一种重组人凝血酶在动物细胞内的高效表达和生产方法

专利名称：一种重组人凝血酶在动物细胞内的高效表达和生产方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域。具体地涉及一种重组人凝血酶在动物细胞内的高效表达和生产方法。
背景技术：
凝血酶是机体凝血系统中的关键酶，生成于损伤处血管内皮细胞，参与凝血过程各个反应环节。凝血酶是由凝血酶原活化变成的一种专一性很强的丝氨酸蛋白类水解酶，由308个氨基酸残基组成，分子质量为36KD。凝血酶是一种双链分子含有A链和B链，两链间由二硫键连接。其中A链含49个氨基酸残基，又称轻链；B链由259个氨基酸残基组成，又称重链(Raimondo De Cristofaro et al. A natural prothrombin mutant revealsan unexpected influence of the A-chain’ s structure on the activity of human a -thrombin. J Biol Chem. 2004，279(13) : 13035- 13043·)。在人体凝血反应过程中，凝血酶直接作用于纤维蛋白原使其转化为纤维状的不溶性纤维蛋白，网住外渗的血细胞,最终形成血液凝块而完成止血过程。由于凝血酶所具有的止血快、无副作用的优点，在临床上应用广泛，常以干粉或溶液局部涂于伤口及手术处，控制毛细血管血液渗出。近年来其应用范围正日渐扩大，由单纯的局部外敷发展到外科手术、耳鼻喉、口腔、妇产、泌尿及消化道等部位出血止血，亦可作为多种外用止血药物的重要原料。传统的工业生产凝血酶的技术已趋成熟，主要是从动物血浆中及人血浆中制备凝血酶原，再经激活物激活而成为凝血酶。但是，这种生产工艺受到血液资源的限制，随着市场需求的增大，已经远远不能满足需求。由于血浆中往往含有大量的病原体和病毒,如牛海绵状脑炎物质、人肝炎病毒和人类免疫缺陷性病毒等，难免会在终产品中产生残留，增加患者感染的几率。不仅如此，产自动物的凝血酶会引起抗体的产生，这些抗体可与人血液发生交叉反应，且往往诱导严重的出血并发症。随着基因工程技术的成熟和发展，利用重组方法大量生产的凝血酶已经成为可能，并且能够克服传统工业生产凝血酶的缺点，具有纯度高、防污染、可量产等优点。有研究表明，采用原核细胞如大肠杆菌作为表达载体,产生的凝血酶往往形成不可溶的包涵体，很难复性和纯化，收率低(K. Soejima, N et al. An efficient refolding method forthe preparation of recombinant human prethrombin-2 and characterization of therecombinant derived alpha-thrombin. J Biol Chemj 200，I 0(2): 269-277·)。更重要的是原核生物不能对蛋白质进行如糖基化、羧基化等的翻译后修饰，而凝血酶活性的发挥恰恰需要这些修饰作用。由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的外源蛋白质，直接被分泌到胞外，不存在形成包涵体的问题，而且在活性方面远胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统，更接近于天然蛋白质。在很多工业生产中，细胞培养过程中不添加动物源性的营养物质，所有成分都已知、可控，避免了病原体或者病毒的残留。高密度培养工艺是重组蛋白和单克隆抗体等生物技术产品规模化工业生产中的主流工艺技术，具有高细胞密度，高产量，闻效率，广品质量可控，和容易实现工艺放大等优点。美国FDA于2008年I月批准了 Zymogenetics公司的重组人凝血酶Recothrom上市，Recothrom是第一个被批准上市的无血衆的重组凝血酶，由带有凝血酶表达载体的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞大规模培养后分泌至培养基中，经过高度纯化制成，后者是通过基因修饰用来生产人凝血酶的细胞系。这些细胞不带有任何已知的病原体，并且产品经过了病毒灭活的程序。基于一项411例病人参加的III期临床研究结果表明，该产品与牛凝血酶有同等的功效，却显著减少抗体产生几率(Chapman WC et al. A phase
3,randomized, double-blind comparative study of the efficacy and safety oftopical recombinant human thrombin and bovine thrombin in surgical hemostasis.J Am Coll Surg, 2007，205(2) : 256-265·)。
然而，采用CHO细胞进行表达时，其表达效率较低，导致生产成本上升等不利因素。因此，本领域迫切需要开发新的、高效表达和制备重组凝血酶的方法。

发明内容
本发明的一个目的是为了克服重组人凝血酶在动物细胞中表达较低、生产成本高，或动物或人血浆来源的凝血酶可能含有病原污染等弱点，提供一种能提高人凝血酶在动物细胞中表达水平的表达载体和方法。本发明的另一个目的是提供上述在动物细胞中所表达的重组人前凝血酶激活和纯化的方法，从而获得可用于临床治疗的人凝血酶。
在本发明的第一方面，提供了一种融合蛋白，所述的融合蛋白是人蛋白C的信号肽序列与缺失Gla结构域的人凝血酶形成的融合蛋白。在另一优选例中，其氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示。在本发明的第二方面，提供了一种编码本发明第一方面中所述的融合蛋白的多核苷酸。在另一优选例中，所述的多核苷酸的序列如SEQ ID N0:5所不。在另一优选例中，所述的多核苷酸的序列是与SEQ ID N0:5简并的序列或同源性彡80% (较佳地90%，更佳地95%)的同源序列。在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第二方面所述的多核苷酸。在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞携带本发明第三方面表达载体，或者所述宿主细胞的染色体或基因组中整合有本发明第二方面中所述的多核苷酸，或者是为所述表达载体或所述多核苷酸所转化的宿主细胞。在另一优选例中，所述的宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞(CH0细胞)。在本发明的第五方面，提供了一种制备人凝血酶的方法，包括步骤
培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而表达所述的融合蛋白，并分泌形成人前凝血酶-2 ；分离或纯化出所述的分泌的人前凝血酶-2 ;和
对上一步骤中获得的人前凝血酶-2进行激活处理，从而形成人凝血酶。在另一优选例中，所述的激活是用伊卡因(ecarin)蛋白进行激活。在另一优选例中，在分离或纯化步骤中包括将人前凝血酶-2经过阴离子柱和疏水柱进行纯化后，再用重组ecarin蛋白激活。在另一优选例中，还包括对于激活后的重组人凝血酶，通过亲和纯化和凝胶过滤层析进行纯化。在另一优选例中，所述的亲和柱是Blue Sepharose 6 Fast Flow柱。在本发明的第六方面，提供了本发明第一方面所述的融合蛋白或第二方面中所述的编码融合蛋白的多核苷酸的用途，它们被用于制备人凝血酶。在本发明的第七方面，提供了一种表达和生产重组人凝血酶的序列和方法，包括步骤
①将含有人蛋白C的信号肽序列与Gla结构域缺失的人凝血酶基因融合，形成表达融合蛋白(人蛋白C-凝血酶2融合蛋白，pc-PT2)的编码基因；
②将上述编码基因插入包含有效的启动子(CMVpromotor)、牛生长因子polyA(bovine growth factor hormone polyA)、鸡 beta-肌动蛋白启动子、DHFR 基因、SV40polyA信号序列的表达载体pGN的多克隆位点,形成重组的表达载体；
③将重组表达载体转染动物细胞，并选出表达所述融合蛋白的宿主细胞；
④培养上一步骤中获得的宿主细胞，从而表达人前凝血酶-2;和
⑤分离纯化所述的人前凝血酶-2;和
⑥激活人前凝血酶_2，从而获得人凝血酶。在另一优选例中，所述方法包括经过阴离子柱和疏水柱纯化后，采用纯化的重组ecarin激活，再经亲和纯化和凝胶过滤层析后，高产率地获得高比活性的重组人凝血酶。在另一优选例中，在步骤③中，所述的细胞是dhfr基因缺陷的中国仓鼠卵巢细胞(CHO-dhfr-)，并且通过MTX加压选出表达融合蛋白的宿主细胞，所述宿主细胞可高表达编码蛋白质(人前凝血酶_2)。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。


图I显示了 pc-PT2和th_PT2电泳图谱。其中，各泳道如下1，2分别为pc_PT2和th-PT2 PCR电泳结果，3为分子量标准。图2显示了 pGN/pc_PT2和pGN/th_PT2质粒酶切电泳图谱。其中，各泳道如下1，2分别为pGN/pc-PT2和pGN/th-PT2酶切电泳结果，3为分子量标准。图3 显示了 pGN/pc_PT2 和 pGN/th_PT2 质粒构建图谱。其中，“pUC19 backbone”表示pUC19骨架；“promoter”表示启动子。图4显示了不同筛选压力下两种前凝血酶表达细胞株表达情况比较。图5显示了 SDS-PAGE电泳检测5 L细胞反应器培养上清中重组人前凝血酶2随时间变化的累积量。其中，各泳道如下1.培养5天上清；2.培养6天上清；3.培养7天上清；4.培养8天上清；5.培养9天上清；6.培养10天上清；7.培养11天上清；8.培养12天上清；9.对照品。图6显示了 ELISA检测5 L细胞反应器培养上清中重组人前凝血酶2随时间变化
的累积量。图7显示了 pGN/ecarin的质粒图谱。图8显示了 dot-blot检测900 nM ecarin蛋白的表达。+为阳性对照品(300ng)，-为阴性对照(Excell-302培养基)。图9显示了 ecarin的中试电泳图。其中，各泳道如下2_9分别为伊卡因生物反应器生产第1、7、8到13天样品。
图10显示了伊卡因的纯化结果。其中，泳道I为分子量标准，泳道2为Ecarin。图11显示了重组人前凝血酶-2活化图谱。各泳道如下1，2分别为活化前和活化后的人前凝血酶-2; 3为分子量标准。图12显示了凝血酶的活性检测-酶切含有凝血酶酶切位点的目的蛋白。各泳道如下1为使用牛凝血酶，2为使用与牛凝血酶相同活性单位的ecarin活化重组人凝血酶(其活性单位由实例13中检测方法确定)。3为未酶切前的目标蛋白，该蛋白含有凝血酶识别位点。图13显示了纯化终产品SDS-PAGE图谱。各泳道如下1.凝血酶(还原型，5微克)；2.分子量标准；3.凝血酶(非还原型，5微克)。图14显示了 SEC-HPLC检测凝血酶纯化、激活终产品纯度大于95%。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，本发明采用基因工程技术，将人蛋白C信号肽与prethrombin-2嵌合基因在pGN高效表达载体系统和CHO细胞中，其表达水平显著提高了约3倍。此外，还采用优化的生产纯化和激活工艺，提高了重组人凝血酶最终得率。在此基础上完成了本发明。本发明方法制备的重组人凝血酶可成为用于临床治疗，成为安全有效的药品。此外，本发明还提供了被该表达载体转化的动物细胞；提供了一种利用该转化后所产生的表达重组人凝血酶的细胞株；以及提供了生产、活化和纯化人凝血酶的工艺。
在本发明中，编码重组人凝血酶的融合基因以及其他元件(如启动子、标记基因、polyA序列、间隔序列)的核苷酸全长序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。以融合基因为例，对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列片段。然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、酵母质粒、植物细胞病毒、或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。通常，将获得的用于构成本发明表达盒的各元件，按正确的顺序连接在一起，就可形成本发明的表达盒。然后，将本发明的表达盒插入常规的或市售的表达载体，即可形成本发明的表达载体。本发明的适合在动物细胞中高效表达人重组人凝血酶的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞宜为动物细胞等。优选的宿主细胞是肾细胞、CH0，更佳地，宿主细胞是CHO细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下 进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。哺乳动物细胞系的合适培养液和培养方法是本领域熟知的，例如可见US5, 633, 162中的描述。用于实验室烧瓶培养或低密度细胞培养可满足特定类型细胞需要的标准细胞培养液的例子包括但不限于Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640培养液(Morre, G, The journal of the American Medical Association, 199:519，1967)、L-15 培养液(Leibovitz, A 等,Amer. J. of Hygiene, 78:173, 1963) >Dulbecco 改良 Eagle 培养液、Eagle 最简单基础培养液(Eagle，s minimal essential medium, MEM)、Ham F12 培养液(Ham, R等，Proc. Natl. Acad. Sc. 53:288, 1965)或缺少白蛋白、运铁蛋白和卵磷脂的Iscoves 改良 DMEM(Iscoves 等，J. Exp. med. 1:923, 1978)。例如，Ham FlO 或Fl2 培养液是专门为CHO细胞培养设计的。特别适合于CHO细胞培养的其它培养液见EP-481 791中所述。已知此类培养液中可增添胎牛血清(FBS，也称为胎小牛血清FCS)，后者提供了天然来源的丰富激素和生长因子。目前哺乳动物细胞的培养是常规操作，在科学教科书和手册中有全面的描述，细节可参见R. Ian Fresney,《动物细胞的培养》(Culture of Animal cells),手册，第 4 版，ffiley-Liss/N. Y.，2000。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结
口 ο本发明的主要优点包括本发明的融合基因可高效地在动物细胞中表达重组人前凝血酶，用于构建和获得高表达重组人凝血酶的动物细胞株。另外，通过优化的纯化工艺，可以获得高比活的人凝血酶。所获得的活化凝血酶具有与商业产平同等或更高的生物活性，因此，可用于多种临床疾病的治疗。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例I :人前凝血酶-2基因的制备
步骤一、
以抽提的人肝细胞mRNA为模板，以Oligo-dT为引物，采用逆转录的方式合成第一链cDNA。以cDNA为模板，用高保真DNA聚合酶进行PCR反应。其引物序列如下
弓I物 I : tgctgcggatccgcaaacgtcgtaccgccaccagtgagta (SEQ ID NO: 11)；
弓I物 2 : atatgcggccgcctactctccaaactgatcaatga ； (SEQ ID NO: 12)
弓I物 3 tgctccagcgggtccggcgaaccgccaccagtgagtacca (SEQ ID NO: 13)
引物I含有人蛋白C信号肽C端序列和人前凝血酶-2 N端编码序列，引物2含有人前凝血酶-2 C端编码序列并引入Not I酶切位点，其产物为含有人蛋白C信号肽部分序列和人前凝血酶-2完整编码区的嵌合基因，其序列如SEQ ID NO: I
引物3含有人凝血酶原信号肽c端和人前凝血酶-2 N端编码序列，引物2和引物3的扩增其产物为含有人凝血酶原信号肽和人前凝血酶-2完整编码区的嵌合基因，其序列见SEQ ID NO:2。步骤二、
以人肝细胞cDNA为模板，以下列序列为引物合成人蛋白C信号肽 弓I物 4: ataggtaccgccgccaccatgtggcagctcacaagcct (SEQ ID NO: 14)
弓丨物 5 : tactcactggtggcggtacgacgtttgcggatccgcagca (SEQ ID NO: 15)
引物 6 atggcgcacgtccgaggcttgcagctgcctggctgcctggccctggctgccctgtgtagccttgtgcacagc (SEQ ID NO: 16)
弓丨物 7 tggtactcactggtggcggt tcgccggacccgctggagca (SEQ ID NO: 17)
引物4和引物5为人蛋白C信号扩增引物，引物4引入Kpn I酶切位点，引物5含有人前凝血酶-2 N端序列，其产物为人蛋白C信号肽和人前凝血酶-2 N端序列的嵌合基因，其序列如 SEQ ID NO:3。引物6和引物7为人凝血酶原信号肽扩增引物，引物6为含有人凝血酶原信号肽N端序列并在5’端引入Kpn I酶切位点，引物7含有人前凝血酶-2 N端序列，其产物为人凝血酶原信号肽和人前凝血酶-2 N端序列的嵌合基因，其序列见SEQ ID N0:4。步骤三、
以上述步骤一和步骤二的产物为模板，以引物3和引物2进行PCR，其产物序列如SEQID NO: 5所述，在其两端分别引入Kpn I和Not I酶切位点，其电泳结果可参见图I和图2。表达的PC-PT2融合蛋白的序列见SEQ ID N0:6。以上述步骤I和步骤2的产物为模板，以引物5和引物2进行PCR，其产物序列如SEQ ID NO:7所述，在其两端分别引入Kpn I和Not I酶切位点，其电泳结果可参见图I和图2。其表达的th-PT2融合蛋白序列见SEQ ID NO:8。实施例2 :人前凝血酶-2表达质粒的构建扩增产物和PGN载体(见中国专利200910052576. I)分别以Kpn I和Not I双酶切，纯化酶切产物后，以T4 DNA连接酶按连接扩增产物pGN载体(摩尔比3 :1)，连接成环。构建表达质粒pGN/pc-PT2和pGN/th-PT2，其质粒图谱见图3。实施例3 :利用动物细胞表达人前凝血酶-2
使用实施例2所述的表达质粒转染常规的DHFR缺陷型的中国仓鼠卵巢细胞CHODG44(G Urlaub 等，somatic 细胞，Mol. Genet. , 12，p555_556, 1986，以下称 CH0)。该细胞采用商业无血清Excell-302培养基(Sigma公司)加入次黄嘌呤和胸腺嘧啶(HT)正常培养，转染采用电转染的方法，其过程如下所述对数生长期的CHO细胞，在转染前24小时离心换液，用新鲜培养基重悬并吹打成单细胞悬液；转染时将细胞离心并按照IO7细胞每毫升的密度重悬，取O. 8 mL放入O. 4 cm的电击杯中；加入200微克的表达质粒pGN/pc-PT2或pGN/th-PT2，轻轻混匀，避免气泡产生；冰浴10分钟；电转染条件为电压300伏、电容975微法拉、电阻1000欧。电击结束后室温静置10分钟，转入含302培养基的培 养瓶中，孵育箱培养。转染后的细胞在连续培养12-14天后，用含20 nM的氨甲喋呤(MTX)的302培养基稀释和接种入96孔板。细胞生长到11-13天的时候，用间接ELISA的方法检测人前凝血酶-2的表达。取表达较高的克隆株，进行进一步加压筛选。其流程为将高表达的克隆株移到已经含有更高浓度MTX的96孔板孔中进行加压。用间接ELISA的方法检测人前凝血酶_2的表达。重复这一步骤，逐渐提高MTX浓度。使用的MTX浓度为20、40、60、90、130、200、300、450,600,900 nM MTX0通过MTX浓度上升选出抗MTX的细胞株，用有限稀释法进行亚克隆制备，采用间接ELISA方法进行表达量检测。实施例4 =CHO细胞产生前凝血酶-2的水平
表达人前凝血酶-2的CHO细胞亚克隆株，包括pGN/pc-PT2质粒转染的细胞株和pGN/th-PT2质粒转染的细胞株，在市售的Excell-302培养基(Sigma公司)条件下，以2X IO5/mL密度接种于直径10 cm的一次性培养皿，37度，5%C02,95%相对湿度进行培养。24小时计数细胞密度，取上清，离心用于ELISA检测。ELISA采用间接ELISA方法，其过程如下
人α -凝血酶标准品按照I μ g/mL为起始浓度，倍比稀释后每孔50 μ L的量包被在酶标板；取培养上清分别用PBS以不同稀释倍数稀释，按每孔50 μ L的量包被；包被采用ρΗ9. 6的O. I M碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液4度包被过夜；
弃去液体，用封闭液(含O. 5%BSA的PBST)洗涤3次，然后加入用封闭液1:2000稀释的抗人α凝血酶单抗溶液100 μ L，37度孵育I小时；
弃去液体，用封闭液(含O. 5%BSA的PBST)洗涤3次，然后加入用封闭液1:5000稀释的HRP标记的抗鼠IgG 二抗溶液100 μ L，37度孵育I小时；
弃去液体，用封闭液(含O. 5%BSA的PBST)洗涤3次，加入50 μ LTMB液体，显色15分钟，450 nm波长检测表达。通过实验检测不同筛选浓度下的两种表达细胞株的人前凝血酶表达水平，其表达量结果见图4。其中，20到135 nM两个细胞均选取20株克隆进行比较；200到900 nM各选取10株克隆进行表达比较。可见采用蛋白C信号肽的pGN/pc-PT2质粒转染的细胞株比采用凝血酶自身信号肽的pGN/th-PT2质粒转染的细胞株表达明显增加。经亚克隆后测定单细胞表达量，pGN/pc-PT2细胞株比pGN/th_PT2细胞株平均高2-3倍。其中前者表达较高的细胞株，pC-PT2 F3-C3细胞株的前凝血酶-2表达量为75 pg/c/d。这表明，利用蛋白C信号肽替代凝血酶自身信号肽可大大提高人前凝血酶-2在CHO细胞中的表达量.
实施例5 :重组人前凝血酶CHO细胞的生物反应器培养
将高表达人前凝血酶-2的细胞株(F3-C2)细胞株在250mL转瓶中培养，其工作体积为50 mL ;当细胞密度达到IXlO6以后，扩大培养到2 L转瓶，其工作体积为500mL。当细胞 密度达到I X 106/mL、细胞活度高于95%的情况下，将细胞接种入5 L WAVE袋中。WAVE系统采用GE的20/50系统，初始接种密度为4X IO5细胞/mL、初始体积I升，其温度为37度、转速为12转、角度为6度、通气量为O. 15 Lpm、溶氧设定60%、5%C02 ；按照fed-batch工艺，逐步增加培养基的量；一般情况下，每次增加上次培养基总体积的30-50%，在这个过程中调整角度、转速和通气量以维持溶氧，适当补碱以维持pH值，适当补糖以维持葡萄糖浓度。当细胞密度达到IXlO6AiL以上时开始补加补料培养基，每升培养基每天补加10 mL补料培养基。当细胞密度达到3 X IO6AiL以上开始降温。细胞活率低于85%时停止生长，收集表达上清。上清离心后采用间接ELISA方法检测表达量。结果采用此工艺下，每升培养液可含有约300毫克的人前凝血酶_2。其电泳结果见图5，间接ELISA结果见图6。实施例6 :蛇毒伊卡因(ecarin)基因的制备
以文献(S. Nishida 等，Biochemistry , 34, 1771-1778)报道的方法，以伊卡因 cDNA为模板，通过特异性引物进行PCR扩增，并在两端分别引入EcoR I和Not I，获得编码序列于报道完全相同的目的基因。其序列见SEQ ID NO: 10。实施例7 :伊卡因表达质粒的构建
将上一实施例中获得的伊卡因扩增产物和PGN载体(见中国专利200910052576. I)分别以EcoR I和Not I双酶切，纯化酶切产物后，以T4 DNA连接酶按连接扩增产物pGN载体摩尔比3 1比例连接成环。构建表达质粒pGN/ecarin,质粒图谱见图7。实施例8 :利用动物细胞表达伊卡因
使用实施例7所述的表达质粒pGN/ecarin转染CHO DG44。转染采用电转染的方法，其过程如下所述对数生长期的CHO细胞，在转染前24小时离心换液，用新鲜培养基重悬并吹打成单细胞悬液；转染时将细胞离心并按照IO7细胞每毫升的密度重悬，取O. 8 mL放入O. 4cm的电击杯中；加入200微克的表达质粒pGN/ecarin，轻轻混匀，避免气泡产生；冰浴10分钟；电转染条件为电压300伏、电容975微法拉、电阻1000欧。电击结束后室温静置10分钟，转入含新鲜培养基的培养瓶中，孵育箱培养。转染后的细胞在氨甲喋呤(MTX)的302培养基中加压筛选。逐渐提高MTX筛选浓度。使用的筛选浓度为20、40、60、90、130、200、300、450、600、900 nM MTX0筛选最终浓度所得的细胞株，用有限稀释法进行亚克隆制备，采用dot-blot方法进行表达量检测。结果获得了多株表达伊卡因的细胞株，其如图8所示。采用dot-blot检测900nM ecarin蛋白的表达,+为阳性对照品(300ng),-为阴性对照(Excell-302培养基)。每一纵列均为一个细胞株，可见第2、4、6列细胞表达量较高。
实施例9 CH0细胞产生伊卡因的绩效
表达伊卡因的CHO细胞亚克隆株(2F8-C8)，在Excel 1-302培养基条件下，以2 X 105/mL密度接种于10 cm 一次性培养皿，37度，5%C02，95%相对湿度进行培养。24小时计数细胞密度，取上清，离心用于伊卡因酶学活性检测。其酶学活性检测方法见实施例13，检测可见其表达量为4. 5yU/c/d。实施例10 :重组伊卡因在生物反应器中的生产
将高表达伊卡因的细胞株扩大培养，培养基采用EX-cell302培养基。起始在250 mL转瓶中培/养，其工作体积为50 mL ;当细胞密度达到IXlO6AiL以后，扩大培养到2 L转瓶，其工作体积为500 mL。当细胞密度达到I X 106/mL、细胞活度高于95%的情况下，将细胞接种入5升WAVE袋子中。WAVE系统采用GE的20/50系统，初始接种密度为4X 105cellS/mL、初始体积I升， 其温度为37度、转速为12转、角度为6度、通气量为O. 15升每分、溶氧设定60%、5%C02 ；按照fed-batch工艺，逐步增加培养基的量；一般情况下，每次增加上次培养基总体积的30-50%，在这个过程中调整角度、转速和通气量以维持溶氧，适当补碱以维持pH值，适当补糖以维持葡萄糖浓度。当细胞密度达到IXlO6以上时开始补加补料培养基，每升培养基每天补加10 mL补料培养基。当细胞密度达到3 X 106/mL以上开始降温。细胞活率低于85%时停止生长，收集表达上清。上清离心后检测其酶学活性，发现在此工艺下，每升含有伊卡因20U/mL。其电泳结果见图9。实施例11 :重组伊卡因的纯化 纯化方法如下
收集含有伊卡因的细胞培养上清，10000 rpm离心20min，取上清；
用10 mM Tris-HCl pH8. O缓冲液平衡DEAE-sepharose,将离心培养上清按照120 cm/h上样，当基线冲洗至平稳时；按照O至I M NaCl，10 mM Tris-HCl pH8. 0,10个柱体积条件梯度洗脱(120 cm/h)，收集含有伊卡因的样品；
用 50% 饱和度硫酸铵的 10 mM Tris-HCl ρΗ8· O 溶液平衡 phenyl-sepharose,将 DEAE收集样品加入50%饱和度硫酸铵，完后按照120 cm/h上样，用50%饱和度硫酸铵的10 mMTris-HCl pH8. O溶液冲洗至基线平稳后；按照50%至0% 10 mM Tris-HCl pH8. 0，10个柱体积条件梯度洗脱(120 cm/h)，收集含有伊卡因的样品。结果获得的高纯度的伊卡因，其电泳结果见图10。实施例12 :重组凝血酶的纯化和激活 方法如下
收集含有重组凝血酶的细胞培养上清，10000 rpm离心20min，取上清；
用10 mM Tris-HCl pH8. O缓冲液平衡DEAE-sepharose,将离心培养上清按照120 cm/h上样，当基线冲洗至平稳时；按照O至I M NaCl，10 mM Tris-HCl pH8. 0,10个柱体积条件梯度洗脱(120 cm/h)，收集含有重组人前凝血酶-2的样品；
用50%饱和度硫酸铵的10 mM Tris-HCl ρΗ8· O溶液平衡Phenyl-s印harose，将DEAE收集样品加入50%饱和度硫酸铵，完后按照120 cm/h上样，用50%饱和度硫酸铵的10 mMTris-HCl pH8. O溶液冲洗至基线平稳后；按照50%至0%10 mM Tris-HCl pH8. 0,10个柱体积条件梯度洗脱(120 cm/h)，收集含有重组人前凝血酶-2的样品；按照6. 5U/mL的比例向重组人前凝血酶-2溶液中加入伊卡因，于37°C孵育16小时；用O. 15 M NaCiaO mM PB pH 8. O溶液平衡Blue-s印harose，将孵育激活后样品按照120 cm/h上样；当基线冲洗至平稳时，按照0%至70%乙二醇，O. 5 M NaCl,10 mM PB pH 8.0，10个柱体积条件梯度洗脱(120 cm/h)，收集含有重组凝血酶的样品；
用O. 2 M NaCiaO mM PB pH 8. O溶液平衡s印hacryl S-200，将Blue洗脱样品按照24 cm/h上样后洗脱，收集含有重组凝血酶的样品。结果
Ecarin活化人前凝血酶-2的电泳结果见图11。活化后的重组人凝血酶，用实施例13的方法检测其凝血酶活性，并酶切本公司自产的含有凝血酶酶切位点的目的蛋白以验证其酶切活性(图12)。最后纯化的样品经SDS-PAGE电泳、HPLC分析可见其纯度大于95%，结果如图 13-14。纯化的重组人凝血酶经序列测定，其氨基酸序列同天然人α-凝血酶相同。其蛋白序列见SEQ ID NO: 18。实施例13 :重组α -凝血酶酶学特性
上述实施例中的凝血酶和伊卡因活性检测方法如下
①凝血酶活性检测
采用纤维蛋白原凝固法检测人重组凝血酶活性。所用标准品为凝血酶国家标准品，上海生物制品研究所制备。取不同稀释度的标准品或样品O. lmL，置测定杯中，37度孵育2分钟；加入3 mg/mL的纤维蛋白原O. 4 mL,记录凝固时间。用4，4平行线法计算效价。经测定得Ecarin完全活化后的人凝血酶比活性为3200 U/mg。②伊卡因活性检测
在纯化后的人前凝血酶-2中,加入相同体积、不同浓度的Ecarin (sigma公司)和待测样品，37度酶切4 h。加入EDTA终止反应。取终止反应后的样品，按照步骤(I)的方法进行凝血酶活性测定。用标定的标准Ecarin定量样品蛋白活性。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.ー种融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白是人蛋白C的信号肽序列与缺失Gla结构域的人凝血酶形成的融合蛋白。
2.如权利要求I所述融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID N0:6所示。
3.ー种编码权利要求I所述的融合蛋白的多核苷酸。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸的序列如SEQID NO:5所示。
5.—种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求3所述的多核苷酸。
6.ー种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞携带权利要求5中所述的表达载体，或者所述宿主细胞的基因组中整合有权利要求2所述的的多核苷酸。
7.一种制备人凝血酶的方法，其特征在于，包括步骤 培养权利要求6所述的宿主细胞，从而表达所述的融合蛋白，并分泌形成人前凝血酶-2 ； 分离或纯化出所述的分泌的人前凝血酶_2 ;和 对上一歩骤中获得的人前凝血酶_2进行激活处理，从而形成人凝血酶。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在分离或纯化步骤中包括将人前凝血酶_2经过阴离子柱和疏水柱进行纯化后，再用重组ecarin蛋白激活。
9.如权利要求I所述的融合蛋白或权利要求3所述的多核苷酸的用途，其特征在于，用于制备人凝血酶。
10.一种表达和生产重组人凝血酶的序列和方法，其特征在于，包括步骤 ①将含有人蛋白C的信号肽序列与Gla结构域缺失的人凝血酶基因融合，形成表达融合蛋白(人蛋白C-凝血酶2融合蛋白，pc-PT2)的编码基因； ②将上述编码基因插入包含有效的启动子(CMVpromotor)、牛生长因子polyA(bovine growth factor hormone polyA)、鸡 beta-肌动蛋白启动子、DHFR 基因、SV40polyA信号序列的表达载体pGN的多克隆位点,形成重组的表达载体； ③将重组表达载体转染动物细胞，并选出表达所述融合蛋白的宿主细胞； ④培养上一步骤中获得的宿主细胞，从而表达人前凝血酶_2;和 ⑤分离纯化所述的人前凝血酶_2;和 ⑥激活人前凝血酶_2，从而获得人凝血酶。
全文摘要
本发明提供了一种重组人凝血酶在动物细胞内的高效表达和生产方法。具体地，本发明提供了一种融合基因及其编码的融合蛋白。该基因含有人蛋白C的信号肽序列和Gla等结构域缺失人前凝血酶基因序列，可提高人前凝血酶-2的表达水平。本发明还公开了采用包含上述核苷酸序列的重组表达载体在动物细胞中表达和生产人前凝血酶的方法；本发明还公开了经过纯化和激活生产重组人凝血酶的方法。本发明所生产的重组人凝血酶具有可以满足治疗临床相关疾病的生物学活性。
文档编号C12N15/63GK102690803SQ20111007177
公开日2012年9月26日 申请日期2011年3月24日 优先权日2011年3月24日
发明者张滨, 徐志刚, 盛泽林 申请人:苏州泽璟生物制药有限公司