专利名称：一种真菌表达载体及其构建和筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种真菌表达载体及其构建方法和筛选方法，具体涉及一种以酸性海藻糖酶基因(Acid trehalase gene)为筛选标记的真菌表达载体及其构建和筛选方法，属于生物技术领域。
背景技术：
害虫防治是农业生产的重要组成部分，化学农药在防治有害生物和保障农业增产方面起了积极作用，但化学农药大量长期使用引起了一系列的环境和食品安全问题。由于微生物生物防治具有安全和可持续控制的优点，一直受到人们的广泛关注。杀虫微生物农药是利用昆虫病原微生物研制的一大类生物农药，真菌是昆虫病原微生物中最大的一个类群，在自然条件下由真菌致病死亡的昆虫约占全部病原微生物致病死亡的60%，是自然界控制昆虫种群数量的重要因素之一。与病毒、细菌的胃毒杀虫途径不同，真菌主要通过昆虫体壁侵染昆虫，真菌可侵染刺吸式口器的昆虫和非取食期的昆虫卵、蛹等；害虫难以对真菌制剂产生抗性；可离体进行大规模生产。与大多数化学农药相比，昆虫病原真菌对哺乳动物毒性低，对环境的影响可以忽略。真菌是最先被研制成杀虫剂的微生物，绿僵菌和白僵菌等杀虫真菌农药已用于松毛虫、玉米螟和蝗虫等害虫的防治，其中杀蝗绿僵菌制剂被联合国粮农组织推荐为环保型产品，国内外已登记60多种杀虫真菌农药，目前真菌杀虫剂已作为化学农药的替代产品或补充制剂防治多种有害昆虫。因此，昆虫病原真菌在害虫防治中具有十分重要的地位。然而，目前的杀虫真菌农药都是用野生菌株研制的，致病过程较长、杀虫较慢。因此，杀虫真菌农药的田间使用剂量大、成本高。杀虫慢、成本高的缺点限制了杀虫真菌的广泛应用，急需提高菌株毒力。为克服野生菌株杀虫慢的缺点，人们开展杀虫真菌工程菌株的构建技术研究，并已取得有良好的进展。目前主要采用基因工程技术超量表达昆虫病原真菌的毒力基因显著提高杀虫活性，或者通过转杀虫毒素基因提高杀虫活性。组成性表达绿僵菌类枯草杆菌蛋白酶基因(作7)的工程菌株毒力明显提高，致死时间缩短25%，取食量下降40% ；组成性表达白僵菌几丁质酶基因的工程菌株对蚜虫的毒力明显增强，对蚜虫的致死剂量比野生菌株降低50% ；由于该基因没有几丁质连接域，将家蚕的几丁质连接域与其融合后，组成性表达的工程菌株杀虫活性进一步提高。将昆虫特异性神经毒素基因置于昆虫血腔特异启动子的控制下转入绿僵菌，工程菌株对烟草天蛾和埃及伊蚊的杀虫速度分别提高28%和38%， 致死中浓度(LC5tl)分别下降约22倍和9倍，感染昆虫取食量下降50% ；神经毒素只有在真菌穿透昆虫表皮后才能表达，进一步提高了工程菌株的安全性。然而，目前国内外构建杀虫真菌工程菌株的筛选标记采用杀真菌剂抗性标记包括 Benomyl抗性标记(β -tubulin基因)，除草剂抗性标记(fer基因)，潮霉素抗性标记(Mph基因)，含有这些抗性筛选标记的基因工程菌(如含有除草剂抗性标记ifer基因的工程菌)作为生物农药进入自然环境中，一旦出现基因漂移如被自然界的杂草、植物病原真菌等微生物等吸收，则杂草会对除草剂出现抗性、病原微生物将会产生抗药性，将对环境和生态系统造
3成很大的影响，因此目前筛选标记的选择是制约杀虫真菌工程菌株广泛应用的重要影响因素。目前，国内外成功用于真菌转化的安全筛选标记尚未见报道。因此，迫切需要开展以安全筛选标记为核心的杀虫真菌工程菌设计与构建的新技术研究，为选育具有实用价值的安全、高毒力的杀虫真菌工程菌株提供良好的技术平台。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以酸性海藻糖酶基因作为筛选标记的安全、高效的真菌表达载体。许多真菌不能够直接利用海藻糖，因此它们在海藻糖为唯一碳源的培养基上生长缓慢，本发明的原理是将降解海藻糖的酸性海藻糖酶基因作为筛选标记构建在载体上，转入真菌后进行组成性表达；在海藻糖为唯一碳源的培养基上，转化子通过酸性海藻糖酶将海藻糖分解为葡萄糖，因而能够利用海藻糖并快速生长，得以筛选出来。本发明的另一目的在于提供上述真菌表达载体的构建方法。本发明的又一目的在于提供以上述真菌表达载体构建的转化子的筛选方法。本发明的目的是通过如下技术方案实现的
一种真菌表达载体，其特征在于所述表达载体为由PEX质粒表达载体和作为筛选标记的酸性海藻糖酶基因构成的组成性表达载体。所述的酸性海藻糖酶基因为绿僵菌酸性海藻糖酶基因(ATM)、黑曲霉酸性海藻糖酶基因(ATA)(两者在Genbank中的登录号分别为EF190950和XM1388557)等，但不局限于这两个酸性海藻糖酶基因；其中质粒表达载体 PEX是将表达载体pBarEx中的Bar基因去掉，表达载体pBarEx的构建是根据pAN52_l (购自拓飞生物科技有限公司)构建丝状真菌表达载体PBarEx:设计引物1为SEQ ID NO=I (5，-attagacgtcgcaggtcgac agaagaatgac-3，，下划线为 Aat II 酶切位点)与引物 2 为 SEQ ID NO 2 (5' -gtcggccgggcgtcgttctgggctcatggtagatcca ctagagcggccgc-3' )^1^^( 基因组DNA中扩增色氨酸合成酶启动子(pTrpC)序列；设计引物3为SEQ ID NO 3 (5'-g cggccgctctagtggatctaccatgagcccagaa cgacgcccggccgac_3'，与弓I物 2 反向互补系列；其中 @ 为 Bar 基因起始密码子)与引物 4 为 SEQ ID NO 4 C5' -cgcggatccagcttttattag atctcggtgac-3，，下划线为BamHI酶切位点)从pCAMBIA 3300 (购自CAMBIA公司)中扩增Bar基因序列；以引物1和引物4，采用融合PCR扩增pTrpC控制下的Bar Cassette ；将 PAN52-1与Bar Cassette分别采用AatII与BamHI双酶切后，用T4连接酶连接构建成丝状真菌表达载体pBarEx ο本发明pEX的构建过程中将上述pBarEx的Bar基因去除是酶切pBarEx，回收 51Λ的片段，补平酶切末端并进行自身环化连接，得到只含有启动子和终止子的真菌表达载体 pEX。为了进一步提高本发明真菌表达载体的筛选、表达效率，上述酶切PBarEx所用酶为 Aatll/Spel。为了更进一步提高本发明真菌表达载体的筛选、表达效率，具体地说本发明pEX 的构建过程中将上述PBarEx的Bar基因去除是利用Aatll/Spel (TaKaRa, China)酶切上述真菌超表达载体pBarEx，37°C水浴2小时，将酶切产物进行琼脂糖电泳(胶浓度为1%)， 出现51Λ左右和11Λ左右两个片段，回收51Λ左右的片段；80°C水浴15min回收产物，利用 T4 DNA Polymerase 及 IOmM dNTP 补平，再回收补平产物；T4 DNA Ligase (TaKaRa，China)16°C连接回收产物6小时左右，转化大肠杆菌感受态，涂布于LB (含100μ g/mL氨苄)平板上，37°C恒温培养12-16小时，挑取单菌落于液体LB (含100 μ g/mL氨苄)中，37°C 250rpm 培养12小时，提取质粒DNA，利用Clal/BamHI酶切提取质粒DNA，切下2. 2kb左右的片段， 得到PEX质粒表达载体。本发明真菌表达载体的构建方法，其特征在于首先将上述PBarEx的Bar基因去除得到真菌表达载体PEX，再将ρΕΧ分别与酸性海藻糖酶基因连接构建成真菌组成性表达载体。上述真菌表达载体的构建方法中酸性海藻糖酶基因优选采用ATM，其与真菌表达载体PEX连接构建真菌表达载体ρΕΧ-ΑΤΜ ；所述将ρΕΧ与酸性海藻糖酶基因ATM连接过程中采用的模板为ATM基因cDNA克隆载体pUC19-ATM (Zhao et al. 2006)；其中采用ATM-R 为引物，所述 ATM-R 引物为 SEQ ID NO 5 (5、tccccccgggctaaaa cgctctaccctt_3'，并以 XmaI为酶切位点)。具体地说，上述真菌表达载体的构建方法中将ρΕΧ与酸性海藻糖酶基因ATM连接，具体是以ATM基因cDNA克隆载体pUC19- ATM (Zhao et al. 2006)为模板，用根据金龟子绿僵菌菌体CQMal02酸性海藻糖酶基因反转录DNA(cDNA)序列(GenBank登录号EF190950)设计的引物酸性海藻糖酶基因ATM-F为SEQ ID NO 6 (5'-ccatcgata tgcgcgcgactcccatg-3'，下划线为ClaI酶切位点)和酸性海藻糖酶基因ATM-R为SEQ ID NO 5 (5' -tccccccgggctaaaacgctctaccctt-3，，下划线为XmaI酶切位点)通过聚合酶链式反应(PCR)扩增出两端分别带有ClaI与XmaI酶切位点的3303bp的ATM基因全长cDNA序列，并将其克隆到无其它筛选标记的真菌超表达载体PEx的ClaI和XmaI位点之间，使ATM 基因处于来自构巢曲霉3—磷酸甘油醛脱氢酶(gpdA)基因的启动子与的色氨酸(trpC)基因的终止子控制之下，得到ρΕχ-ΑΤΜ表达载体。本发明真菌表达载体构建的转化子的筛选方法，是以海藻糖为唯一碳源的培养基进行筛选。与传统的真菌遗传转化选择方法相比，本发明的原理独特许多真菌不能够直接利用海藻糖，因此它们在海藻糖为唯一碳源的培养基上生长缓慢。因此，将降解海藻糖的酸性海藻糖酶基因(如ATM)作为筛选标记构建在载体上，转入真菌后进行组成性表达；在海藻糖为唯一碳源的培养基上，转化子通过酸性海藻糖酶将海藻糖分解为葡萄糖，因而能够利用海藻糖并快速生长，得以筛选出来。筛选用的标记基因“酸性海藻糖酶基因”来源广泛，许多生物都有，因此除ATM外还可以选用其它来源的“酸性海藻糖酶基因”作为筛选标记基因；采用的海藻糖选择标记系统具有产物安全(编码的酶在真菌中广泛存在)、对环境友好的特点，采用本发明真菌表达载体构建的昆虫病原工程真菌释放到环境中不会因筛选标记的原因而对环境造成不利影响；研究发现野生昆虫病原真菌在海藻糖的培养基中生长困难，而在昆虫病原真菌中采用了本发明组成性表达载体后则在海藻糖的培养基中生长迅速，同时其筛选、表达效率高，而且安全。本发明真菌表达载体的构建方法巧妙、选择剂价格低廉、程序简单，同时对利用本发明真菌表达载体的昆虫病原真菌转基因菌株的筛选程序简单、筛选效率高，而且不影响真菌的代谢平衡，在转基因真菌研究及市场化过程中具有潜在的、广泛的应用前景。此外，本发明将为安全高效的基因工程真菌农药等提供了良好的技术平台。
图1为含有超表达酸性海藻糖酶基因ATM元件的示意图； 图2为转化后的绿僵菌菌落图3为绿僵菌菌落分子验证图，M为Marker III (北京鼎国)；WT为野生型菌株；1_8 为筛选得到的部分绿僵菌转化子；
图4为划线培养野生型菌株与绿僵菌转化子在海藻糖为唯一碳源培养基平板上的菌落图5为含有超表达酸性海藻糖酶基因ATA元件的示意图； 图6为转化后的球孢白僵菌菌落图7为球孢白僵菌菌落分子验证图。M为Marker III (北京鼎国);WT为野生型菌株； 1-6为筛选得到的部分球孢白僵菌转化子；
图8为划线培养野生型菌株与白僵菌转化子在海藻糖为唯一碳源培养基平板上的菌落图。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。实施例1利用绿僵菌酸性海藻糖酶作为筛选标记转化绿僵菌 1.菌株
绿僵菌蝗虫专一化菌株CQMal02 (.Metarhizium acridum),已经在申请号为 200310110901.8的授权文本中公开，该菌株现可在重庆大学基因工程中心购买。大肠杆菌 JM109购自博大派克公司。2.以绿僵菌酸性海藻糖酶基因(ATM)为筛选标记的真菌表达载体ρΕΧ-ΑΤΜ的构
建
首先，根据ρΑΝ52-1(购自拓飞生物科技有限公司)构建丝状真菌表达载体pBarEx 设计弓丨物 1 为 SEQ ID NO 1(5' -attaEacgtcgcaggtcgacagaagaatgac-3',下划线为 Aat II 酶切位点)与弓I物 2 为 SEQ ID NO 2 (5' -gtcggccgggcgt cgttctgggctcatggtagatccactagagcg gccgc-3')从构巢曲霉基因组DNA中扩增色氨酸合成酶启动子(pTrpC)序列；设计引物3为 SEQ ID NO 3(5'-gcggccgctctagtggatctaccatgagcccagaacgacg cccggccgac_3',与弓|物2 反向互补系列；其中为Bar基因起始密码子)与引物4为SEQ ID NO 4 (5' -cgcggatcc agcttttattagatctcggtgac-3’，下划线为 BamHI 酶切位点)从 pCAMBIA 3300 (购自 CAMBIA 公司)中扩增Bar基因序列；以引物1和引物4，采用融合PCR扩增pTrpC控制下的Bar Cassette ；将pAN52_l与Bar Cassette分别采用AatII与BamHI双酶切后，用！"4连接酶连接构建成丝状真菌表达载体pBarEx。利用Aatll/Spel (TaKaRa, China)酶切上述真菌超表达载体pBarEx，37°C水浴2 小时，将酶切产物进行琼脂糖电泳(胶浓度为1%)，出现51Λ左右和11Λ左右的两个片段，回收 5kb 左右的片段；80°C水浴 15min 回收产物，利用 T4 DNA Polymerase (Fermentas，USA)
6及IOmM dNTP (北京鼎国)补平，再回收补平产物；T4 DNA Ligase (TaKaRa，China) 16°C连接回收产物6小时左右，转化大肠杆菌感受态，涂布于LB (含100 μ g/mL氨苄)平板上，37°C 恒温培养12-16小时，挑取单菌落于液体LB (含100 μ g/mL氨苄)中，37°C 250rpm培养12 小时，提取质粒DNA，利用Clal/BamHI (TaKaRa, China)酶切提取质粒DNA，切下2. 2kb左右片段，得到表达载体ρΕχ。再以ATM基因cDNA克隆载体pMD18- ATM (该克隆载体是通过 PMD18-T，与ATM连接构建的，其中pMD18_T载体可以购买到，ATM在Genbank中的登录号为 EF190950)为模板，用根据金龟子绿僵菌菌体CQMal02酸性海藻糖酶基因反转录DNA(cDNA) 序列(GenBank 登录号EF190950)设计的引物 ATM-F 为 SEQ ID NO 6(5' -ccatcgatatgcgcg cgactcccatg-3，，下划线为 ClaI 酶切位点)和 ATM-R 为 SEQ ID NO 5(5' -tccccccgggctaaa acgctctaccctt-3'，下划线为XmaI酶切位点)通过聚合酶链式反应(PCR)扩增出两端分别带有ClaI与XmaI酶切位点的3303bp的ATM基因全长cDNA序列，并将其克隆到无其它筛选标记的真菌超表达载体PEx的ClaI和XmaI位点之间，使ATM基因处于来自构巢曲霉 3—磷酸甘油醛脱氢酶(gpdA)基因的启动子与的色氨酸(trpC)基因的终止子控制之下，得到ρΕχ-ΑΤΜ表达载体(图1)。经测序证明，得到的基因序列一致。ρΕχ-ΑΤΜ载体用CaC12法转入大肠杆菌中并进行扩增，载体大量提取的产物经Spe I线性化后去磷酸，再经酚-氯仿抽提得到浓度为500-1000 μ g/ml的线性化载体，0D260/280在1. 80-1. 85之间。3.绿僵菌的遗传转化
绿僵菌液生分生孢子准备将Iml的绿僵菌CQMal02成熟分生孢子无菌水悬浮(浓度为 IO7 个/ml)接种于装有 IOOml 1/4 trength Sabourauds dextross agar(l/4SDA)液体培养基的250ml三角瓶中，250rpm振荡培养2. 5天，四层灭菌纱布过滤后4000g 离心5min沉淀液生分生孢子，无菌水重悬再洗2次，最后20%无菌甘油重悬使孢子浓度达 IO8个/ml，分装后-80°C保存。转化时取50μ 1分生孢子悬液于灭菌60mm平皿中央，使其直径达1cm，然后放于70%乙醇灭菌基因枪室内。按照Biolistic PDS-1000/he Particle Delvery System(Bio-Rad)系统提供的方法进行金粉的处理和线性载体ρΕχ-ΑΤΜ的包埋，并利用该系统，以1350psi气压，27. 5英寸汞(Hg)真空度进行微粒子轰击。轰击后取出样品，在超净台上取出孢子液，用5ml灭菌水稀释，取100 μ 1涂布于海藻糖为唯一碳源的筛选培养基平板上^TC 培养2-3天。挑取生长旺盛的真菌菌落，在1/4SDA培养基上扩大培养，用于进一步分析验证。其中，携带有酸性海藻糖酶基因的真菌表达载体可使用根癌农杆菌介导法、电转化法、基因枪法、原生质体法或REMI转化法等将其转入真菌中。4.绿僵菌转化子的分子验证及阳性率测定
接种筛选得到的85个绿僵菌菌落的分生孢子于液体1/4SDA培养基中扩大培养后，分别提取各菌落的基因组DNA，利用引物PgpdA-VF为 SEQ ID NO 7 (5'-ttcctgctctccccaccag-3')禾口 ATM_n2 为 SEQ ID NO 8 (5' -gtgaacatcaggtaccggatatc-3')经PCR验证转化子，图2为转化后的绿僵菌菌落图，箭头所示即为可能的转化子菌落，图3为筛选得到的部分转化子的PCR电泳照片，结果表明利用酸性海藻糖酶作为筛选标记基因筛选绿僵菌的转基因菌株是可行的，并且在所有供试菌落中有73个菌落为阳性转化子，阳性率为86%，说明利用ATM作为筛选标记基因筛选绿僵菌转化菌株的效果较好。5.绿僵菌ATM转化子与野生型菌株的生长特性比较
将绿僵菌ATM转化子与野生型菌株孢子用灭菌水配成浓度为IXlO5个孢子/ml的孢子悬浮液，均勻涂布在直径为9cm的1/4SDAY平板上(100 μ 1/皿培养15d，完全产孢。再分别刮取以上培养得到的不同菌株孢子，灭菌水配制浓度为IX IO6个孢子/ml的孢子悬浮液，用接种环划线培养各菌株于海藻糖作为唯一碳源的培养基平板上，26°C培养3d， 观察各菌株生长状态并照相，结果如图4所示，绿僵菌ATM转化子在海藻糖作为唯一碳源的培养基平板上生长速率明显高于CQMal02野生型菌株。实施例2 利用黑曲霉酸性海藻糖酶基因(ATA)作为筛选标记转化球孢白僵菌 1.菌株与载体
球孢白僵菌(^^w/^ria如^iaz7a)菌株，菌株编号为3. 2055，该菌株购于中国科学院微生物研究所。大肠杆菌JM109购自博大派克公司。2.以黑曲霉Us/^r识7ΛΛ5酸性海藻糖酶基因为筛选标记的真菌表达载体ρΕΧ-ΑΤΑ的构建
真菌表达载体PEX由实施例1中制得。再以ATA基因cDNA克隆载体pMD18- ATA (该克隆载体是通过PMD18-T，与ATA连接构建的，其中pMD18_T载体可以购买到，ATA在Genbank 中的登录号为XM1388557)为模板，根据黑曲霉酸性海藻糖酶基因反转录DNA(cDNA)序列(GenBank 登录号XM1388557)设计的引物 ATA-F 为 SEQ ID NO 9 (5’ -ccaagctt atgcaagtcaagttcctg-3，，下划线为 HindIII 酶切位点)和 ATA-R 为 SEQ ID NO :10(5，-tccc CCCRRRttatRtaRCattaattRatt a_3'，下划线为XmaI酶切位点)通过聚合酶链式反应(PCR) 扩增出两端分别带有HindIII与XmaI酶切位点的3318bp的ATA基因全长cDNA序列，并将其克隆到无其它筛选标记的真菌超表达载体PEx的HindIII和XmaI位点之间，使ATA基因处于来自构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶(gpdA)基因的启动子与的色氨酸(trpC)基因的终止子控制之下，得到PEx- ATA表达载体(图5)。经测序证明，得到的基因序列一致。ρΕχ-ΑΤΑ 载体用CaC12法转入大肠杆菌中并进行扩增，载体大量提取的产物经Spe I线性化后去磷酸，再经酚-氯仿抽提得到浓度为500-1000 μ g/ml的线性化载体，0拟60Λ80在1. 80-1. 85 之间。3.球孢白僵菌的遗传转化
球孢白僵菌分生孢子悬液的制备刮取1/4SDA平板培养的球孢白僵菌的分生孢子，四层灭菌纱布过滤后，无菌水重悬再洗2次，最后20%无菌甘油重悬使孢子浓度达IO8个/ml， 分装后-80°C保存。基因枪转化步骤同绿僵菌。轰击后取出样品，在超净台上取出孢子液，用5ml灭菌水稀释，取100 μ 1涂布于海藻糖为唯一碳源的筛选培养基平板上培养9-15天。 挑取生长旺盛的真菌菌落扩大培养，用于进一步分析验证。 4.球孢白僵菌转化子的分子验证及阳性率测定
接种筛选得到的55个白僵菌菌落的分生孢子于液体1/4SDA培养基中扩大培养后，分别提取各菌落的基因组DNA，利用引物PgpdA-VF为 SEQ ID NO 11 (5'-ttcctgctctccccaccag-3')禾口 ATA_n2 为 SEQ ID NO 12 (5' -cttgtgcgcgaagagtcggta-3')经PCR验证转化子，图6为转化后的球孢白僵菌菌落，箭头所示即为可能的转化子菌落，图7为筛选得到的部分转化子的PCR电泳照片，结果表明利用酸性海藻糖酶作为筛选标记基因筛选球孢白僵菌的转基因菌株是可行的，并且在所有供试菌落中有42个菌落为阳性转化子，阳性率为76%，说明利用ATA作为筛选标记基因筛选白僵菌转化菌株的效果较好。5.白僵菌ATA转化子与野生型菌株的生长特性比较
将白僵菌ATA转化子与野生型菌株孢子用灭菌水配成浓度为IXlO5个孢子/ml的孢子悬浮液，均勻涂布在直径为9cm的1/4SDAY平板上(100 μ 1/皿培养10d，完全产孢。再分别刮取以上培养得到的不同菌株孢子，灭菌水配制浓度为IX IO6个孢子/ml的孢子悬浮液，用接种环划线培养各菌株于海藻糖作为唯一碳源的培养基平板上，26°C培养3d， 观察各菌株生长状态并照相，结果如附图8所示，白僵菌ATA转化子在海藻糖作为唯一碳源的培养基平板上生长速率明显高于野生型菌株。另外，本发明表达载体还可用于曲霉(Aspergillus)、青霉QPeniicillium)、稻瘟菌(Magnaporthe )、黑粉菌(fetilago )等真菌中，其安全性、筛选效果显著。
权利要求
1.一种真菌表达载体，其特征在于所述表达载体为由PEX质粒表达载体和作为筛选标记的酸性海藻糖酶基因构成的组成性表达载体；其中质粒表达载体PEX是将表达载体 PBarEx中的Bar基因去掉而成的。
2.如权利要求1所述的真菌表达载体，其特征在于所述PEX质粒表达载体是通过酶切pBarEx，回收51Λ的片段，补平酶切末端并进行自身环化连接，得到只含有启动子和终止子的真菌表达载体PEX。
3.如权利要求1或2所述的真菌表达载体，其特征在于所述酶切PBarEx所用酶为 Aatll/SpeL·
4.如权利要求1所述的真菌表达载体，其特征在于所述pBarEx的Bar基因去除是利用Aatll/Spel酶切所述真菌超表达载体pBarEx，37°C水浴2小时，将酶切产物进行琼脂糖电泳，其胶浓度为1%，回收51Λ的片段；80°C水浴15min回收产物，利用T4 DNA Polymerase 及IOmM dNTP补平，再回收补平产物；T4 DNA Ligase 16°C连接回收产物6小时，转化大肠杆菌感受态，涂布于LB平板上，37°C恒温培养12-16小时，挑取单菌落于液体LB中，37°C、 250rpm培养12小时，提取质粒DNA，利用Clal/BamHI酶切提取质粒DNA，切下2. 2kb的片段，得到PEX质粒表达载体。
5.如权利要求2或4所述的真菌表达载体，其特征在于所述筛选标记基因为酸性海藻糖酶基因(包括ATM基因、ATA基因，但不限于这两个酸性海藻糖酶基因)。
6.如权利要求1 5任一项所述真菌表达载体的构建方法，其特征在于首先将所述 PBarEx的Bar基因去除得到真菌表达载体ρΕΧ，再将ρΕΧ与酸性海藻糖酶基因连接构建真菌组成性表达载体。
7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于所述酸性海藻糖酶基因采用ATM或ATA 基因(但不限于这两个酸性海藻糖酶基因)，其与真菌表达载体PEX连接构建真菌表达载体 ρΕΧ-ΑΤΜ ；所述将ρΕΧ与酸性海藻糖酶基因ATM连接过程中采用的模板为ATM基因cDNA克隆载体pUC19-ATM ；其中采用ATM-R为引物，所述ATM-R引物为SEQ ID NO 5所示的序列。
8.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于所述将ρΕΧ与ATM或ATA(但不限于这两个酸性海藻糖酶基因)连接是以ATM基因cDNA克隆载体pMD19- ATM为模板，用根据金龟子绿僵菌菌体CQMal02酸性海藻糖酶基因反转录cDNA序列设计的引物ATM-F和ATM-R，通过PCR扩增出两端分别带有ClaI与XmaI酶切位点的3303bp的ATM基因全长cDNA序列， 并将其克隆到无其它筛选标记的真菌超表达载体PEx的ClaI和XmaI位点之间，使ATM基因处于来自构巢曲霉3—磷酸甘油醛脱氢酶gpdA基因的启动子与的色氨酸trpC基因的终止子控制之下，得到PEx- ATM表达载体；所述引物ATM-F为SEQ ID NO 6所示的序列；所述引物ATM-R为SEQ ID NO 5所示的序列。
9.如权利要求1 5任一项所述真菌表达载体构建的转化子的筛选方法，是以海藻糖为唯一碳源的培养基进行筛选。
全文摘要
一种真菌表达载体，所述表达载体为由pEX质粒表达载体和作为筛选标记的酸性海藻糖酶基因构成的组成性表达载体；其中质粒表达载体pEX是将表达载体pBarEx中的Bar基因去掉而成的，筛选标记基因为ATM或ATA等酸性海藻糖酶基因。本发明真菌表达载体采用了安全、对环境友好的筛选标记，采用本发明真菌表达载体构建的昆虫病原工程真菌释放到环境中不会因筛选标记的原因而对环境造成不利影响；本发明真菌表达载体的设计原理独特、构建方法巧妙、程序简单，同时对利用本发明真菌表达载体的昆虫病原真菌转基因菌株的筛选程序简单、筛选效率高，而且不影响真菌的代谢平衡，在转基因真菌研究及市场化过程中具有潜在的、广泛的应用前景。
文档编号C12N15/80GK102181472SQ20111007208
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月24日 优先权日2011年3月24日
发明者夏玉先, 彭国雄, 金凯 申请人:重庆大学