专利名称：水稻根特异启动子Os02g37190及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体地说，本发明涉及水稻0s02g37190基因的启动子
序列，即从该基因ATG开始上游-1--3500bp之间的核苷酸序列，该启动子序列能够在水
稻转基因调控体系中驱动目标基因在根中特异表达。发明还涉及该序列在基因工程及遗传改良中的应用。
背景技术：
植物基因工程技术的成功应用不仅需要大量调控不同水平的启动子，而且需要适合于不同植物背景、不同的器官、组织、转基因类型的启动子以避免在转基因过程中的不利影响。一直以来，非植物内源的组成型启动子，来自于花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)CaMV 35S(0dell et al.，1985)有着重要的利用价值，能驱动目的基因在单、双子叶转基因植物的所有组织中高效表达(Battraw and Hall, 1990 ；Benfey et al.， 1990a)。植物内源的组成型的启动子ZmUbil是另一个在植物转基因中被广泛使用的启动子，它来自于玉米泛素，是植物内源启动子。研究还发现，ZmUbil启动子在单子叶植物许多的细胞中都有很高的活性，能够调控目的基因在根、叶中强烈表达，但表达水平随着器官的成熟显著下降(Cornejo et al.，1993)。但是，由于组成型启动子驱动的基因在植物的不同组织、不同生长阶段均有高水平的表达，在应用中逐渐暴露出一些问题(Napoli et al.，1990)。外源基因在植物体内大量表达产生许多的异源蛋白或者产生有害物质在植物体内积累，打破了植物体内原有的代谢平衡，影响了植物正常的生长发育，例如生长延缓、开花延迟、甚至造成植物不育或死亡(Pino et al.，2007)。另外，在同一个载体中同时驱动几个不同的基因表达而重复使用同一个组成型启动子容易造成同源基因的沉默与失活或者共抑制现象(Lessard et al., 2002 ；Potenza et al.，2004)。因此，寻找一些能在细胞、组织、器官以及发育各阶段上更为专一地调控基因表达的启动子进行遗传载体的构建，在可控的条件下为基础研究和作物改良创造所需性状显得尤为必要。组织特异性启动子调控基因只在特定的器官、组织、细胞及不同的发育阶段表达，因而可以用于以茎叶为主要收获产物的作物，使蛋白质产物富集于茎叶中，减少宿主植物无谓的物质能量消耗，改善光合作用特性；也可以用于以种子、果实为主要收获产物的作物，让抗虫、抗除草剂等外源基因只在茎叶部分而不在种子果实等器官中表达，以提高转基因作物的生物安全性(Dale et al.，2002)，在植物基因工程研究中具有广泛的应用前景。目前，大多数组织特异启动子的研究主要集中在植物的地上部分，根特异启动子的研究及应用还很少(Potenza et al.，2004)。然而，根与土壤的广泛接触，是植物进行营养、运输、储存等生理功能的重要器官，因此根特异启动子的研究具有广泛的应用价值。利用根特异启动子可以进行土壤污染的生物修复，提高植物的抗旱能力和对盐、碱的耐受力， 大量和微量元素的高效吸收以及增强对病原微生物的抵抗力等；同时，利用根特异启动子研究植物根的发育，根系的形态建成和根构型的重建并进行作物的遗传改良具有重要意义。植物内源的根特异启动子被开发应用之前，非植物内源的的根特异启动子rolD 在根特异表达的转基因研究中发挥着重要作用。发根农杆菌含有Ri质粒，侵染植物后能诱发植物细胞产生毛发状根，即发根瘤。农杆碱型Ri质粒的T-DNA是由左、右两个片段组成， rolD位于TL-DNA上。rolD5'端 _373bp显示出根特异和高水平的表达。序列分析显示启动子区存在一个根特异的基序(RSEs) (Keller and Baumgartner, 1991 ；Elmayan and Tepfer, 1995) 0 rolD启动子现已用于氮的同化研究，包括根特异的胞质型谷氨酰胺合成酶基因和高亲和硝酸盐转运体基因的超表达(Fei et al. ,2003 ；Fraisier et al., 2000)。另一个非植物来源的根特异启动子是CaMV 35S上游_90bp Domain A(Benfey and Chua, 1989)但表达水平比rolD低5-10倍，主要在根尖表达(Elmayan and Tepfer, 1995)。长期以来，烟草根特异表达基因TobRB7在根特异表达的植物转基因研究中起着重要作用，实验显示在主根的顶端分生组织、不成熟的维管组织和侧根中表达很高，而在成熟的叶、茎、茎尖分生组织中没有表达(Conkling et al.，1990)。TobRB7转录起始位点上游636bp序列分析显示其足够调控目的基因在根中特异表达，而299bp长的区域不能调控目的基因在根里特异表达，在_813bp -636bp存在一个负调控元件(Yamamoto et al.，1991)。随着研究的深入，相继报道了一些植物根特异的启动子(Xu et al. , 1995 ； Schiinmann et al,2004 ；delCampillo, 2004 ；Koyama et al. , 2005 ；Nitz et al. , 2001 ； Vijaybhaskar et al. ,2008 ；Liu et al. ,2003 ；Winicov et al.，2004)，然而，能够在基因工程遗传改良和农业生产中应用的仍然很少。直到最近，编码拟南芥根特异表达的黑芥子酶(myrosinase)的PIlO启动子(Nitz et al.，2001)调控CKX3在拟南芥根中特异表达， 与野生型材料相比，转基因植株形成了庞大的根系，主根伸长，根生物量增加，植株地下部与地下部比率加大，而地上部未受任何影响，提高了作物抗旱及吸引矿物质的能力(Werner et al. ,2010) ο另外，用根特异启动子RCc3 (Xu et al.，1995)与组成型启动子G0S2调控 OsNACIO在水稻中过表达研究发现，与G0S2 =OsNACIO相比，RCc3 =OsNACIO使根变大，增强了对干旱的耐受性，在干旱条件下显著提高了作物的产量(Jeong et al.，2010)。综上所述，在植物中，特别是水稻等禾谷类作物基因工程遗传载体构建中能够选用的植物内源的根特异启动子仍然很少，因此，发展更多的水稻等禾谷类作物的根特异启动子对基础研究和生产应用具有重要的意义。关于水稻0s02g37190启动子调控外源基因根特异表达及应用目前还未见相关报道。文中所用的参考文献具体如下1, Battraw MJ, Hall TC (1990) Hi s tochemi cal analysis of CaMV 35Spromoter-β -glucuronidase gene expression in transgenic rice plants. 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发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种水稻根特异启动子0s02g37190及其应用。
7
本发明的目的是提供一种从水稻根中克隆的0s02g27190启动子序列(ATG上游-l--3500bp)，如SEQ ID NO :1 (即序列表中第1项序列)所示的启动子序列，也包括与 SEQ IDNO :1所示的启动子序列至少有80%同源性的基因序列。另外，也包括在SEQ ID NO: 1中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能达到本发明的目的。本发明的另一个目的是提供一种用0s02g37190进行高效的植物转化的方法，具体地说，本发明提供了具有SEQ ID NO :1所示的序列的基因片段的载体。本发明还提供了一种利用0s02g37190构建遗传载体达到植物根特异表达外源基因的方法。为了解决上述技术问题，本发明提供一种水稻调控外源基因在根中特异表达的 0s2g37190启动子，为SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。作为本发明的水稻调控外源基因在根中特异表达的0s02g37190启动子的改进 还包括在SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。本发明还同时提供了上述0s02g37190启动子的用途用于构建根特异表达的转基因植物载体。本发明还同时提供了一种转基因植物细胞，包含SEQ ID NO 1所示的启动子序列的转基因植物细胞。本发明的具体内容如下从水稻基因芯片中发现了 7个在水稻根中特异表达的基因，它们是0s09g24370， 0s04g44060, 0s03g01700, 0s02g44080, 0s02g44310, 0s03g01300, 0s02g37190。 根据 TIGRE (http://rice, plantbiology. msu. edu/)注释，0s02g37190 未知基因，位于 2 号染色体上，519nt，无内含子。RT-PCR及qRT-PCR等实验显示，0s02g37190在水稻的叶和小穗中没有表达，在根中表达量很高，是水稻根特异表达基因。另外，在水稻根中mRNA表达丰度很高，与OsActin 比较，他们的表达水平基本一致。因此，0s02g37190是水稻根特异表达基因，基因的表达水
平很高。通过将0s02g37190启动子(ATG上游_3500bp -Ibp)与报告基因⑶SPlus融合进行遗传受体材料的转化研究，我们发现0s03g01700启动子调控下游报告基因在水稻的主根、侧根的表皮、皮层、内皮层、木质部、韧皮部及侧根原基发生的细胞中都有表达，但在根冠、根毛、根茎结合部、地上部分的茎、叶、颖壳、种子、雄蕊和雌蕊中没有表达。进一步说明了 0s02g37190启动子能够调控目的基因在根中特异表达。以上结果表明，我们克隆的水稻根特异启动子0s02g37190具有一定的应用价值。 我们可以通过利用该启动子对作物品种进行转基因改造，如通过该启动子调控外源基因在根中的特异表达进行土壤污染的生物修复，提高植物的抗旱能力和对盐、碱的耐受力，大量和微量元素的高效吸收以及增强对病原微生物的抵抗力等；同时，利用根特异启动子研究植物根的发育，根系的形态建成和根构型的重建并进行作物的遗传改良。
下面结合附图对理解本发明作进一步的详细描述，但并非对发明作限定。图1是水稻根特异表达侯选基因在根、叶、花中的表达谱分析(RT-PCR分析)；如图所示，0s09g24370 (未知基因)，0s04g44060 (水通道PIP2. 3基因)， 0s03g01700 (柠檬酸盐转运体)，0s02g44080 (水通道TIP2. 1)，0s02g44310 (皮层细胞表达蛋白)，0s03g01300(皮层细胞表达蛋白)，0s02g37190(未知基因，表达蛋白)。图上显示 0s02g37190在水稻的根中表达强烈，但在叶及花中没有表达。图2是水稻根特异表达侯选基因在根、叶、花中的qRT-PCR分析；结果显示0s02g37190为根特异表达基因。图3是水稻根特异表达侯选基因与OsActin在根、叶、花中表达水平的比较；显示0s02g37190在根与OsActin的表达水平很接近，为高水平表达，同时 0s02g37190在叶和花中没有表达，说明这是一个根特异的高水平表达的基因。图4是水稻根特异表达侯选基因与OsActin水稻根特异表达标准曲线；结果显示OsActin的标准曲线的R2 = 1 ；0s02g37190的标准曲线的R2 = 0. 9974 ； 说明标准曲线线性较好。图5是水稻根特异表达侯选基因在根、叶、花中的表达的绝对定量分析；结果显示与植物中表达水平比较高的看家基因OsActin作为对照，根中 0s03g37190的表达水平约为OsActin的21. 5% ；叶和花中均没有检测到0s02g37190的表达水平，这个结果充分说明0s02g37190为水稻根特异表达的基因。图6是⑶S plus载体示意图。图7是水稻根特异表达基因0s02g37190驱动报告基因⑶S载体 0s02g37190promoter :GUS 构建示意图。图8是水稻根特异表达基因0s02g37190驱动报告基因⑶S在水稻各组织中的表达分析；显示0s02g37190 promoter =GUS在水稻的主根、侧根(图a)、根尖(图b)有强烈的⑶S表达。将⑶S染色的根尖进行树脂包埋，横切观察，在根的表皮(印idermis，Ep)、皮层(cortex，Co)、内皮层(endodermis，En)、木质部(xylem，X)、韧皮部(phloem, Ph)(图 c) 及侧根原基部位(lateral root primordium, LRP)(图d)均有⑶S强烈表达。根毛(图 a)、根冠(图b)、根茎结合部(图e)、地上部的颖壳(图f)、雄蕊和雌蕊(图g)、茎(图h)、 叶(图i)、种子(图j、k)均没有⑶S表达。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。实施例1、根特异表达基因的筛选一、样品制备挑选饱满的日本晴野生型水稻种子，剥壳用清水冲洗，后换成清水浸泡，于37°C浸种至露白(1-2天)，期间早晚换水。将发芽的种子直播于3L水稻全营养液中( !1值5.5)， 水稻全营养液母液配方见(表1)，水稻全营养液的具体配制如下，即每4L培养液中加I-VI号贮备液各5ml，调节pH值至5. 5。于水稻光温可控生长室(白天30°C，夜晚22°C，光强 30001UX，光照时间12小时)中生长10天。对地上部和根部分别取样。另取于正常营养液生长至抽穗开花期水稻的小穗，用液氮冻存。所有样品均在-70°C保存以备RNA提取。
表1、水稻完全营养液的配方和母液配方(EDTA-Fe)
试剂
每10升母液中的克数
π m W V
VI
{
NH4NO3914CaCl2886MgS04-7H203240K2SO4714NaH2PO4^H2O403Na2EDTA-2H2093.2FeS04-7H2069.7MnCl2-4H2015.0H3BO39.34(NH4)6-Mo7O24^H2O0.74ZnS04-7H200.35CuSO4-5H200.31每4L培养液中加I-VI号贮备液各5ml，调节pH值至5. 5。二、RNA 提取RNA提取采用Gibico公司Trizol试剂抽提方法，操作步骤如下1)研钵和研棒用液氮预冷，取50 IOOmg组织用液氮充分研磨，加Iml Trizol (样品体积不能超过Trizol的10% )，继续研磨直至完全成为粉末，待融化成勻浆后转入离心管，室温下放置5分钟；2)加入2001氯仿，剧烈摇荡15秒，室温放置2_3分钟，于4°C，15000g离心10分钟；3)取上清，再加入等体积的氯仿，重复上述步骤；4)取上清，加0. 5ml (或等体积)异丙醇，颠倒混勻，室温放置10分钟，于4°C， 12000g离心10分钟；5)弃上清液，用200ml枪头将沉淀块轻轻打碎，加Iml 75%乙醇(0. DEPC水配制)洗涤，于4°C，12000g离心5分钟；6)弃上清液，重复步骤5，弃上清，室温或冷冻干燥；7)用 20-401DEPC 水或 TE 溶解 RNA，于 _70°C冻存。8)用NanoDrop核酸蛋白测定仪ND-1000测其浓度及质量O60/280蛋白去除指标 1. 8 2. 0 ；260/230盐分去除指标1. 8 2. 0)。
0. 1% DEPC H2O 取Iml DEPC水加入IL去离子水中混均，放置过夜后高压灭菌。 75%乙醇50ml DEPC水中加入118. 5g无水乙醇。三、逆转录第一链cDNA合成采用!Iomega公司的M-MLV逆转录酶在进口的0. 5mL离心管内混合下列试剂
权利要求
1.水稻调控外源基因在根中特异表达的说Z/湘启动子，其特征是为SEQID NO 1所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的水稻调控外源基因在根中特异表达的0s02g37190启动子， 其特征是还包括在SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。
3.如权利要求1、2所述的《5化 说77^ 启动子的用途，其特征是用于构建根特异表达的转基因植物载体。
4.一种转基因植物细胞，其特征是包含SEQ ID NO :1所示的启动子序列的转基因植物细胞。
全文摘要
本发明公开了一种水稻调控外源基因在根中特异表达的Os02g37190启动子，为SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。本发明的Os02g37190启动子的用途，用于构建根特异表达的转基因植物载体。本发明还提供了一种转基因植物细胞，其为包含本发明所示的启动子序列的转基因植物细胞。
文档编号C12N15/113GK102154298SQ20111007211
公开日2011年8月17日 申请日期2011年3月24日 优先权日2011年3月24日
发明者吴平, 吴运荣, 张帆, 李援亚, 陈明秀 申请人:浙江大学