链球菌auh-jld109及其在柚皮素生物合成中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种链球菌AUH-JLD109及其在柚皮素生物合成中的应用，属于微生物及其应用【技术领域】。链球菌AUH-JLD109，保藏号为CGMCCNo.8033。其应用包括下述步骤：（1）混菌种子液的培养；（2）底物柚皮苷与混菌种子液共培养；（3）代谢产物的分离纯化。本发明采用链球菌AUH-JLD109使柚皮苷进行转化，转化性能稳定，大大提高了柚皮素的转化率，且方法简单，原料易得，成本低。
【专利说明】链球菌AUH-JLD109及其在柚皮素生物合成中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物及其应用。
【背景技术】
[0002]柚皮素(Naringenin)是二氢黄酮类化合物，具有抗菌、抗炎、抗癌、抗高血糖、抗氧化、解痉孪和利胆等多种生理或药理功能。早在上世纪90年代人们就曾认识到柚皮素具有抗癌功效，如Guengerich等于1990年报道柚皮素而非柚皮苷能抑制黄曲霉毒素BI诱导的致癌作用{Carcinogenesis, 1990，，11:2275-2279) ；Chen 等于 2003 年发现，较低浓度的柚皮素(40微摩尔/升)即可引起白血病细胞系HL-60细胞发生凋亡，且表现出明显的量效关系和时间依赖性；与葡萄糖和鼠李糖结合的柚皮素(即柚皮苷)在相同浓度下甚至更高浓度(80微摩尔/升)下仍不表现明显的细胞凋亡作用，而用柚苷酶处理柚皮苷后又产生明显细胞凋亡作用，这一研究结果再次证明柚皮素而非柚皮苷的抗癌活性
2003,66:1139-1150)。此外，RAZA等用柚皮素预处理雄性小鼠21天后发现，柚皮素可显著减弱局部性脑损伤小鼠模型中的氧化应激以及受NF-KB调节的炎症进程(.Neuroscience, 2013, 230:157-171 )。Ortiz-Andrade等发现柚皮素具有体内外抗高血糖活UDiabetes，Obesity and Metabolism, 2008,10:1097-1104)。我国学者廖霞等曾报道柚皮素对凝血酶诱导的血小板聚集有明显抑制作用，且该抑制作用随浓度的增加而增大m珍国医药，2Q\Q，2\ (11):2909-2910)。
[0003]柚皮素为天然产物，但因在天然植物中含量较低，直接从植物中提取分离柚皮素的收率也较低。如陈雪峰等采用传统有机溶剂法从桃叶中提取柚皮素，通过试验确定柚皮素最佳提取条件为:乙醇和甲醇混合溶剂(浓度比为甲醇:乙醇=7:3)，温度为50°C，时间为5小时,料液比为1:45(克/毫升)，然而在该最佳提取条件下柚皮素的收率仅为5.25%(#^#^,2009,34(5):209-212)。与柚皮素相比，柚皮苷(即与葡萄糖和鼠李糖结合的柚皮素)则在柑橘属植物中分布广泛且含量较高。目前柚皮素的工业生产多以柚皮苷为底物，采用酸水解或柚苷酶水解这两种生产方式。刘亚萍(光?變实.验室.，2008，25 (6):1292-1294)提供了酸水解柚皮苷来制备柚皮素的方法，然而，这种方法需多次结晶才能获得纯度较高的柚皮素。专利CN 102453011 A通过酸水解的方法虽获得的柚皮素的纯度较高，但是涉及到的有机溶剂种类多且步骤繁琐，不适合现代化生产绿色环保的要求。2003年Hwang等通过基因工程手段首次以酪氨酸为底物生物合成柚皮素，所设计的3套质粒系统中以第3套的得率最高，所制得的柚皮素约为400微克/ T^iApplied Microbiology Biotechnology,2003，69 (5): 2699-2706)。此后，Leonard于2008年利用重组大肠杆菌以苯丙氨酸为底物，添加外源丙二酸盐诱导，并通过脂肪酸抑制宿主本身丙二酰辅酶A的旁路流失得到186毫克/升的柚皮素{Molecular Pharmaceutics，2.，5 (2): 257-265)。利用基因工程菌生物合成柚皮素的方法虽简便，但产量低，不适宜规模化生产。此外，酶水解柚皮苷获得柚皮素是目前柚皮素制备的另一主要途径。郑美瑜等i中国食品学报，2010，10 (4): 141-146)研究证实成品柚苷酶对柚皮苷单体的酶解条件为:酶解液中底物质量浓度为25克/毫升，酶含量为I酶单位/毫升，酶解时间为1.0-1.5小时，此条件下柚皮苷单体可被完全降解。酶法制备柚皮素具有反应条件温和、副产物少、产物纯度高等优点，但成品柚皮苷酶价格昂贵，也同样不适合大规模工业化生产，因此目前急需找到一种廉价高效的生物酶源来代替成品柚皮苷酶制备柚皮素。
[0004]柚苷酶广泛存在于植物、酵母、真菌及细菌中，近年来虽然国内外也从曲霉属、青霉属中筛选到高产柚苷酶真菌菌株，但是由于真菌发酵生产柚苷酶存在一些问题如(I)发酵周期长、需氧量大、发酵液粘稠，后期处理困难；(2)几乎所有菌株都受到葡萄糖的调节作用；(3)多数产柚苷酶真菌为多核细胞且易形成菌丝体，给菌种的选育造成困难，发酵过程中难以建立稳定的发酵系统。这一系列问题致使目前柚苷酶的价格较高。细菌生长迅速且遗传性能稳定，利用细菌发酵生产柚皮素因操作容易越来越受到人们关注。然而，目前国内外仅分离报道两株能产柚苷酶(能同时将结构中的鼠李糖和葡萄糖水解掉的酶)活性的细菌菌株，且两株菌产柚苷酶活性均较低。其中一株为Puri等2010年从土壤中分离到的葡萄球菌属菌株成r/ococci/s xylosus MAK2 (酶活性为8.45酶单位/毫升;Biochemistry2010,162:181-191),另一株为 Pavithra Mukund 等从土壤中分离到的芽孢杆菌属菌株AaciVJrW1S methy1trophicus (酶活性为12.05酶单位/毫升；Preparative Biochemistry and Biotechnology, do1: 10.1080/10826068.2013.797910)。相比之下，已报道的多为产a-L-鼠李糖苷酶(即只能将鼠李糖水解掉的酶)的细菌菌株，如拟杆菌属(ifecieroiofessp.)、梭杆菌属(/7W1SoAacieria?sp.)、芽抱杆菌属(Bacillus sp.)和梭菌属{Clostridium sp.)等。
【发明内容】
[0005]本发明提供一种链球菌{Streptococcussp.) AUH-JLD109,保藏号为 CGMCCN0.8033。
[0006]本发明还提供在链球菌AUH-JLD109在柚皮素生物合成中的应用，采用链球菌AUH-几D109使柚皮苷进行转化，转化性能稳定，大大提高了柚皮素的转化率，且方法简单，原料易得，成本低。
[0007]本发明采取的技术方案为:
一种链球菌(泣sp.) AUH-JLD109，保藏号为 CGMCC N0.8033。
[0008]链球菌(StrepiococciAs sp.) AUH-JLD109在柚皮素生物合成中的应用。
[0009]其应用包括下述步骤:
(1)混菌种子液的培养
将链球菌(SirepiococciAs sp.) AUH-JLD109的种子液与大肠埃希氏菌{Escherichiacoli) AUH-D2-1的种子液接种于LB液体培养基或混菌发酵培养基中培养，得到混菌种子液；所述大肠埃希氏菌(Escherichia coli) AUH-D2-1，保藏号为 CGMCC N0.8031 ；
(2)底物柚皮苷与混菌种子液共培养
将步骤(1)得到的混菌种子液转接到LB培养基或混菌发酵培养基中，加入柚皮苷粗品母液进行共培养；所述混菌发酵培养基的重量组成为:1.0-1.5%可溶性淀粉，1.0-2.0%蛋白胨，磷酸盐0.3-0.7%和0.002%-0.008%的硫酸铁，余量为水；磷酸盐为磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的混合物，磷酸氢二钾与磷酸二氢钾的质量比为2:1 ；(3)代谢产物的分离纯化。
[0010]优选的，步骤(1)中链球菌AUH-JLD109的种子液通过下述方法培养:将低温冷冻保存的链球菌AUH-JLD109融化并按15-20%接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，37°C恒温培养箱内培养24小时；再以10%接种量将试管中的菌株AUH-JLD109重新转接到新鲜BHI液体培养基中，继续培养18-24小时作为种子液。
[0011]优选的，步骤(1)中大肠埃希氏菌AUH-D2-1的种子液通过下述方法培养:将低温冷冻保存的大肠埃希氏菌AUH-D2-1融化并按10-15%接种量接种到盛有新鲜LB液体培养基的试管中，37°C恒温培养箱内培养下培养24小时,再以10%接种量将试管中菌株AUH-D2-1重新转接到新鲜LB液体培养基中，继续18-24小时作为种子液。
[0012]优选的,步骤(1)中将链球菌(SirepiococciAs sp.) AUH-JLD109的种子液与大肠埃希氏菌{Escherichia coli) AUH_D2_1的种子液各以10%的接种量接种于LB液体培养基中，培养18-24小时。
`[0013]优选的，步骤(2)混菌种子液按10-15%接种，加入柚皮苷粗品母液使柚皮苷的终浓度为5.5-6.5毫摩尔/升，37°C恒温培养箱内培养2-3天。
[0014]优选的，步骤(2)中柚皮苷粗品母液中底物柚皮苷浓度为110-160毫摩尔/升。
[0015]优选的，步骤(2)中采用混菌发酵培养基进行共培养。
[0016]进一步优选的，步骤(3)中分离纯化为:等体积的乙酸乙酯将培养物萃取2次，萃取液过滤后蒸干，加入100%甲醇溶液，用制备柱在HPLC上进行分离，得到代谢产物柚皮素。
[0017]链球菌(StrepiococciAs sp.) AUH-JLD109是从健康人粪便中分离得到的一株革兰氏阳性兼性厌氧细菌菌株，该菌株能将中药化橘红乙醇水溶液提取物的柚皮苷粗品高效转化为柚皮素。推测是柚皮苷粗品在链球菌(Sire/?iococcM sp.) AUH-JLD109 (为方便书写，在这里将链球菌StrepiococciAs sp.AUH-JLD109简称菌株AUH-JLD109,以下均使用该转化菌株的简称形式)产生的柚苷酶作用下首先被水解掉一个鼠李糖生成普鲁宁，然后再
水解掉一个葡萄糖生成柚皮素，有关柚皮素微生物生物合成途径如下所示:
【权利要求】
1.一种链球菌(泣sp.) AUH-JLD109，保藏号为 CGMCC N0.8033。
2.如权利要求1所述的链球菌AUH-JLD109在柚皮素生物合成中的应用。
3.根据权利要求2所述的链球菌AUH-JLD109在柚皮素生物合成中的应用，其特征在于包括如下步骤: (1)混菌种子液的培养 将链球菌(SirepiococciAs sp.) AUH-JLD109的种子液与大肠埃希氏菌{Escherichiacoli) AUH-D2-1的种子液接种于LB液体培养基或混菌发酵培养基中培养，得到混菌种子液；所述大肠埃希氏菌(Escherichia coli) AUH-D2-1，保藏号为 CGMCC N0.8031 ； (2)底物柚皮苷与混菌种子液共培养 将步骤(1)得到的混菌种子液转接到LB培养基或混菌发酵培养基中，加入柚皮苷粗品母液进行共培养； (3)代谢产物的分离纯化； 所述混菌发酵培养基的重量组成为:1.0-1.5%可溶性淀粉，1.0-2.0%蛋白胨，磷酸盐0.3-0.7%和0.002%-0.008%的硫酸铁，余量为水；磷酸盐为磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的混合物，磷酸氢二钾与磷酸二氢钾的质量比为2:1。
4.根据权利要求3所述的链球菌AUH-JLD109在柚皮素生物合成中的应用，其特征在于所述步骤 (1)中链球菌AUH-JLD109的种子液通过下述方法培养:将低温冷冻保存的链球菌AUH-JLD109融化并按15-20%接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，37°C恒温培养箱内培养24小时；再以10%接种量将试管中的菌株AUH-JLD109重新转接到新鲜BHI液体培养基中，继续培养18-24小时作为种子液。
5.根据权利要求3所述的链球菌AUH-JLD109在柚皮素生物合成中的应用，其特征在于所述步骤(1)中大肠埃希氏菌AUH-D2-1的种子液通过下述方法培养:将低温冷冻保存的大肠埃希氏菌AUH-D2-1融化并按10-15%接种量接种到盛有新鲜LB液体培养基的试管中，37°C恒温培养箱内培养下培养24小时，再以10%接种量将试管中菌株AUH-D2-1重新转接到新鲜LB液体培养基中，继续18-24小时作为种子液。
6.根据权利要求3所述的链球菌AUH-JLD109在柚皮素生物合成中的应用，其特征在于所述步骤(1)中将链球菌(SirepiococciAs sp.) AUH-JLD109的种子液与大肠埃希氏菌Escherichia coli) AUH_D2_1的种子液各以10%的接种量接种于LB液体培养基中，培养18-24小时。
7.根据权利要求3所述的链球菌AUH-JLD109在柚皮素生物合成中的应用，其特征在于所述步骤(2)混菌种子液按10-15%接种，加入柚皮苷粗品母液使柚皮苷的终浓度为5.5-6.5毫摩尔/升，37 °C恒温培养箱内培养2-3天。
8.根据权利要求3所述的链球菌AUH-JLD109在柚皮素生物合成中的应用，其特征在于所述步骤(2)中柚皮苷粗品母液中底物柚皮苷浓度为110-160毫摩尔/升。
9.根据权利要求3所述的链球菌AUH-JLD109在柚皮素生物合成中的应用，其特征在于所述步骤(2)中采用混菌发酵培养基进行共培养。
10.根据权利要求3所述的链球菌AUH-JLD109在柚皮素生物合成中的应用，其特征在于所述步骤(3)中分离纯化为:等体积的乙酸乙酯将培养物萃取2次，萃取液过滤后蒸干，加入100%甲醇溶液，用制备柱在HPLC上进行分离，得到代谢产物柚皮素。
【文档编号】C12P17/06GK103740610SQ201310689588
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月17日 优先权日:2013年12月17日
【发明者】王秀伶, 陈静, 邵子强, 李佳宜 申请人:河北农业大学