在低磷环境下促进千年桐生长和光合作用增强的内生真菌的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株在低磷环境下促进千年桐生长和光合作用增强的内生真菌。
【背景技术】 植物内生菌的研宄始于19世纪末，Vogl从黑麦草Lolium temulentum L?种子中分离 出第一株内生菌。但真正开始大量研宄植株中的内生菌起始于上世纪八十年代，主要是在 温带地区、亚热带地区和热带地区的植被中开展研宄。 植物内生真菌的分布广、种类多，前人研宄表明从绝大多数植物体内都能分离得到内 生真菌，由此可见内生真菌普遍存在于植物体内。在全世界范围内至少在80多个属290多 种的禾本科农作物中发现了内生菌。目前从植物中分离的内生菌根据其具有的独特功能可 以分为：固氮菌、固钾菌、固磷菌等植物促生菌、具有抗病虫害的生防菌和具有促进植物对 不良环境的修复能力的抗性菌。 目前，有关内生真菌对千年桐生长的影响研宄还存在空白。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一株在低磷环境下促进千年桐生长和光合作用增强的内生真 菌。
[0002] 该真菌为青霉属577. )SJ4,已于2015年1月30日在中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保 藏号为CGMCCNo. 10466。 该菌的分离、纯化包括： A、 材料：将采集得到不同年份的根、枝茎、叶分成三个部分，用自来水清洗干净，分装到 自封袋内，于4°C冰箱保存； B、 消毒：75%酒精漂洗30s-无菌水冲洗3-4次一15%的次氯酸钠漂洗(根7min，茎 5min，叶3min)-无菌水冲洗4-5次。当样品最后一次浸洗后的水盛于灭菌的小烧杯中，在 平板上划线作为对照，以检验样品的消毒是否彻底，若干天后如有菌落生成，则表明样品表 面消毒不彻底，需继续调整消毒方法； C、 接种部位的选择：叶片：叶尖部、叶中部和叶基部3个处理；枝茎：上中下分为3部 位，其中第3部位为枝茎交接处；根部：分为根尖和根基2个部分； D、 接种：将消毒后的外植体用接种刀切开，铺放在培养基表面，于28°C恒温培养箱内 培养5- 7天后观察菌落生长状况。有的菌株繁殖迅速，可先将其产生的菌株进行分离纯 化；生长缓慢且数量较少的菌株可延长观察时间，直到其生长稳定后纯化； 固体培养：使用改良马丁固体培养基，配方为蛋白胨5.Og/L、酵母浸出粉2.Og/L、 葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0. 5g/L、琼脂14.0g/L、其它为无菌水，pH值 6. 4 ±0. 2,培养温度为28 °C，培养方式为平板培养。
[0003] E、将分离繁殖出的不同种类的内生真菌接入平板培养基进行纯化，经过2-3次点 接纯化、转接后得到单一菌种的上述的功能菌株； 上述的一种在低磷环境下促进千年桐生长和光合作用增强的内生真菌应用菌液的制 备方法，是将上述的菌株接入液体培养基，摇床振荡培养，培养温度为28°C，培养时间48~ 72h，利用血球计数板计算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成1. 0-9. OX 106cfu/ml即为成 品备用；液体培养基：为改良马丁培养基，其中蛋白胨5. Og/L、酵母浸出粉2. Og/L、葡萄糖 20.0 g/L、磷酸氢二钾1. Og/L、硫酸镁0. 5g/L、其它为无菌水、pH值6. 4±0. 2。 上述的一种在低磷环境下促进千年桐生长和光合作用增强的内生真菌应用菌液的应 用方法，是应用该菌株的菌液用于千年桐苗木根际土壤浇施或苗木直接接种。 上述的一种在低磷环境下促进千年桐生长和光合作用增强的内生真菌应用菌液的应 用方法，是用5. 5X 106cfu/ml菌液，按每株100ml在林地饶于每株千年桐的根际。 本发明涉及的菌株是从千年桐植株中分离纯化得到的，经接种于千年桐土培苗，根据 各项指标综合评判，进一步证实其对植株生长具有缓解低磷胁迫促进千年桐生物量增长的 作用，寻找到对促进植株生物量增长的有益的功能内生真菌可应用于生产。
[0004] 通过菌液浇施的方法接种于千年桐幼苗，并在接种15天后进行低磷胁迫试验，在 胁迫15d时、30d时、45d时、60d时进行取样测定植株的苗高、地径以及SPAD值。根据测得的 各项指标综合评判，进一步证实其对植株生长具有缓解低磷胁迫的作用，寻找到对促进植 株生长有益的功能内生真菌可应用于生产。通过接种后植株的低磷胁迫试验，得出菌株的 苗高增长率、地径增长率以及SPAD值均较大程度高于对照，表明其对缓解植株低磷胁迫具 有较大功用，从而进一步证实得到该株内生真菌能促进千年桐在低磷环境下的生长发育。
【附图说明】
[0005] 图1为不同低磷胁迫条件下不同处理对千年桐幼苗苗高的影响。
[0006] 图2为不同低磷胁迫条件下不同处理对千年桐幼苗地径的影响。
[0007] 图3为不同低磷胁迫条件下不同处理对千年桐幼苗SPAD值的影响。
【具体实施方式】
[0008] -、根际土壤浇施与苗木直接接种应用 试验材料为千年桐幼苗为建阳市林业局提供的千年桐一年生苗。本试验采用土培盆栽 试验，选择长势一致的苗木于2014年5月定植于直径15cm，高10cm的塑料盆中。每盆放入 相等质量的3kg黄心土，为了保证后期苗木接菌的准确性，往每盆土壤中滴入10-15滴甲醛 (福尔马林）消毒液，并用塑料薄膜封盖盆口，消毒时间为24h。待土壤内甲醛渗透消毒完 全，除去塑料薄膜，将剩余的甲醛蒸发，以免影响幼苗的移植成活率。将苗木植入，经过一个 月的恢复性生长，在千年桐幼苗根际施入菌株浓度为5. 5 X 106cfu/ml的菌液100ml，连续三 天浇施，用蒸馏水溶液处理作为空白对照。
[0009] 菌液制备：将供试菌株接入50mL的液体培养基，培养基为改良马丁培养基，其中 蛋白胨5. Og/L、酵母浸出粉2. Og/L、葡萄糖20.0 g/L、磷酸氢二钾1. Og/L、硫酸镁0. 5g/L、 其它为无菌水、pH值6. 4±0. 2,在恒温振荡培养箱中经过72h的培养。用无菌生理盐水按 十倍稀释法将菌液稀释，利用血球计数板计算菌液浓度配制成5. 5X 106cfu/mL。
[0010] 二、低磷胁迫试验设计 盆栽试验土壤的基质为黄心土。经测定该土壤中各养分物质见表1。接种15天后进行 低磷胁迫试验处理，这段时间主要是让接种菌株侵入植株。
[0011] 表1基质土壤养分情况 Table 1 Nutrient content of basic soil 单位：mg/g
【主权项】
1. 一株在低磷环境下促进千年桐生长和光合作用增强的内生真菌，其特征在于：该真 菌为青霉属5/7. )SJ4,已于2015年1月30日在中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心登记保藏，保藏号为CGMCCNo. 10466。
2. -种如权利要求1所述的一株在低磷环境下促进千年桐生长和光合作用增强的内 生真菌的应用菌液，其特征在于：所述应用菌液的制备方法，将所述的青霉属 sa )SJ4菌株接入液体培养基，摇床振荡培养，培养温度为28°C，培养时间48~72h，利用血 球计数板计算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成1.0-9.OX106cfu/ml，备用；液体培养基： 为改良马丁培养基，其中蛋白胨5. Og/L、酵母浸出粉2. Og/L、葡萄糖20.0 g/L、磷酸氢二钾 I. 〇g/L、硫酸镁0. 5g/L、其它为无菌水、pH值6. 4±0. 2。
3. -种如权利要求2所述的应用菌液的用途，其特征在于：所述应用菌液用于千年桐 苗木根际土壤浇施或苗木直接接种。
【专利摘要】本发明涉及一株在低磷环境下促进千年桐生长和光合作用增强的内生真菌。所述内生真菌为青霉属（Penicillium sp.）SJ4，已于2015年1月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏号为CGMCC No. 10466。将千年桐内生真菌SJ4接种于千年桐土培苗，通过接种后植株的低磷胁迫试验，得出菌株的苗高增长率、地径增长率以及SPAD值均较大程度高于对照，表明其对缓解植株低磷胁迫具有较大功用，从而进一步证实得到该株内生真菌能促进千年桐在低磷环境下的生长发育。CGMCC No.1046620150130
【IPC分类】A01G7-06, A01N63-04, C12N1-14, A01P21-00
【公开号】CN104789481
【申请号】CN201510174462
【发明人】洪陈洁, 林晗, 谢安强, 洪滔, 吴承祯, 洪伟
【申请人】福建农林大学
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年4月14日