专利名称：一种猪血浆抗氧化肽的制作方法
技术领域：
本发明属于食品加工领域，涉及一种猪血浆抗氧化肽。
背景技术：
现代肉类工业屠宰过程中产生的动物血液是一种珍贵的蛋白质资源。它可以广泛的用在食品、饲料、实验室、制药、工业以及肥料等领域(Ockerman & Hanson，2000)。但是，只有一小部血液用于这些方面，大量的废弃血液被排放到环境中，引起严重的环境污染 (Park & Hyrm，2002)。在中国，每年产生约有150万吨猪血，其蛋白质含量相当于250万吨全蛋，但是真正利用起来的部分却很少(余奕珂等，2004)。因此，为了减少环境的污染和阻止宝贵蛋白质资源的流失，发展新的蛋白质资源利用的方法是非常有必要的。近年来，自由基是现代食品工业以及加工食品的消费者很关心的一个问题。自由基调节脂肪的氧化。已经有研究证实，循环过程中膜蛋白和脂蛋白的氧化与关节炎、糖尿病和高血压、高血脂等疾病有很密切的关系(Halliwell，1994 ；Keaney，2000)。在过去的几年中，大量的研究开始集中于没有危害作用的、天然的抗氧化剂的开发和结构鉴定方面。这些抗氧化剂在对调节氧化反应的自由基清除的机理各不相同。他们可以作为脂质氧化的抑制剂，自由基清除剂以及催化自由基产生的金属离子的螯合剂(Vaya & Aviram，2001)。这些天然的抗氧化剂很多来源于植物。也有几个肽段序列来自于分离的动物蛋白中，如胶原蛋白、鸡蛋黄、乳清蛋白、酪蛋白、阿拉斯加鱼骨蛋白等中，研究也已经证明他们具有抗氧化作用(Je et al,2005 ；Pena-Ramos et al,2004 ；Rajapakse et al,2005 ；Wu et al,2003)o研究认为，血浆白蛋白是血液循环中主要的抗氧化剂(HalliWell，1988 ;Peter， 1996)。Bishop (1985)报道说血清白蛋白可以保护培养的细胞使其免受氧自由基的伤害。 Bourdon, Loreau和Blache (1999)的体外研究则表明，白蛋白具有保护人的低密度脂蛋白 (LDL)使其免受氧化和防止红细胞的溶血作用。另有研究利用动物血液蛋白生产功能性肽，包括TCA沉淀法得到的ACE抑制肽(Park et al, 1996)，胃蛋白酶水解的ACE活性肽 (Suetsuna, 1995 ；Hynn & Shin2000)，牛血菜蛋白中的免疫活性肽(Park & Hyun，2002)，牛血清白蛋白中分离的血管舒缓肽以及牛血红素分离得到的opioid肽(Chiba & ^shikawa， 1991 ；Zhao et al，1994)。Faraii和Decker (1991)的研究表明猪血浆能抑制铁离子催化的脂质氧化。但是迄今为止，尚没有报道对猪血浆分离白蛋白和球蛋白进行酶解生产肽及其抗氧化作用的研究。本身具有很好抗氧化作用的血浆蛋白酶解后到底发生了怎样的变化？本发明对这一问题进行了研究，期望为抗氧化肽的生产找到新的原料和方法。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种猪血浆抗氧化肽。本发明的目的通过如下方案实现一种猪血浆抗氧化肽，它是通过如下方法制得的
(1)猪血浆白蛋白水解物的制备用碱性蛋白酶酶解浓度为40mg/mL的猪血浆白蛋白溶液，反应条件为pH 8. 0 9. 0，温度55 60°C，酶的添加量为0. 8 1. Omg/mL蛋白溶液，取水解8 12小时的样品，90°C加热IOmin使酶灭活后，离心，取上清液；(2)猪血浆蛋白抗氧化肽段的膜分离将步骤(1)所得上清液通过分子量为3kDa 的平板膜，过滤过程中用高纯氮加压，压力为0. 03-0. 04MPa，并用磁力搅拌器连续低速搅拌，分离得到分子量小于3kDa的肽段即为所述的猪血浆抗氧化肽A5。其中，步骤(1)所述的反应条件优选PH 8.0，温度55°C ；所述的酶的添加量优选 0. 8mg/mL蛋白溶液；水解时间优选12h。所述的猪血菜白蛋白优选利用Heide K，Haupt H, Schwick HG. 1984. Plasma proteinfractionation. In Putnam Fff, editors. The Plasma Proteins.New York Academic Press. p545-597.中记载的冷乙醇沉淀法分离，具体工艺路线见图1。一种猪血浆抗氧化肽的制备方法，包括如下步骤(1)猪血浆白蛋白水解物的制备用碱性蛋白酶酶解浓度为40mg/mL的猪血浆白蛋白溶液，反应条件为pH 8. 0 9. 0，温度55 60°C，酶的添加量为0. 8 1. 0mg/mL蛋白溶液，取水解8 12小时的样品，90°C加热IOmin使酶灭活后，离心，取上清液；(2)猪血浆蛋白抗氧化肽的膜分离将步骤(1)所得上清液通过分子量为3kDa的平板膜，过滤过程中用高纯氮加压，压力为0. 03-0. 04MPa，并用磁力搅拌器连续低速搅拌， 分离得到分子量小于3kDa的肽段即为所述的猪血浆抗氧化肽A5。其中，步骤(1)所述的反应条件优选pH 8.0，温度55°C ；所述的酶的添加量优选 0. 8mg/mL蛋白溶液；水解时间优选12h。有益效果本发明通过研究了血浆蛋白水解过程中水解度(DH)和还原能力(RP)的变化关系，筛选出最具活性的水解物。按照分子量不同对肽段进行膜分离，研究了不同分子量白蛋白和球蛋白肽段还原能力(RP)、抗脂质氧化能力以及清除DPPH自由基、超氧自由基和羟基自由基的能力，从而筛选出最具有抗氧化潜能的肽A5。本发明猪血浆抗氧化肽段A5较之其他分子量段的水解产物具有最强的还原能力，以及更加优异的抑制脂质过氧化的能力、 清除自由基、超氧自由基和羟基自由基的能力。体内实验证明猪血浆白蛋白多肽A5在体内有较好的抗氧化作用，可能有效改善机体自由基代谢紊乱，能明显对抗免疫器官的退化、萎缩，提高免疫功能，从而达到延缓衰老的作用。本发明猪血浆抗氧化肽段A5还能够提高细胞中的S0D，CAT和GSH-Px三种酶活力，且对MDA均有明显的清除作用。
图1冷乙醇沉淀法工艺路线图。图2五种蛋白酶水解猪血浆白蛋白的水解产物的还原能力。图3五种蛋白酶水解猪血浆球蛋白的水解产物的还原能力。图4四种条件下碱性蛋白酶水解猪血浆白蛋白的水解产物的还原能力。图5四种条件下碱性蛋白酶水解猪血浆球蛋白的水解产物的还原能力。图eAlcalase水解猪血浆白蛋白和球蛋白过程中RP的变化。图7猪血浆白蛋白和球蛋白不同分子量肽段的RP值。
图8猪血浆白蛋白不同分子量肽段的抗脂质氧化能力。图9猪血浆球蛋白不同分子量肽段的抗脂质氧化能力。图10猪血浆白蛋白和球蛋白不同分子量肽段清除DPPH自由基的能力。图IlESR技术测定的猪血浆白蛋白和球蛋白小分子量肽段清除羟基和超氧自由基的能力。图12饲喂不同剂量A5大鼠肝脏的CAT酶活力。
具体实施例方式以下实施例中还原能力的测定参考0yaiZU(1986)的方法，该方法的原理是被测物质还原三价铁离子为二价铁离子的能力。在700nm处测定二价铁离子的含量来判断还原能力。取待测液lmL，加入2. 5mL 0. 2mol/L磷酸缓冲液(pH = 6. 6)和2. 5mL 的铁氰化钾溶液，混勻，50°C水浴20min，然后加入2. 5mL 10 %三氯乙酸，充分混合后，3000 X g离心 IOmin0取上清液2. 5mL和0. 5mL的三氯化铁混合，室温反应lOmin，于700nm波长处测定吸光度值。吸光度越大，表明被测物质的还原能力越强。实施例11. 1分离猪血浆白蛋白和球蛋白当天取自北京资源肉类集团的新鲜猪血，加入浓度1. Omg/mL的草酸钾抗凝，冷藏条件下运送到实验室，途中避免剧烈振荡以免溶血。3000Xg离心15min，上清即为血浆。利用 Heide K, Haupt H, Schwick HG. 1984. Plasma protein fractionation. In PutnamFff, editors. The Plasma Proteins. New York :Academic Press. p545_597.中记载的冷乙醇沉淀法分离血浆中的白蛋白和球蛋白，具体工艺路线见图1。1. 2水解猪血浆制备抗氧化肽蛋白酶的确定分别用木瓜蛋白酶(papain)，风味蛋白酶(flavorzyme)，胰蛋白酶(trypsin)，碱性蛋白酶(Alcalase)和中性蛋白酶(neutrase)水解猪血浆白蛋白和球蛋白，测定的1 内两种蛋白水解物的还原能力。结果如图2和图3所示。由图2和图3可见，碱性蛋白酶水解白蛋白和球蛋白的水解产物的还原能力均最强，因此选择碱性蛋白酶作为水解猪血浆制备抗氧化肽的蛋白酶。1. 3水解条件的确定依据碱性蛋白酶水解的最优条件作为参考，血浆白蛋白和球蛋白的底物浓度均为 40mg/mL，将温度，pH和酶添加量做为三个因素，组合为A，B，C，D四组不同的实验，各组反应条件如表1。分别于水解0、l、2、4、6、8、10、12、14、16h取样，90°C水浴IOmin灭活酶，迅速冷却后，15000 Xg离心15min，取上清测定水解物的还原能力。表1碱性蛋白酶水解猪血浆蛋白的条件
权利要求
1.一种猪血浆抗氧化肽，其特征在于通过如下方法制备(1)猪血浆白蛋白水解物的制备用碱性蛋白酶酶解浓度为40mg/mL的猪血浆白蛋白溶液，反应条件为pH 8. 0 9. 0，温度55 60°C，酶的添加量为0. 8 1. Omg/mL蛋白溶液， 取水解8 12小时的样品，90°C加热10 15min使酶灭活后，离心，取上清液；(2)猪血浆蛋白抗氧化肽段的膜分离将步骤(1)所得上清液通过分子量为3kDa的平板膜，过滤过程中用高纯氮加压，压力为0. 03-0. 04MPa，并用磁力搅拌器连续低速搅拌，分离得到分子量小于3kDa的肽段即为所述的猪血浆抗氧化肽A5。
2.根据权利要求1所述的猪血浆抗氧化肽，其特征在于步骤(1)所述的反应条件为PH 8.0，温度 55 0C ο
3.根据权利要求1所述的猪血浆抗氧化肽，其特征在于步骤(1)所述的酶的添加量为 0. 8mg/mL蛋白溶液。
4.根据权利要求1所述的猪血浆抗氧化肽，其特征在于取水解12小时的样品，90°C加热IOmin使酶灭活后，15000Xg离心15min，取上清液。
5.一种猪血浆抗氧化肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)猪血浆白蛋白水解物的制备用碱性蛋白酶酶解浓度为40mg/mL的猪血浆白蛋白溶液，反应条件为pH 8. 0 9. 0，温度55 60°C，酶的添加量为0. 8 1. Omg/mL蛋白溶液， 取水解8 12小时的样品，90°C加热IOmin使酶灭活后，离心，取上清液；(2)猪血浆蛋白抗氧化肽段的膜分离将步骤(1)所得上清液通过分子量为3kDa的平板膜，过滤过程中用高纯氮加压，压力为0. 03-0. 04MPa，并用磁力搅拌器连续低速搅拌，分离得到分子量小于3kDa的肽段即为所述的猪血浆抗氧化肽A5。
6.根据权利要求5所述的猪血浆抗氧化肽的制备方法，其特征在于步骤(1)所述的反应条件为PH 8.0，温度55°〇。
7.根据权利要求5所述的猪血浆抗氧化肽的制备方法，其特征在于步骤(1)所述的酶的添加量为0. 8mg/mL蛋白溶液。
8.根据权利要求5所述的猪血浆抗氧化肽的制备方法，其特征在于取水解12小时的样品，90°C加热IOmin使酶灭活后，15000Xg离心15min，取上清液。
全文摘要
本发明属于食品加工领域，公开了一种猪血浆抗氧化肽。它是通过如下方法制得的(1)猪血浆白蛋白水解物的制备；(2)猪血浆蛋白抗氧化肽段的膜分离将步骤(1)所得上清液通过分子量为3kDa的平板膜，过滤过程中用高纯氮加压，压力为0.03-0.04MPa，并用磁力搅拌器连续低速搅拌，分离得到分子量小于3kDa的肽段即为所述的猪血浆抗氧化肽A5。本发明猪血浆抗氧化肽A5较之其他分子量段的水解产物具有最强的还原能力，以及更加优异的抑制脂质过氧化的能力、清除自由基、超氧自由基和羟基自由基的能力。
文档编号C12P21/06GK102191304SQ20111007161
公开日2011年9月21日 申请日期2011年3月23日 优先权日2011年3月23日
发明者任发政, 俞明, 孙友珍, 李景军, 王金枝, 胡向丽, 闫文杰 申请人:连云港福润食品有限公司