一种重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白及其编码基因和表达方法

专利名称：一种重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白及其编码基因和表达方法
技术领域：
本发明属于生物工程基因领域，涉及一种重组猪白细胞介素2-FC融合蛋白及其编码基因，以及其表达、纯化和包涵体复性方法。
背景技术：
白细胞介素2(Interleukin-2，简称IL-2)是由活化的T淋巴细胞产生的一种重要的细胞因子，能激活T细胞和促进B细胞分化和分泌抗体，诱导产生干扰素，增强单核细胞以及自然杀伤细胞(natural killer cell，简称NK)的杀伤活性，在机体的免疫反应中具有重要的调节作用，是一类天然的免疫增强剂。在医学治疗领域，商品化的重组人白细胞介素2已经用于肿瘤、艾滋病、乙型肝炎等疾病的辅助治疗。在兽药中，由于白细胞介素2能提高疫苗的免疫应答、减少疾病的发生，也展现出广阔的应用前景。目前，对鸡、牛白细胞介素2基因的研究较多，两者均已在原核和真核表达系统中表达。研究显示，鸡的重组白细胞介素2与多种病原疫苗联合使用，可显著提高免疫水平，减少应激，降低疫苗的副作用，从而达到更强的治疗作用。我国是世界上养猪大国，猪的疾病种类繁多，特别是病毒性传染病造成的发病率和死亡率最高，每年给养猪业造成巨大的经济损失，因此对这些病毒性疾病的治疗和预防成为养猪业的首要任务。白细胞介素2增强免疫、抵御病毒的性质使得其在猪的病毒性疾病方面显示出广阔的应用前景，但是针对猪白细胞介素2的研究却并不多见。另一方面,作为小分子量蛋白，猪白细胞介素2也与其他白细胞介素2 —样,存在血浆清除速度较快的缺陷，从 而导致在临床治疗中需要重复多次用药才能达到治疗效果。同样，半衰期短及用药的频繁也将成为使用猪白细胞介素2治疗猪病毒性疾病的瓶颈。IgG免疫球蛋白是人和动物体内的主要抗体，它在体内的半衰期约为20天。其稳定性是由于IgG的Fe片段可与新生Fe受体(FcRn)结合，避免IgG进入溶酶体中被降解。由此可见，可以考虑在猪白细胞介素2上增加IgG的Fe片段来构成融合蛋白，以提高猪白细胞介素2体内半衰期，达到长效的目的。由此，本发明提供一种既能保留猪白细胞介素2原有活性，又可以延长体内半衰期的猪白细胞介素2与Fe片段的融合蛋白。然而，通过大肠杆菌表达的重组蛋白多为不溶解、无活性的细胞内聚集物，即包涵体。包涵体的复性是一个非常复杂的过程，如果复性条件不适宜将会出现分子内二硫键的错配，分子间共价结合或疏水结合形成聚合体，一方面降低重组蛋白的比活率，造成产品质量不合格，同时又产生沉淀析出，影响得率。因此，本发明所要解决的另一个技术问题是采用合适的方法将大肠杆菌表达的蛋白包涵体进行复性。

发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足之处，通过密码子优化的方式，提供一种可在大肠杆菌内高效表达的重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白以及其基因和表达、纯化、复性方法。本发明提供了重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白，所述融合蛋白包括猪白细胞介素2部分和Fe片段部分，其中，猪白细胞介素2部分为猪白细胞介素2胞外区的全部序列，Fe片段部分包括铰链区、CH2区和CH3区，猪白细胞介素2与Fe片段部分之间为直接融合。其中的Fe片段选自人或动物的免疫球蛋白Fe，是Fe全长或是部分序列，Fe选自IgG、IgM、IgD、IgA,每种免疫球蛋白类型包括各亚型,如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4。本发明的融合蛋白中的Fe片段部分特别优选来自猪的IgGl。优选地，本发明的重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，其中第1-134位氨基酸残基为猪白细胞介素2的胞外区序列，第135-334位氨基酸残基为猪IgGl序列。本发明提供了编码上述所述重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白的基因，其碱基序列如SEQID NO:1所示。该序列是专为大肠杆菌表达系统进行密码子优化得到的序列，相比之下能显著提高异源基因在宿主菌中的表达。

本发明还提供了包含了上述所述编码重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白的基因的质粒，所述的质粒优选为原核表达质粒，最优选为pET21b载体。本发明还提供了包含有上述所述质粒的大肠杆菌菌株，优选地，所述菌株选自大肠杆菌BL21 (DE3)菌株。本发明还提供了重组猪白细胞介素2-FC融合蛋白在大肠杆菌表达方法，包括如下步骤:该方法的步骤为:1.挑取I个或多个含有上述所述重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白的大肠杆菌菌落，接入LB培养液，于37 °C培养过夜；2.取适量过夜培养物，接入于所述过夜培养物的100倍量的LB培养液中，于37°C震荡培养至对数中期0D_=1.0 ；3.在培养物中加入IPTG至lmmol/L，于37°C，诱导表达4h后，于4°C以转速5000rpm,离心处理15min,收集含有重组猪白细胞介素2_Fc融合蛋白的大肠杆菌菌体。所述LB培养液中均含有氨苄青霉素50-100 μ g/ml。本发明的上述所述表达方法是经过发明人反复多次实验摸索和验证得到的用于表达重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白的最为有效的方法，该方法的表达量高，且表达得到包涵体复性后活性更高。本发明还提供了重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白的包涵体纯化方法，包括如下步骤:1.将收集得到的上述含有诱导重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白大肠杆菌沉淀，用预冷的PBS重悬，并于4°C高速离心处理；重复一次。2.吸去上清，称菌体沉淀重量，每克(湿重)加入裂解缓冲液Buffer A3_10mL，用磨光玻璃棒搅动，使菌体悬起。3.每克(湿重)菌体加入3-10yL浓度为100mmol/L的PMSF，3-100yL浓度为100mg/mL的溶菌酶，于冰上搅动。4.破碎菌体，样品置于冰上，超声，并于4°C高速离心处理。
5.沉淀用洗涤缓冲液Buffer B洗涤，并于4°C高速离心处理，沉淀包涵体，重复一次。6.包涵体沉淀用变性缓冲液Buffer C溶解，室温下搅拌30_60min。7.充分混匀后室温高速离心处理，弃沉淀，取上清，即得到重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白变性溶液。该纯化方法优选步骤如下:1.将收集得到的上述含有诱导重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白大肠杆菌沉淀，用预冷的PBS重悬，于4°C，以12000rpm的转速离心15min ;重复一次。2.吸去上清，称菌体沉淀重量，每克(湿重)加入裂解缓冲液Buffer A5mL，用磨光玻璃棒搅动，使菌体悬起。3.每克(湿重) 菌体加入5μ L浓度为100mmol/L的PMSF，5y L浓度为100mg/mL的溶菌酶，冰上搅动20min。4.用探针型超声波仪破碎菌体，样品置于冰上，超声120次，每次5s间隔5s，循环三次，每次循环至冷却样品之间等待2min,等待样品冷却。于4°C,以12000rpm的转速离心15min,弃上清。5.沉淀用洗漆缓冲液Buffer B洗漆,于4 ,以12000rpm的转速离心15min,沉淀
包涵体，重复一次。6.包涵体沉淀用变性缓冲液Buffer C溶解，室温下搅拌30min。7.充分混匀后室温下以12000rpm的转速离心15min，弃沉淀，取上清，即得到重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白变性溶液。本发明还提供了优化后的重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白的包涵体复性方法，包括如下步骤:取适量用变性缓冲液Buffer C溶解的重组猪白细胞介素2_Fc融合蛋白变性溶液，用复性缓冲液Buffer D将蛋白浓度稀释到0.2mg/mL，4°C复性至24h时，将复性后重组蛋白溶液用0.45 μ m滤膜过滤，即得到低浓度的重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白溶液。用截留分子量IOKDa的超滤管脱盐、浓缩，低温真空干燥，即获得重组猪白细胞介素2-Fc融合
蛋白粉末。各缓冲液的成分及其含量如下表所示:
缓冲液成分及其含量
Tris-HCl (含量为20mmol/L) , NaCl (介量为0.15mol/L)，EDTA (itBufferA量为lmmol/L),以及PMSF (介量为0.1mmol/L)。溶液基质为蒸
__馏水’ pH为7.5。_
Tris-HCl (介量为20mmol/L): NaCl ( fT量为0.01mol/L) , EDTA ( it BufferB量为lmmol/L) ,TritonX-100 (含S为0.5% (v/v)),以及尿素(含
__量为0.5mol/L),溶液基质为蒸馏水，pH为7.5。_
Tris-HCl (介量为20mmol/L) , NaCl (含量为0.01mol/L) , EDTA (介Buffer C量为lmmol/L), PMSFC 含量为0.1mmol/L),尿素 C含量为8mo丨/L)，
__以及DTT (含为20mmol/L) ο溶液基质为蒸馏水，pH为7.8。
Tris-HCl (含量为20mmol/L) , EDTA (/含量为lmmol/L), GSH: GSSG (mol/mol:10:l)。溶液k质为蒸馏水，pH为7.5。_本发明还提供了重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白在制备治疗和预防猪繁殖与呼吸综合征、猪流感以及猪蓝耳病疾病的药物中的用途。在动物医疗中，由于白细胞介素2能提高疫苗的免疫应答和减少疾病的发生率，重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白与多种病原疫苗联合使用，可显著提高免疫水平，减少应激，降低疫苗的副作用，从而达到较强的治疗作用。重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白也可作为新型免疫佐剂使用，不仅能避免常规佐剂的不良反应，还可以显著增强机体对病毒、细菌和寄生虫疫苗的免疫效力，提高抗体整齐度和延长抗体持续时间，并且还可以降低某些疫苗的副作用。本发明的经优化过的重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白重组基因序列，更适于大肠杆菌表达系统的表达，所表达的重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白远高于猪白细胞介素2-Fc融合蛋白天然基因序列在大肠杆菌表达系统的表达量，并且，与猪白细胞介素2相比，本发明的重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白在保证了猪白细胞介素2活性的基础上较大程度上延长了其在生物体内的半衰期，实现了长效和避免反复用药的目的。同时，本发明所提供的是一种猪源型融合蛋白，更适于用针对猪类病毒性疾病兽药的制备，而本发明所提供的该融合蛋白的原核细胞表达、纯化和复性方法也极大的控制了其制备成本，为其产业化提供了保障。


图1表示重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白密码子优化前后核苷酸序列比较其中，奇数行(即“原始序列”对应的行)为猪白细胞介素2-Fc融合蛋白天然基因核苷酸序列，即密码子优化前的序列；偶数行(即“优化序列”对应的行)为本发明的重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白的基因核苷酸序列，即密码子优化后的序列。图2-a、图2-b为重组猪白细胞介素2_Fc融合蛋白密码子优化前后在大肠杆菌表达宿主中CAI指数。其中，图2-a表示重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白密码子优化前在大肠杆菌表达宿主中CAI指数为0.64 ;图2-b表示重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白密码子优化后在大肠杆菌表达宿主中CAI指数为0.87。图3-a、图3-b为重组猪白细胞介素2_Fc融合蛋白密码子在大肠杆菌表达宿主中最优密码子频率分布区域图。其中，图3-a表示重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白密码子优化前在大肠杆菌表达宿主中最优密码子频率分布区域图，从图中可以看出:重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白密码子优化前序列的低利用率密码子(〈30%)出现百分比为9%;图3-b表示重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白密码子优化后在大肠杆菌表达宿主中最优密码子频率分布区域图，重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白密码子优化前序列的低利用率密码子(〈30%)出现百分比为O。图4-a、图4-b为重组猪白细胞介素2_Fc融合蛋白密码子中在大肠杆菌表达宿主中平均GC碱基含量分布区域图。
其中，图4-a表示重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白密码子优化前在大肠杆菌表达宿主中平均GC碱基含量为:51.19%;图4-b表示重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白密码子优化后在大肠杆菌表达宿主中平均GC碱基含量为:51.34%。图5-a、图5-b为猪白细胞介素2-Fc融合蛋白密码子优化前后mRNA的二级结构预测图。图5-a猪白细胞介素2-Fc融合蛋白密码子优化前mRNA的二级结构预测图，图5_b为猪白细胞介素2-Fc融合蛋白密码子优化后mRNA的二级结构预测图。图6为重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白表达质粒构建过程图。图7为重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白优化基因琼脂糖凝胶电泳图。其中，泳道I为500bp DNA Ladder ;泳道2为NdeI和XhoI双酶切后的pET21b载体；泳道3为两端含有NdeI和XhoI酶切位点的重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白基因PCR产物。图8为重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图及相应的免疫印迹图。图8-a为重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白SDS-PAGE凝胶电泳图。其中，泳道I为(10-230kDa)宽范围的预染的蛋白上样Marker ;泳道2为未加入IPTG诱导的重组猪白细胞介 素2-Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液；泳道3为加入IPTG诱导的重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液。图8-b为重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白免疫印迹图。其中，泳道l(10_230KDa)宽范围的预染的蛋白上样Marker，泳道2为未加入IPTG诱导的重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液:泳道3为加入IPTG诱导的重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液。图9重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白高效表达诱导条件优化SDS-PAGE凝胶电泳图。其中，泳道I为(10_230kDa)宽范围的预染的蛋白上样Marker ;泳道2为0.5mmol/L IPTG诱导Ih重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液；泳道3为0.5mmol/LIPTG诱导2h重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液；泳道4为0.5mmol/L IPTG诱导3h重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液；泳道5为0.5mmol/L IPTG诱导4h重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液；泳道6为lmmol/L IPTG诱导Ih重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液；泳道7为lmmol/L IPTG诱导2h重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液；泳道8为lmmol/L IPTG诱导3h重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液；泳道9为lmmol/L IPTG诱导4h重组猪白细胞介素2_Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液；泳道10为1.5mmol/L IPTG诱导Ih重组猪白细胞介素2_Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液；泳道11为1.5mmol/L IPTG诱导2h重组猪白细胞介素2_Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液；泳道12为1.5mmol/L IPTG诱导3h重组猪白细胞介素2_Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液；泳道13为1.5mmol/L IPTG诱导4h重组猪白细胞介素2_Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液。图10为复性后的猪白细胞介素2-Fc融合蛋白包涵体SDS-PAGE电泳图其中，泳道I为(10_230kDa)宽范围的预染的蛋白上样Marker ;泳道2为超声裂解含有重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白的全菌裂解液；泳道3为用Buffer B第一次清洗后重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白包涵体沉淀；泳道4为Buffer B第二次清洗后重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白包涵体沉淀。图11为重组白细胞介素2-Fc在猪血清中稳定性免疫印迹图。
其中，泳道I为(10_230kDa)宽范围的预染的蛋白上样Marker ;泳道2为未加猪白细胞介素2和重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白猪血清样品；泳道3为加入I μ mol/mL猪白细胞介素2和I μ mol/mL重组猪白细胞介素2_Fc融合蛋白Oh的猪血清样品；泳道4为加入I μ mol/mL猪白细胞介素2和I μ mol/mL重组猪白细胞介素2_Fc融合蛋白0.25h的猪血清样品；泳道5为加入I μ mol/mL猪白细胞介素2和I μ mol/mL重组猪白细胞介素2_Fc融合蛋白0.5h的猪血清样品；泳道6为加入I μ mol/mL猪白细胞介素2和I μ mol/mL重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白1.5h的猪血清样品；泳道7为加入I μ mol/mL猪白细胞介素2和I μ mol/mL重组猪白细胞介素2_Fc融合蛋白3h的猪血清样品；泳道8为加入I μ mol/mL猪白细胞介素2和I μ mol/mL重组猪白细胞介素2_Fc融合蛋白6h的猪血清样品；泳道9为加入I μ mol/mL猪白细胞介素2和I μ mol/mL重组猪白细胞介素2_Fc融合蛋白24h的猪血清样品；泳道10为加入I μ mol/mL猪白细胞介素2和I μ mol/mL重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白48h的猪血清样品；泳道11为加入I μ mo I/ml猪白细胞介素2和I μ mol/mL重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白72h的猪血清样品；泳道12为加入I μ mol/mL猪白细胞介素2和I μ mol/mL重组猪白细胞介素2_Fc融合蛋白120h的猪血清样品。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解，引用实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例1重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白基因优化设计1.密码子优化遗传密码子有64种，但是绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分。那些被最频繁利用的称为最佳密码子(op timal codons)，那些不被经常利用的称为稀有或利用率低的密码子(rare or low-usage codons)。实际上,常用做蛋白表达或生产的每种生物(包括大肠杆菌，酵母，哺乳动物细胞，植物细胞和昆虫细胞)都表现出某种程度的密码子利用的差异或偏爱。大肠杆菌、酵母和果蝇中对含最佳密码子的基因的表达效率明显高于含低利用率的密码子的基因的表达效率。因此，在异源表达系统中，密码子的偏爱性很大程度上影响了重组蛋白的表达。利用偏爱密码子(preferred codons)并避免利用稀有的密码子进行基因合成，这种基因的重新设计叫密码子优化。优化过程充分考虑到蛋白表达不同阶段可能遇到的多种复杂因素，如:密码子适应性、mRNA结构以及转录和翻译过程中不同的顺式元件。因此，本发明对猪白细胞介素2-Fc融合蛋白的基因设计不仅包括密码子优化，还包括mRNA结构修正、翻译起始位点的优化等。2.密码子偏爱性优化密码子偏爱性在原核基因表达中已经被证实是一个很重要的影响因素，它引起了同一密码子在不同生物体之间，蛋白的表达水平之间以及同一操纵子的不同部位间利用率的改变。引起这种偏爱性差异的主要原因是不同细胞内可用的tRNAs量的差异。因此优化翻译系统最佳的方法就是保持密码子的使用频率与同源tRNA之间的平衡。在大肠杆菌中表达哺乳动物基因是不可预测和具有挑战的，如在大肠杆菌中，AGG和AGA所对应的tRNA分子就很少，这种差异很明显会影响基因的表达。3.将低利用率的密码子替换成宿主常用密码子
通常基因中包含的密码子在特定宿主中的利用率越低，该种蛋白的表达量也就越少，甚至当这种密码子存在与蛋白簇间或者N末端的时候表达量会更少。在不改变氨基酸序列的前提下将低利用率的密码子替换为宿主常用密码子能提高功能蛋白的表达水平。任何来源的密码子如果在宿主生物体内的利用率低于5%到10%时，就会出现表达抑制，当这些低利用率密码子临近或相连时，对蛋白表达的影响更大。成簇的低利用率的密码子抑制了核糖体的运动，这是基因不能以合适水平表达的一个明显机制。核糖体翻译由九个密码子组成的信使(含几个低利用率密码子或全部为低利用率密码子)时的运动速度要比翻译不含低利用率密码子的同样长的信使的速度慢。即使低利用率密码子簇位于3’端，信使最后也会被核糖体“拥挤”而损害，核糖体又回到5’端。3’端低利用率密码子簇的抑制效应可以和全部信使都由低利用率密码子组成的抑制效应一样大。如果低利用率密码子簇位于5’端，其效应是起始核糖体数目的全面减少，导致蛋白合成中信使的低效率。去除低利用率的密码子或者容易被误读为终止信号的密码子能够防止低表达或者不表达。4.表达载体和转录启动子虽然密码子偏爱在基因表达中起着重要的作用，但表达载体和转录启动子的选择同样重要，N端核苷酸序列的蛋白表达对于低利用率密码子和接近起始位点的密码子AUG非常敏感。翻译与mRNA的稳定性间也存在着相互的影响，虽然降低翻译效率会使mRNA由于缺少了核糖体的保护而更容易被endo-RNAses分解，但目前还没有它们之间影响的完整解释。其他因素也可以影响蛋白表达，包括使mRNA去稳定的序列。稳定mRNA 二级结构和接近5’端的分子也对基因表达有重要的影响。利用翻译时目的基因上游的开放式阅读框能够成功提高难度基因的表达效率。发明人根据GenBank已公开的猪白细胞介素2 (Sus scrofa interleukin2)的cDNA 序列(GenBank 登录号:NM_213861.1)和猪 IgG Fe 片段(Sus scrofa IgG heavychain)的cDNA序列(GenBank登录号:NM_213828.1)中铰链区、CH2区和CH3区，对这2个基因直接融合并进行密码子优化得到本发明的重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白的基因，如 SEQ ID No:1 所示。下面是对重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白基因进行密码子优化具体步骤:对该基因进行密码子优化后得到本发明的重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白基因，如SEQID No:1所示。下面是对重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白进行密码子优化，优化前后各参数对比如下:1.密码子适应指数(CAI)由图2-a可知，密码子没有优化前，重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白基因在大肠杆菌中密码子适应指数(codon adaptation index, CAI)为0.64。由图2_b可知,通过密码子优化后，使得重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白基因在大肠杆菌中CAI指数为0.87。通常CAI=I时被认为该基因在该表达系统中是最理想的高效表达状态，CAI指数越低表明该基因在该宿主中表达水平越 差，因此可以看出经过了密码子优化后得到的基因序列可以提高重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白基因在大肠杆菌中的表达水平。2.最优密码子使用频率(FOP)
由图3-a可知，基于大肠杆菌表达载体，密码子没有优化前，猪白细胞介素2-Fc融合蛋白基因序列的低利用率密码子出现百分比为9%。这条未进行优化的基因采用串联稀有密码子，这些密码子可能降低翻译效率，甚至能够解散翻译装配物。由图3-b可知，通过密码子优化后，重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白基因在大肠杆菌系统中出现低利用率密码子的频率为O。3.GC 喊基含量(GC curve)GC含量理想分布区域为30%_70%，在这个区域外的出现任何峰都会不同程度地影响转录和翻译效率。由图4-a、图4-b的猪白细胞介素2-Fc融合蛋白基因的GC碱基平均含量分布区域图对比可知，由图4-a中显示猪白细胞介素2-Fc融合蛋白基因中在优化前GC碱基平均含量为51.19%，由图4-b中显示出优化后的序列消除了 GC含量在30%_70%区域外的60个碱基，最终得到优化后重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白的GC碱基平均含量为51.34%ο3.顺式作用元件
权利要求
1.一种重组猪白细胞介素2 -Fe融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括猪白细胞介素2部分和Fe片段部分，所述猪白细胞介素2部分为猪白细胞介素2胞外区的全部序列，所述Fe片段部分包括铰链区、CH2区和CH3区，猪白细胞介素2与Fe片段部分之间为直接融合。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。
3.—种编码权利要求2中所述的融合蛋白的基因，其碱基序列如SEQ ID N0:1所示。
4.一种载体,所述载体含有权利要求3的基因。
5.如权利要求4所述的载体，所述载体为pET21b。
6.一种大肠杆菌，所述大肠杆菌具有权利要求4或5的载体。
7.如权利要求6所述的大肠杆菌，所述大肠杆菌为BL21(DE3)菌株。
8.—种重组猪白细胞介素2 - Fe融合蛋白的原核细胞表达方法，包括如下步骤: (1)在合适的条件下于培养基中培育权利要求6或7中所述的大肠杆菌； (2)从大肠杆菌和/或培养基中分离重组猪白细胞介素2- Fe融合蛋白。
9.如权利要求8所述的表 达方法，包括如下步骤: (O挑取一个或多个含有权利要求6或7中所述的大肠杆菌菌落，接入含抗生素的LB培养液，培养过夜； (2)取过夜培养物转接入于含抗生素的新鲜LB培养液中，于37°C震荡培养至对数中期OD600=L O ； (3)在培养物中加入浓度为Immo I/L的IPTG，37°C，诱导表达4h后，离心处理收集含有重组猪白细胞介素2 - Fe融合蛋白的大肠杆菌菌体沉淀。
10.一种重组猪白细胞介素2 - Fe融合蛋白的纯化和复性方法，其特征在于，包含如下步骤: (1)将收集得到的如权利要求9所述的含有诱导重组猪白细胞介素2- Fe融合蛋白大肠杆菌沉淀，用预冷的PBS重悬，并于4°C高速离心处理，重复一次； (2)吸去上清，称菌体沉淀重量，每克(湿重)加入裂解缓冲液BufferA3 -10mL，用磨光玻璃棒搅动，使菌体悬起； (3)每克(湿重)菌体加入3-10 μ L浓度为100mmol/L的PMSF，3 -100μ L浓度为IOOmg/mL的溶菌酶,于冰上搅动； (4)破碎菌体，样品置于冰上，超声，并于4°C高速离心处理； (5)沉淀用洗涤缓冲液BufferB洗涤，并于4°C高速离心处理，沉淀包涵体，重复一次； (6)包涵体沉淀用变性缓冲液BufferC溶解,室温下搅拌30 - 60min ； (7)充分混匀后室温高速离心处理，弃沉淀，取上清，即得到重组猪白细胞介素2-Fe融合蛋白变性溶液； (8)取适量用变性缓冲液BufferC溶解的重组猪白细胞介素2 - Fe融合蛋白变性溶液，用变性缓冲液Buffer D将重组猪白细胞介素2 - Fe融合蛋白变性溶液的浓度稀释至·0.2mg/mL，4°C透析复性24h，将复性后重组蛋白溶液用0.45 μ m滤膜过滤，即得到重组猪白细胞介素2 - Fe融合蛋白复性溶液； 所述重组猪白细胞介素2 -Fe融合蛋白复性溶液可进一步用截留分子量IOKDa的超滤浓缩、脱盐至最小体 积，低温真空干燥，即获得重组猪白细胞介素2粉末。
全文摘要
本发明提供了一种重组猪IL2-Fc融合蛋白及其编码基因、表达、纯化和包涵体复性方法，属于生物基因工程领域。IL2在疾病发生过程中起到十分重要的免疫调节作用，但其也存在血浆中清除速度较快、产业化成本高的缺陷。为大量获取半衰期较长的猪IL2，本发明采用大肠杆菌原核表达体系提供了一种重组猪IL2-Fc融合蛋白。其中，猪IL2部分为猪IL2胞外区的全部序列，Fc片段部分包括抗体的铰链区、CH2区和CH3区，猪IL2与Fc片段部分之间为直接融合。本发明提供的重组猪IL2-Fc融合蛋白，不仅保存了IL-2的大部分生物活性，而且极大的延长了其半衰期，为低成本大量表达及其产业化提供了保障。
文档编号C12N15/62GK103193887SQ201310117299
公开日2013年7月10日 申请日期2013年4月3日 优先权日2013年4月3日
发明者马永, 王安良, 章成昌, 徐春林, 陈晨, 王耀方 申请人:江苏众红生物工程创药研究院有限公司, 常州京森生物医药研究所有限公司