一种新疆紫草内生真菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物领域，具体地说，是一种新疆紫草内生真菌，及其菌丝的水溶性 提取物（WAE)用于促进新疆紫草毛状根生长和提高紫草素类成分含量的用途。
【背景技术】
[0002] 紫草是我国的常用中药材，味甘、咸，性寒，归心、肝经，具有凉血、活血、解毒透瘆 等功效。《中华人民共和国药典》（2010版)收录紫草的主要来源为紫草科（Boraginaceae) 新疆紫草A 或内蒙紫草A讲的干燥根。紫草药材的有效成分是萘醌 类成分紫草素及其衍生物和紫草多糖，而研宄表明新疆紫草Arnebiaeuchroma(Royle)Johnst.比内蒙紫草的萘醌类有效成分的含量高，临床疗效好，利用价值高，为新疆特有种， 有"道地药材"之誉，因而行销国内外，已成为是传统中药材紫草的主要来源。然而近些年， 由于紫草药用部位是根部，无节制的采挖和盗挖导致野生资源破坏严重，新疆紫草已被列 为国家三级重点保护野生药材。由于新疆紫草产于新疆天山海拔2600~3300m的高寒山 区和草甸带，野生状态下对生境要求严格，因此尚无驯化成功和大面积人工栽培成功的报 道，少量栽培紫草品质参差不齐，不能批量供应市场。因此，有效提高栽培紫草的品质、促进 新疆紫草的大面积规范化种植及产业化成为另一个迫切需要解决的问题。
[0003] 植物内生真菌（Endophyticfungiorfungalendophtes)是指在生活史中的某 一个阶段存在于健康植物组织内部，不会引起宿主明显病症或者对宿主造成明显伤害的真 菌。研宄表明，在目前研宄过的所有植物中均发现有内生菌，可存在于植物的根、茎、叶、花、 果实等各个部位。1993年，Strobel等首次报道了从短叶紫杉Tkrys△reri/b/ia的树皮 中分离得到一株能够产生紫杉醇的内生真菌引起了国内外众多研 宄者的极大关注，纷纷把目光投向药用植物内生真菌的研宄。近二十年药用植物内生真菌 的研宄多集中在内生真菌的生物多样性、次生代谢产物和内生真菌与宿主之间的相互关系 等方面。内生真菌在生产天然药用成分、丰富天然药物宝库中的作用已被许多研宄所证实。 除此之外，研宄还发现植物内生真菌能够促进宿主植物的生长，增强宿主的抗逆性，促进药 用植物中有效成分的积累，已成为中药品质研宄一个崭新的发展方向。但是关于一种新疆 紫草内生真菌及其菌丝的水溶性提取物（WAE)用于促进新疆紫草毛状根生长和提高紫草素 类成分含量的用途目前还未见报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种新疆紫草内生真菌。
[0005] 本发明的第二个目的是，提供一种新疆紫草内生真菌的应用。
[0006] 本发明的第三个目的是，提供一种新疆紫草内生真菌菌丝水溶性提取物。
[0007] 本发明的第四个目的是，提供一种新疆紫草内生真菌菌丝水溶性提取物的制备方 法。
[0008] 本发明的第五个目的是，提供一种新疆紫草内生真菌菌丝水溶性提取物的应用。
[0009] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种新疆紫草内生真菌，所述的新疆 紫草内生真菌的保藏编号为CGMCCNo. 4712。
[0010] 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：所述的新疆紫草内生真菌在 促进新疆紫草毛状根生长和提高新疆紫草毛状根中紫草素类成分含量中的应用。
[0011] 所述的紫草素类成分为紫草素或乙酰紫草素。
[0012] 为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：一种新疆紫草内生真菌菌丝 水溶性提取物，所述的菌丝水溶性提取物的制备方法为：收集发酵培养10-13天的所述的 新疆紫草内生真菌菌丝体，加入蒸馏水重悬，100-120°C灭菌30-60min，冷却，减压抽滤后得 到的滤液，即为新疆紫草内生真菌菌丝水溶性提取物。
[0013] 为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：一种新疆紫草内生真菌菌丝 水溶性提取物的制备方法，包括以下步骤：收集发酵培养10-13天的所述的新疆紫草内生 真菌菌丝体，加入蒸馏水重悬，100-120°C灭菌30-60min，冷却，减压抽滤后得到的滤液，即 为新疆紫草内生真菌菌丝水溶性提取物。
[0014] 为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是：所述的新疆紫草内生真菌菌 丝水溶性提取物在促进新疆紫草毛状根生长和提高新疆紫草毛状根中紫草素类成分含量 中的应用。
[0015] 所述的紫草素类成分为紫草素或乙酰紫草素。
[0016] 本发明优点在于： 本发明首次发现了一种新疆紫草内生真菌，并从新疆紫草内生真菌菌丝中制备了水溶 性提取物（WAE)，发现WAE能有效促进新疆紫草毛状根生长，同时能显著性地提高毛状根中 紫草素类成分的含量。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合实施例对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0018] 本发明提供一种新疆紫草内生真菌，其分类命名为深绿木霉 atrwiriofe，菌株代号为AE9,保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心（CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研宄所，保藏日期 (2011年3月27日），保藏编号为CGMCCNo. 4712。
[0019] 它的显微形态为：培养的菌丝体无色、分枝繁复，由具有横隔的分枝菌丝构成，分 枝角度为近似90°;分生孢子梗的可育延伸物没有或者很少产生，没有不育的菌毛；虽然成 对着生的分枝比较常见，但是分生孢子梗的典型分枝方式为单侧分枝；分生孢子绿色，亚球 形至卵圆形，没有明显的脱落痕迹，光滑，成簇着生于分生孢子梗的顶端。
[0020] 1.新疆紫草内生真菌菌丝水溶性提取物（WAE)的制备。
[0021] 收集发酵培养10-13天的以上所述新疆紫草内生真菌菌丝体，加入适量蒸馏水重 悬，100-120°C灭菌30-60min。待自然冷却，减压抽滤后得到的滤液，即为新疆紫草内生真菌 水溶性提取物。
[0022] 2.新疆紫草内生真菌菌丝水溶性提取物（WAE)对新疆紫草毛状根生长和紫草素 生物合成的影响。
[0023] 在新疆紫草毛状根悬浮培养第16-24天，添加总糖浓度为50-400 mg/L的新疆紫 草内生真菌菌丝水溶性提取物WAE，继续悬浮培养12-30天，毛状根生物量提高了 12%-55%， 紫草素的含量提高了 15-40倍，乙酰紫草素的含量提高了 4-14倍。新疆紫草内生真菌菌丝 水溶性提取物菌丝WAE能够有效地提高新疆紫草毛状根的生物量，促进紫草素类成分的生 物合成。
[0024] 实施例1内生深绿木霉菌AE9的发酵 将新疆紫草内生真菌AE9接种至1/2B5固体培养基上室温培养3-5天；然后采用打孔 器打孔的方式将固体培养基上的D16菌丝接种至250ml三角瓶（内含100ml1/2B5培养液） 中，26°C、180rpm培养3-5天即得培养种子液；最后将培养种子液接种至5L三角瓶（内含4L 1/2B5培养液）中，26°C、160rpm培养10天。
[0025] 实施例2新疆紫草内生真菌菌丝水溶性提取物（WAE)的制备 收集发酵培养10-13天的新疆紫草内生真菌AE9菌丝体，加入适量蒸馏水重悬，高压锅 110°C灭菌30-60min。待自然冷却，减压抽滤后得到的滤液，即为新疆紫草内生真菌水溶性 提取物。采用硫酸-苯酚法测定总糖浓度。
[0026] 实施例3新疆紫草毛状根的扩繁和生产 1.毛状根扩繁 将2~4cm的毛状根接种在装有50mLSH培养基的250mL锥形瓶中，蔗糖30g/L， 肌醇1g/L，水解酪蛋白0.5g/L。培养液pH5. 8,在20~25°C，摇床速度（100-4-10) r/min，暗培养条件下进行振荡培养15d收获，备用。
[0027] 2.毛状根生产阶段 将1培养的毛状根接种在装有100mLM-9培养基的250mL锥形瓶中，接种量2g/ 瓶，培养基口!15.8，蔗糖30 8/1。在20-251：、摇床转速为（100+10)1'/1^11下暗培养。 培养25d收获，灭菌吸水纸吸干其表面水分，称重，计算毛状根增殖倍数。
[0028] 实施例4新疆紫草内生真菌菌丝水溶性提取物（WAE)对新疆紫草毛状根生长和 紫草素类成分生物合成的影响 根据实施例2制备AE9菌丝WAE溶液。按硫酸-苯酚法测定的总糖浓度后，添加一定 体积的WAE溶液配制成总糖浓度为75、150、300mg/L的1/2B5诱导培养液，110°C灭菌30 分钟后自然冷却待用。将正常培养21天的新疆紫草毛状根的培养液更换为诱导培养液，继 续培养18天后收获。新疆紫草毛状根干重和2种紫草素含量见表1。从表中数据可以看 出，不同浓度的WAE均能显著性地提高新疆紫草毛状根的生物量；诱导浓度为300mg/L时 效果最好，毛状根的生物量提高了 55%。同时不同浓度的WAE也均能显著性地提高新疆紫草 毛状根中紫草素类成分的含量：紫草素的含量提高了 15-40倍，乙酰紫草素的含量提高了 4-14倍。内生真菌AE9菌丝WAE能够有效地提高新疆紫草毛状根的生物量，促进紫草素类 成分的生物合成。
[0029] 表1 新疆紫草内生真菌AE9菌丝水提取物对新疆紫草毛状根生长和紫草素合 成的影响（X土SD，n=10)
【主权项】
1. 一种新疆紫草内生真菌，其特征在于，所述的新疆紫草内生真菌的保藏编号为CGMCC No. 4712〇
2. 根据权利要求1所述的新疆紫草内生真菌在促进新疆紫草毛状根生长和提高新疆 紫草毛状根中紫草素类成分含量中的应用。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的紫草素类成分为紫草素或乙酰紫 草素。
4. 一种新疆紫草内生真菌菌丝水溶性提取物，其特征在于，所述的菌丝水溶性提取物 的制备方法为：收集发酵培养10-13天的权利要求1所述的新疆紫草内生真菌菌丝体，加入 蒸馏水重悬，100-120°C灭菌30-60min，冷却，减压抽滤后得到的滤液，即为新疆紫草内生真 菌菌丝水溶性提取物。
5. -种新疆紫草内生真菌菌丝水溶性提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 收集发酵培养10-13天的权利要求1所述的新疆紫草内生真菌菌丝体，加入蒸馏水重悬， 100-120°C灭菌30-60min，冷却，减压抽滤后得到的滤液，即为新疆紫草内生真菌菌丝水溶 性提取物。
6. 根据权利要求4所述的新疆紫草内生真菌菌丝水溶性提取物在促进新疆紫草毛状 根生长和提高新疆紫草毛状根中紫草素类成分含量中的应用。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的紫草素类成分为紫草素或乙酰紫 草素。
【专利摘要】本发明涉及一种新疆紫草内生真菌及其应用，所述的新疆紫草内生真菌的保藏编号为CGMCC No.4712。本发明还提供一种新疆紫草内生真菌菌丝水溶性提取物及其制备方法及其应用。本发明优点在于：本发明首次发现了一种新疆紫草内生真菌，并从新疆紫草内生真菌菌丝中制备了水溶性提取物（WAE），发现WAE能有效促进新疆紫草毛状根生长，同时能显著性地提高毛状根中紫草素类成分的含量。CGMCC No. 471220110327
【IPC分类】A01N63-04, A01P21-00, C12N1-14, C12R1-645, A01G7-06
【公开号】CN104745482
【申请号】CN201410461671
【发明人】韩婷, 秦路平, 贾晓光, 郑承剑, 贾敏
【申请人】中国人民解放军第二军医大学
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2014年9月12日