一株在低磷环境下促进台湾相思生物量增长的内生真菌的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一株在低磷环境下促进台湾相思生物量增长的内生真菌。所述内生真菌为青霉属（Penicillium sp.），已于2016年1月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏号为CGMCC No.11913。将台湾相思内生真菌I接种于台湾相思土培苗，通过对植株苗高、生物量的测定，得出接种该菌株在低磷环境下的处理植株的苗高、生物量均基本较大程度高于对照，表明其在低磷环境下对促进植株生物量增长具有很大功用，从而进一步证实得到该株内生真菌能在低磷环境下促进台湾相思植株生物量生长。CGMCC No. 1191320160127
【专利说明】
-株在低磯环境下促进台湾相思生物量増长的内生真菌
技术领域
[0001] 本发明设及一株在低憐环境下促进台湾相思生物量增长的内生真菌。
【背景技术】
[0002] 植物内生菌的研究始于19世纪末，Vogl从黑麦草Lolium temulentum L.种子中分 离出第一株内生菌。但真正开始大量研究植株中的内生菌起始于上世纪八十年代，主要是 在溫带地区、亚热带地区和热带地区的植被中开展研究。 植物内生真菌的分布广、种类多，前人研究表明从绝大多数植物体内都能分离得到内 生真菌，由此可见内生真菌普遍存在于植物体内。在全世界范围内至少在80多个属290多种 的禾本科农作物中发现了内生菌。目前从植物中分离的内生菌根据其具有的独特功能可W 分为：固氮菌、固钟菌、固憐菌等植物促生菌、具有抗病虫害的生防菌和具有促进植物对不 良环境的修复能力的抗性菌。 有关内生真菌对台湾相思生长的影响研究还存在空白。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一株在低憐环境下促进台湾相思生物量增长的内生真菌， 该真菌为青霉属(户6打如別知?巧7.)，已于2016年1月27日在中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中屯、登记保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No. 11913。 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 该菌的分离、纯化包括： A、 材料:将采集得到不同年份的根、枝茎、叶分成Ξ个部分，用自来水清洗干净，分装到 自封袋内，于4°C冰箱保存； B、 消毒:75%酒精漂洗30s 一无菌水冲洗3-4次一 15%的次氯酸钢漂洗(根lOmin，茎5min， 叶2min)^无菌水冲洗4-5次。当样品最后一次浸洗后的水盛于灭菌的小烧杯中，在平板上 划线作为对照，W检验样品的消毒是否彻底，若干天后如有菌落生成，则表明样品表面消毒 不彻底，需继续调整消毒方法； C、 接种部位的选择:叶片：叶尖部、叶中部和叶基部3个处理;枝茎:上中下分为3部位， 其中第3部位为枝茎交接处;根部:分为根尖和根基2个部分； D、 接种:将消毒后的外植体用接种刀切开，铺放在培养基表面，于28Γ恒溫培养箱内 培养5-7天后观察菌落生长状况。有的菌株繁殖迅速，可先将其产生的菌株进行分离纯化； 生长缓慢且数量较少的菌株可延长观察时间，直到其生长稳定后纯化； 固体培养:使用改良马下固体培养基，配方为蛋白腺5.Og/L、酵母浸出粉2.Og/L、葡萄 糖20 . Og/L、憐酸氨二钟1. Og/L、硫酸儀0.5g/L、琼脂14. Og/L、其它为无菌水，pH值6.4± 0.2，培养溫度为28 °C，培养方式为平板培养，培养时间为4她； E、 将分离繁殖出的不同种类的内生真菌接入平板培养基进行纯化，经过2-3次点接纯 化、转接后分别得到单一菌种的上述的s/7.功能菌株； 上述的一种在低憐环境下促进台湾相思生物量增长的内生真菌应用菌液的制备方法， 是将上述的菌株接入液体培养基，摇床振荡培养，培养溫度为28Γ，培养时间48~72h，利用 血球计数板计算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成1.0-9.0X106c化/ml即为成品备用;液 体培养基:为改良马下培养基，其中蛋白腺5. Og/L、酵母浸出粉2. Og/L、葡萄糖20.0 g/L、憐 酸氨二钟1. Og/L、硫酸儀0.5g/L、其它为无菌水、pH值6.4 ± 0.2。 上述的一种在低憐环境下促进台湾相思生物量增长的内生真菌应用菌液的应用方法， 是应用该菌株的菌液诱施于台湾相思苗木根际±壤或苗木直接接种。 上述的一种在低憐环境下促进台湾相思生物量增长的内生真菌应用菌液的应用方法， 是用5.5 X 106c化/ml菌液，按每株100ml在林地诱于每株台湾相思的根际。 本发明设及的菌株是从台湾相思植株中分离纯化得到的，经接种于台湾相思±培苗， 根据各项指标综合评判，进一步证实其在低憐环境下对植株生长具有促进台湾相思生物量 增长的作用，寻找到对促进植株在低憐环境下生物量增长的有益的功能内生真菌可应用于 生产。
[0004] 通过菌液诱施的方法接种于台湾相思幼苗，并在接种15天后进行低憐胁迫试验， 在胁迫Od时测定其苗高，胁迫90d时测定其苗高及其生物量。根据测得的各项指标综合评 判，进一步证实其对植株生长具有缓解低憐胁迫的作用，寻找到对促进植株生物量有益的 功能内生真菌可应用于生产。通过对植株苗高和生物量的测定，得出接种该菌株的处理的 苗高增长率和生物量均基本较大程度高于对照，表明其在低憐环境下对促进植株生物量增 长具有很大功用，从而进一步证实得到该株内生真菌能在低憐环境下促进台湾相思植株生 物量生长。
【附图说明】
[0005] 图1为不同处理对台湾相思幼苗苗高的影响； 图2为不同处理对台湾相思幼苗生物量的影响。
【具体实施方式】
[0006] -、根际±壤诱施与苗木直接接种应用 本试验采用±培盆栽试验，试验所用材料为福建省潭州市市林业局提供的台湾相思一 年生苗。选择长势一致的台湾相思苗木定植于直径15cm，高10cm的塑料盆中。所用±壤是严 格经过熏蒸消毒的黄屯、±。经过混匀称量，每盆放入等量的31^±壤。经过一个月的恢复性 生长后，连续Ξ天于台湾相思根际施入浓度为5.5 X 106c化/ml的lOOmL菌液，用蒸馈水溶液 作为空白对照。
[0007] 菌液制备:将供试菌株接入40mL的液体培养基，培养基为改良马下培养基，其中蛋 白腺5.Og/L、酵母浸出粉2.Og/L、葡萄糖20.Og/L、憐酸氨二钟1.Og/L、硫酸儀0.5g/L、其它 为无菌水、pH值6.4±0.2,在恒溫振荡培养箱中经过7化的培养。用无菌生理盐水按十倍稀 释法将菌液稀释，利用血球计数板计算菌液浓度配制成5.5 X 106c化
[000引二、低憐胁迫试验设计 盆栽试验±壤的基质为黄屯、±。经测定该±壤中各养分物质见表1。接种15天后进行低 憐胁迫试验处理，运段时间主要是让接种菌株侵入植株。
[0009] 表1基质±壤养分情况 单位:mg/g
本试验设计了 4个憐处理水平，每个水平3个重复(表2 )。憐肥采用K也P〇4，定期施氮肥、 钟肥及其他微量元素，直至收获。低憐胁迫于2015年5月4日进行。根据天气状况及时为台湾 相思苗补充水分。
[0010] 表2低憐胁迫试验设计 单位:mg/kg
在胁迫0加寸、90加寸测定植株的苗高，90d后测定其生物量。检测方法如下： (1) 苗高的测定 钢尺测定苗高 (2) 生物量的测定 将植株的不同部位分别放入信封中并标上记号，放入烘箱105°C烘干半小时(纯化酶）， 在60°C下烘干，经过1化后，称重后再放入烘箱中，重复测定直至恒重为止。称得样品的重量 (W)，即为样品干重，W此表示植株的生物量，精确到O.Olg。
[0011] (3)数据处理 数据整理与作图采用Excel2003,数据的统计学分析采用SPSS20.0。
[0012] Ξ、结果与分析 (1)不同低憐胁迫下不同处理对台湾相思苗高的影响 四个不同低憐胁迫条件分别为:重度胁迫、中度胁迫、轻度胁迫、正常条件。如图1所示， 在四个不同低憐胁迫程度下，接种菌株I的幼苗的苗高增长率分别比对照大113.48%、 130.17%、73.11%、40.24%，由此可知，菌株I有利于促进植株苗高的增长。
[0013] (2)不同低憐胁迫下不同处理对台湾相思生物量的影响 生物量是反映苗木生产力水平的重要指标，它与苗木的生长发育存在着非常密切的关 系。如图2所示，在四个不同低憐胁迫程度下，接种菌株I的幼苗的生物量分别比对照大 92.60%、103.20%、10.38%、12.82%，由此可得，菌株I有利于促进植株生物量的生长。
[0014] 本发明发现一株在低憐环境下能促进台湾相思苗生物量增长的内生真菌，将该株 台湾相思内生真菌菌株采用诱根的方法接种于台湾相思幼苗。通过对植株的苗高、生物量 的测定，得出接种该菌株的处理的苗高、生物量增长均较大程度高于对照，表明其对于促进 植株生物量的增长具有很大功用，从而进一步证实得到该株内生真菌在低憐环境下能促进 台湾相思生物量的增长。
[0015] W上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与 修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1. 一株在低磷环境下促进台湾相思生物量增长的内生真菌，其特征在于：该真菌为青 霉属(PaoiciDiuffi S/7.)，已于2016年1月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心登记保藏，保藏号为CGMCC No. 11913。2. -种如权利要求1所述的一株在低磷环境下促进台湾相思生物量增长的内生真菌的 应用菌液，其特征在于:所述应用菌液的制备方法，将所述的青霉属(s/7.)菌 株接入液体培养基，摇床振荡培养，培养温度为28 °C，培养时间48~72h，利用血球计数板计 算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成1.0-9.0 X 106cfu/ml，备用;液体培养基:为改良马丁 培养基，其中蛋白胨5. Og/L、酵母浸出粉2. Og/L、葡萄糖20.0 g/L、磷酸氢二钾1. Og/L、硫酸 镁0.5g/L、其它为无菌水、pH值6.4 ± 0.2。3. -种如权利要求2所述的应用菌液的用途，其特征在于:所述应用菌液用于台湾相思 苗木根际土壤浇施或苗木直接接种。
【文档编号】C12R1/80GK106010984SQ201610454595
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月22日
【发明人】谢安强, 陈灿, 林晗, 吴承祯, 洪滔, 周艳芬
【申请人】福建农林大学