP、dGTP 和 dCTP 的等浓度混合物，所述 dATP、d!TP、dGTP 或dCTP的浓度均为2.5mM，购自大连宝生物工程有限公司
(4)ExTaq酶购自大连宝生物工程有限公司，5U/ ii L。
实施例2应用本发明试剂盒鉴别不同来源的鸭瘟病毒毒株
1、材料
9日龄SPF鸡胚，用于制备鸡胚成纤维细胞。鸭瘟病毒LH2011株，是中国强毒株，由本试验室分离鉴定,对鸭的最小致死剂量为 I (T5 I (TVmL。
鸭瘟病毒V2085株，是欧洲强毒株，由德国柏林自由大学兽医学院病毒研究所惠赠，对鸭的最小致死剂量为 Kr4 lO—VmL。(Wang, J.，D.H5per, et al.( 2011 ) "Complete genome sequence of virulent duck enteritis virus (DEV) strain 2085and comparison with genome sequences of virulent and attenuated DEV strains.〃Virus Res.160(1-2): 316-325.)
鸭痕病毒VAC株:中国疫苗株,是弱毒株,来自南京天邦生物科技有限公司。(Li, Y.，B.Huang, et al.(2009)."Molecular characterization of the genome of duckenteritis virus.Virology 391(2): 151-161。Wang, J., D.Hoper, et al.( 2011 )."Complete genome sequence ofvirulent duck enteritis virus (DEV) strain 2085 and comparison with genomesequences of virulent and attenuated DEV strains.Virus Res.160(1-2):316-325.))
鸭痕病毒Clone-03株:中国疫苗株，是弱毒株,来自南京天邦生物科技有限公司。(Wang, J., D.Hoper, et al.( 2011 )."Complete genome sequence of virulentduck enteritis virus (DEV) strain 2085 and comparison with genome sequences ofvirulent and attenuated DEV strains.Virus Res.160(1-2): 316-325.)
ExTaq酶和PCR反应试剂，购自大连宝生物工程有限公司。2、实验方法
2.1鸡胚成纤维细胞的制备
参照《中华人民共和国兽用生物制品规程》2000版附录所述方法进行。2.2鸭瘟病毒的增殖与病毒样本提取
鸭瘟病毒LH2011株和V2085株分别取10倍最小致死剂量肌肉接种2月龄健康非免鸭，待鸭只发病后，取鸭只的肝脏等约0.1-0.5g，加入10倍量无菌纯水，研磨后，反复冻融3次，8000rpm离心15min，取上清作为组织提取物备用。鸭瘟病毒VAC株和Clone-03株分别按
0.01的感染复数感染鸡胚成纤维细胞，当细胞病变(CPE)达60%-70%时，将上清与细胞一起反复冻融3次，8000rpm离心15min，取上清作为组织提取物备用。同时设未感染鸭瘟病毒的鸡胚成纤维细胞为对照，按感染病毒的细胞相同的方法处理。2.3病毒DNA提取
按照下述方法，分别提取各组织提取物的病毒DNA。病毒DNA的提取:①取组织提取物制备的上清液445 ii L，加入10%SDS50 y L，20mg/mL蛋白酶K2.L，混匀；置56°C水浴lh，99°C水浴lOmin，冷却至室温；②加入Tris饱和酹200 u L,混勻，4°C、12000rpm条件下离心5min,取上清。重复2次；③加入Tris饱和酹100 V- L和氯仿100 V- L,混勻，411CUSOOOrpm条件下离心5min,取上清；④加入1/10体积的3mol/L的醋酸钠，和1-2倍体积无水乙醇，上下颠倒混匀，置_20°C条件下40min至数天；⑤4°C、12000rpm条件下离心20min，弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤，4°C、12000rpm条件下离心lmin，弃上清，洗涤2次；⑥置超净台中风干，加入20-100 u L无菌纯水溶解，作为病毒DNA备用。2.4 PCR 反应
以各病毒DNA为模板,分别进行PCR反应。PCR反应体系如下:
权利要求
1.用于鉴别鸭瘟病毒的引物组合物，由上游引物和下游引物组成，所述上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2所示。
2.根据权利要求1所述用于鉴别鸭瘟病毒的引物组合物，其特征在于:所述上游和下游引物的浓度为0.0lmo I/ml o
3.用于鉴别鸭瘟病毒的试剂盒，包括权利要求1或2所述引物组合物、PCR缓冲液、dNTPs 和 ExTaq 酶。
4.根据权利要求3所述用于鉴别鸭瘟病毒的试剂盒，其特征在于:所述dNTPs为dATP、dTTP、dGTP和dCTP的等浓度混合物，所述dATP、dTTP、dGTP或dCTP的浓度均为2.5mM ； 权利要求1或2所述引物组合物在制备用于鉴别鸭瘟病毒的试剂盒中的应用。
5.一种应用权利要求1或2所述引物组合物鉴别鸭瘟病毒的方法: (1)提取待检样品的DNA； (2)以步骤(I冲所述DNA为模板，用权利要求1或2所述引物组合物为引物，进行PCR扩增反应，获得PCR产物； (3 )将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，判断所述PCR产物的长度；当PCR产物长度为4430-4460bp时，待检样品感染中国来源的鸭瘟病毒强毒株；当PCR产物长度为3260-3290bp时，待检样品感染欧洲来源的鸭瘟病毒强毒株；当PCR产物长度为920_950bp，待检样品感染中国来源的鸭瘟病毒VAC株；当PCR产物长度为2510-2540bp，待检样品感染中国来源的鸭瘟病毒Clone-03。
6.根据权利要求6所述鉴别鸭瘟病毒的方法，其特征在于:所述中国来源的鸭瘟病毒强毒株为鸭瘟病毒LH2011株和CHv株中的一种或两种；所述欧洲来源的鸭瘟病毒强毒株为鸭痕病毒Jansen、Holland、Dll-Jff-016和v2085株中的一种或两种以上。
7.根据权利要求7所述鉴别鸭瘟病毒的方法，其特征在于步骤(2)中PCR扩增反应的条件为:94°C预变性 3min ;94°C变性 30sec，52°C退火 40sec，72°C延伸 3min40sec，循环 40次；最后72°C延伸IOmin0
全文摘要
本发明提供了用于鉴别鸭瘟病毒的引物组合物及试剂盒，属于动物医学领域。所述引物组合物，由上游引物和下游引物组成，所述上游引物和下游引物的序列分别如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。所述试剂盒，包括引物组合物、PCR缓冲液、dNTPs和ExTaq酶。采用本发明引物组合物或试剂盒能够鉴别样品是否含有鸭瘟病毒；如果有鸭瘟病毒，究竟是欧洲强毒株、中国强毒株、中国疫苗株(弱毒株)VAC株还是中国疫苗株(弱毒株)Clone-03株。本发明检测方法具有特异、快速、简便、灵敏和经济的优点，适用于科研、生产和临床及出入境检测等，应用前景广阔。
文档编号C12R1/93GK103146848SQ20131011745
公开日2013年6月12日 申请日期2013年4月7日 优先权日2013年4月7日
发明者王继春, 张传健, 许梦微, 王志胜, 侯继波 申请人:江苏省农业科学院