核酸分析方法和设备的制造方法
【专利摘要】描述检测样品中靶核酸的方法。第一探针附着于第一珠，并将第一珠置于样品中，从而任何靶核酸附着于所述第一探针。第二探针也附着于靶核酸，从而任何靶核酸连接(link)或“连接(tether)”第一和第二探针。电容传感器检测所述珠的电容并处理电容数据以定量样品中存在的靶核酸。第二探针可固定于传感器表面。或者，向样品引入第二珠，所述第二珠具有附着的第二探针，第一珠连接第二珠的程度指示靶NA存在的程度。
【专利说明】核酸分析方法和设备
[0001]引言
[0002]本发明涉及用于分析微生物学实体如样品中核酸的方法和设备。
[0003]用于核酸(NA)如DNA和RNA的实时诊断学已讨论多年，但实际的应用的和功能性系统匮乏。大部分现有系统是基于实验室的且涉及用酶和化学或荧光标记物的NA修饰。这需要熟练的实验室技术员和笨重昂贵的基本单元如激光光学探测器。尽管这类系统声称高敏感性(如检测〈100靶DNA)，但实践中其需要扩增反应(如qPCR)，其中靶在可靠检测前复制多至十亿倍。每次测试一个以上分析物需要多个平行测试或在一个反应中的组合(多重)，进一步增加化学过程的复杂性。不同靶之间的扩增偏倚就多重分析而言是严重问题，因为各基因的PCR效率可变化多至?30%。扩增步骤需要纯模板，因为任何共提取的抑制剂如腐殖酸可导致假阴性，而相反，交叉污染能导致假阳性。扩增步骤涉及复杂的化学，长的酶孵育时间或热循环。样品纯化和扩增都要求将栗、阀门、滤器、加热器、冷却器或Peltier装置整合到微流体装置和/或基本单元中。微流体装置中无气泡形成的热循环是具体问题。扩增所用酶通常导致表面吸附相关问题，引起控制反应中有效酶浓度的问题;限制能用于微流体的材料类型;和一些情况下使表面处理成为必需。复杂的化学需要复杂的技术，使这类系统难以用于远场位置。
[0004]US2006/0205093(Philips)描述使用带微生物学实体的颗粒和向结合施加机械压力，从而一些结合被破坏而另一些没有。
[0005]本发明提供直接、稳健、具有序列特异性和快速而没有复杂化学和扩增步骤的DNA或RNA检测。多重检测和定量也高度可取。
【发明内容】
[0006]根据本发明，提供检测样品中靶微生物学实体的方法，所述方法包括步骤:
[0007]提供附着第一珠的第一探针；
[0008]将所述第一珠置于样品中，从而任何靶微生物学实体附着所述第一探针；
[0009]提供第二探针，其也附着所述靶微生物学实体，从而任何所述靶微生物学实体连接所述第一和第二探针;和
[0010]检测所述珠的电容并处理电容数据以定量样品中存在的靶微生物学实体。
[0011]在一个实施方式中，所述第二探针固定化于传感器表面上。在一个实施方式中，所述第二探针是固定的表面上的自组装单层。
[0012]在一个实施方式中，所述第二探针是珠上的自组装单层。
[0013]在一个实施方式中，所述单层是有中性电荷的PNA单层。
[0014]在一个实施方式中，所述传感器包含有平板式传感器表面的TSV芯片，且所述样品沉积于所述顶面上。
[0015]在一个实施方式中，将第二珠引入样品，所述第二珠具有附着的第二探针，第一珠连接第二珠的程度指示靶微生物学实体存在的程度。在一个实施方式中，所述样品集中在传感器上。
[0016]在一个实施方式中，至少一些珠是有磁性的或顺磁性的。在一个实施方式中，第一珠是有磁性的或顺磁性的，施加磁场引起所述第一珠担当传送第二珠的转运珠，所述第二珠通过靶微生物学实体连接第一珠。
[0017]在一个实施方式中，第一与第二珠连接的程度由传感器定量，其中校准所述传感器以根据珠的介电性能来定量珠的量。在一个实施方式中，处理仅存在第一珠的样品相较于同时存在第一和第二珠的样品的电容差异以提供靶微生物学实体存在的量度。
[0018]在一个实施方式中，所述传感器具有分析物通道和阴性通道，校准传感器，从而如果分析物中不存在靶微生物学实体，则两个通道中都检测到相同电容。在一个实施方式中，所述微生物学实体是核酸且校准用于单碱基差异。
[0019]在一个实施方式中，所述传感器表面支持固定化的第二探针且其中向样品引入第二珠，所述第二珠具有附着的第二探针。在一个实施方式中，所述第二珠的尺寸范围是0.5μm-5ym，优选 1.0μηι-3.Ομπι。
[0020]在一个实施方式中，所述珠是有磁性的且对分析物进行磁力搅拌。在一个实施方式中，引入珠，从而连接发生的程度与靶微生物学实体的量成比例，从一个位置拉到另一位置的第二珠数目与靶微生物学实体的量成比例，且传感器检测第二珠数目以指示靶微生物学实体的程度。
[0021]在一个实施方式中，所述方法包括磁性移出连接的第一和第二珠的步骤，从而分离未连接的第二珠，且传感器检测第二珠数目，指示靶微生物学实体的量。
[0022]在一个实施方式中，至少一些珠是有磁性的，施加磁场以进行珠的磁分离。在一个实施方式中，所述磁场移动。
[0023]在一个实施方式中，所述微生物学实体是核酸且多种靶核酸或基因座被靶向，其中:
[0024]a.对于基因或基因座Α、Β和C:1a+1b+1c=X3信号
[0025]b.对于基因或基因座A和B:2a+2b = X2信号。
[0026]在一个实施方式中，所述方法不区分多种基因如A、B和C并假定各自赋予关于感兴趣问题的等同信息。在一个实施方式中，A、B和C是SNP，其都视作在为相关性状如奶生产而育种的动物中是同样可取的，校准传感器响应以指示动物是否可能具有特定特性，如可能产生优质的产奶量。
[0027]在一个实施方式中，基因组合代表易导致特定遗传病的已知突变。
[0028]在一个实施方式中，所述微生物学实体是核酸并且反义链也被靶向，从而非互补性正向探针(Fl和F2)在同一基因的有义和反义链上，而非不同基因，靶向略有不同的基因座。有义和反义链都从裂解物中捕获并运往下游。
[0029]在一个实施方式中，所述有义和反义链彼此不相互作用且无法改造(reform)，与R基因座互补的固定化的针对有义链的探针(Rfc)和针对反义链的探针(Rrc)都存在但物理上隔离，从而探针彼此不结合。在一个实施方式中，每个探针处于不同位置，携带有义链的第一珠在一个位置结合而携带反义链的那些在另一位置结合。在一个实施方式中，非互补反向探针(Rl和R2)中覆盖的两类珠与更大的珠和NA—起孵育，捕获并转运到传感器芯片上，释放，搅拌并结合多个电容传感器(21、22)中每一个上面的正确SAM。在一个实施方式中，通过比较结合的有义链珠(有义链DNA和mRNA)数目与结合的反义链珠(仅反义链DNA)数目确定基因表达水平。
[0030]在一个实施方式中，序列特异性F基因座用于第一珠连接裂解物中NA，并且使用多个第二珠R基因座(R1、R2、R3)。
[0031]在一个实施方式中，靶向多种靶核酸或基因座(F1、F2、F3)且第二珠R基因座(R^fc、R3)结合各NA中的每一个。
[0032]在一个实施方式中，选择R基因座以提供除第一珠所赋予的特异性外的额外的序列特异性，但主要扩增第一珠所捕获各核酸的信号。
[0033]在一个实施方式中，所述RlR^R3基因座通过磁分离不同尺寸的第二珠而在下游彼此区分。
[0034]在一个实施方式中，所述RlR^R3基因座用不同传感器(10、11)上的不同固定化的第二探针在下游彼此区分。
[0035]在一个实施方式中，进行所述方法以检测截短的DNA或特别是RNA产物，该情况下产生(cause)终止密码子的细胞中的突变或引起移码的插入/缺失事件导致mRNA转录物截短和蛋白质的正确翻译失败。
[0036]在一个实施方式中，至少一些珠适合于在传感器上退行，所述退行通过加热到所述珠的至少一些变成整体的程度进行。
[0037]在一个实施方式中:
[0038]第二珠在水性溶液中稳定，但当移入传感器上的溶液中时分解，和/或
[0039]第二珠含有改变溶液电容的成分(如盐)，和/或
[0040]第二珠分解释放颗粒的细碎片(如铁氧体)，其立即增加电容传感器表面上的电容变化。
[0041]在一个实施方式中，所述微生物学实体包括NA，且其中通过薄蜡层包被第二珠实现将第二珠与第一珠和NA复合体分离，所述薄蜡层上包被链霉亲和素，加热以熔化蜡从而破坏R珠上的链霉亲和素结合下面的顺磁性珠，使得第二珠的核心分离。
[0042]在一个实施方式中，所述微生物学实体包括NA，且其中与第二珠上的那些互补的PNA探针用于分离第二珠与第一珠。
[0043]在一个实施方式中，所述分离在大致室温进行。
[0044]在一个实施方式中，当第二珠在传感器上时，所述分析物含有互补PNA探针且这些探针由于优先的PNA-PNA结合而取代靶核酸，并释放所述核酸。
[0045]在一个实施方式中，具有结合的不同NA的第一珠带有(pickup)多个第二珠，第二珠熔化以与第一珠分离且其自由地与具有多个固定化的探针的传感器阵列混合。
[0046]在一个实施方式中，第二珠覆盖有PNA探针，并粘附于固定化的探针。
[0047]在一个实施方式中，所述固定化的探针是交替的如逐行交替，以确保各第二珠结合固定化的探针的机会均等。
[0048]在一个实施方式中，有多个不同靶待同时检测。
[0049]在一个实施方式中，PNA探针允许珠在细胞裂解期间通过核酸连接较大珠。
[0050]另一方面，本发明提供检测装置，包括:
[0051 ]用于提供附着第一珠的第一探针的工具(means);
[0052]用于将所述第一珠置于样品中的工具，从而任何靶微生物学实体附着所述第一探针；
[0053]用于提供第二探针的工具，所述第二探针也附着所述靶微生物学实体的，从而任何所述靶微生物学实体连接所述第一和第二探针;和
[0054]电容传感器，用于检测所述分析物电容和处理电容数据以定量分析物中的靶微生物学实体存在。
[0055]发明详述
[0056]图1显示允许R珠(“报告珠”)用靶DNA附着T珠(“转运珠”)的序列；
[0057]图2a显示有R珠的T珠上的单一 NA;
[0058]图2b显示连接的单一 T和R珠；
[0059]图2c显示有R珠的T珠上的多重NA;
[0060]图2d显示连接的多重T和R珠；
[0061 ] 图3a、3b、4a、4b和5-10是显示分析方法的系列图；
[0062]图11显示连接不同SAM的R珠的定量多重试验，所述SAM位于CMOS电容芯片上的传感器上;和
[0063]图12和13显示传感器和靶向有义及反义链的机制。
[0064]本发明提供加工样品的方法和设备，从而使靶核酸(通常是DNA)以简单快速方式可鉴定和量化，而不需扩增。通过同一 NA上两个不同位置处两种探针结合的夹心法来提供特异性。这开拓了现有的用于PCR和实时PCR的测定，其具有序列特异性正向和反向引物。一个示例是EURL “马-DNA”(家马(Equus cabal Ius))测试方案(2013年2月)。这鉴定用于检测87碱基对靶线粒体DNA序列(图1)的特异探针序列以及正向和反向引物。这些探针序列精心设计成物种特异性。这些相同位点由我们的2种探针靶向。
[0065]生物素化的第一探针附着链霉亲和素包被的2.8μηι转运或“T珠”，例如根据Homes(US5512439)(描述从裂解物中取出靶单链DNA或RNA，这是通过使其与连接磁珠的互补寡核苷酸DNA探针杂交进行的)。然而，在本发明中，使用PNA探针取代DNA探针。第二探针结合第二、更小的(1.Ομπι)顺磁性报告珠(“R珠”)。将附有NA的T珠引入含去离子水和R珠的容器。由于R珠在溶液中，这提高与任何靶NA的会遇率。R珠是顺磁性的，因而混合进一步通过外磁铁用搅拌来改善，例如同轴电机电磁铁的圆周运动，如Apex 18x 14x 20mm。这些R珠附着对应NA。2种探针跨同一NA结合可导致T珠和R珠连接(图1、2a、2b)。多个更小的R珠可通过对应数目的靶NA连接同一 T珠(图2b)。为提高检测灵敏度，此试验还能就阴性(无DNA)和阳性(家马(E.cabalIus)mtDNA)样品平行完成(图3-10)。
[0066]孵育5分钟后，所有T和R珠通过强磁铁拉到容器底部。这花费约I分钟。随后在容器(图5中的2)顶部引入塑料包被的倒漏斗尖头I，其内部有小磁铁，如图5所示，持续2分钟。这吸引较大的T珠，而不是未结合的R珠ο绕管移动的同轴磁体搅拌并建立磁梯度。完成此磁分离，因为同一液体介质中分别为2.8μηι和1.Ομπι的顺磁性的T和R珠暴露于相同磁场和相同磁化率，经受的磁矩与其半径立方成比例，但经受的拖曳力与其半径成正比。T珠和R珠向其拖曳增加的终端速度加速到达零加速的点。T珠将会持续具有快许多的终端速度。给予相同磁场给定时间，R珠从一个点到另一个需要长许多的时间。
[0067]T珠和连接其的任何结合的R珠在尖端I聚集并取出。实验证据表明破坏DNA-DNA碱基对键需要大于500pN的力。就PNA-DNA而言，所述数字更高。因此，较小的R珠易由较大T珠拖曳。此连接仅当靶NA存在时可发生，因而连接的R珠数目指示存在的靶NA数目。
[0068]所述珠数目能以多种方式测定，例如通过Girvin等在US5684585公开的使珠通过毛细管光学粒子计数器，或通过W Q YanguHardware design of electrical capacitancetomography systems” ,Measurement Science Technology Vol 7 1996所述的电容层析成像。
[0069]在此实施方式中，将T珠和R珠置于DI水的大液滴3上，其在CMOS电容传感器IC 4顶部(图6和7)。
[0070]IC 4用直通硅晶穿孔技术(TSV)形成，如US8513061所述。这些蚀刻自硅片背面，随后用铜回填。这带来IC 4后面的所有输入-输出连接，排除键合线和表面形貌学，极大促进液滴和珠应用和移动到传感器的表面。如图6-10所示，有用于接受样品的光滑的平面上表面。
[0071]还显示试验的阳性和阴性形式。液滴通过芯片上或芯片下的加热器加热到R珠探针和NA复合体的熔化温度(如60°C)。这释放R珠。即刻在传感器周围引入圆形磁体，其将T珠推离到传感器外周并随着液滴开始蒸发而将其固定(图7-8)，但使得未结合的R珠陷入传感器上的液滴。液滴现在仅包含R珠。小磁体目前在传感器下面应用，其使R珠集中在传感器上液滴底部。大部分R珠具有相对于DI水3的较低的介电常数，提供与初始样品中靶NA量成正比的极清晰信号。如果分析物中有马DNA，这能通过分析物、阳性和阴性传感器的电容对比变化来检测。
[0072]此过程需要约1-2分钟。3-4分钟后，液滴完全蒸发(图10)。所述珠具有比空气更高的介电常数，对于各分析物、阳性和阴性传感器产生不同电容读数。这些“湿”和“干”电容读数产生用于更佳特异性和灵敏度的交叉检查相关性。另一变化形式中，所述珠能由在约55°(:熔化的蜂蜡形成，当加热IC时释放溶质如盐。这改变液滴的介电常数，进一步提高灵敏度。
[0073]或者，R珠可为非磁性的，如硅石颗粒、大蛋白质分子或复合材料。后者的示例是蜂蜡退行性珠，其变形和/或熔化(如在55°C)以产生沿着传感器表面具有低介电常数的有机区域，或释放溶质如盐。这改变液体的介电常数，进一步帮助电容检测报告珠。
[0074]以下描述本发明的多重实施方式。这遵循与单一试验极类似的原则，但区别在于多种NA通过多个探针结合同一 T珠(图2c、2d并与图2a、2b对比)。根据T珠上捕获的NA类型和数目，从R珠混合物捕获数量成正比的互补R珠。如图11所示，有带十六个感应区域11的TSVCMOS传感器10。然后，R珠混合物在传感器10上转运，在该处其与T珠分开并在传感器表面自由混合。这采用多个传感器11表面上形成的自组装单层(SAM)，其中各SAM具有包埋于或连接传感器表面的序列特异性探针，所述探针与各游离R珠上的探针互补。R珠若存在，则结合于正确的传感器表面(图11)。因此，各传感器的电容变化与捕获的各R珠类型数量以及初始样品中的NA数量成比例(图2c、2d、ll)。
[0075]通过对样品裂解物进行靶富集来制备样品，HomeS(US5512439)。此裂解步骤在分开的介观流控或微流控容器中发生。根据在裂解物中的相对比例，四个独特的生物素化PNA探针捕获四种不同嫩(1^、1^、1^、1^)。？嫩探针之一靶向3(^21基因上游的高保守非编码区。这用作试验的阳性对照。另外三个PNA探针靶向在群体中已知变化的基因座。所述NA由PNA探针通过沃森-克里克结合捕获，其进而结合链霉亲和素包被的顺磁性T珠。顺磁性T珠在合适的接受器(根据容器可手动移动并啮合各容器)中磁性浓缩。T珠由磁力拉入孵育容器。孵育容器包含顺磁性珠-较小的1.Ομ?? ‘报告’珠-“R珠”(图2c)。R珠分成四个等同部分(Ra、Rb、Re、Rd)，各包被于第二PNA探针，所述探针与NA LA、LB、Lc和LD上的各下游位点互补。T珠上的NA会捕获互补R珠。各T珠能捕获超过一种R珠。
[0076]顺磁性珠用磁体拉到容器基底。现在移出该磁体并使用另一磁体。
[0077]顺磁性T珠和结合的R珠进行磁性浓缩并取出。所述接受器手动移动并啮合另一容器。此容器产生CMOS传感器表面。顺磁性珠用磁体向下拉到容器基底。加热容器以破坏一个或多个能连接T和R珠的探针。各类R珠现在未结合。现在移出该磁体并使用另一磁体。T珠与R珠分开，在接受器中捕获并从容器中取出。剩余的R珠进行磁力搅拌以提供CMOS传感器表面上的混合。如上所示，CMOS传感器10包含四个单独传感器区11，各用与四种珠类型各自互补的探针覆盖于四个独特SAM中。所述珠在正确SAM表面上结合。各SAM上结合的珠数目与裂解物中的初始NA量成比例。相应传感器登记的电容变化与珠数目成正比。对应S0X21基因阳性对照的传感器应该总是包含结合的R珠。结合另三个对应传感器的R珠相对比例提供关于样品遗传变异的定性和定量信息。
[0078]注:所有探针可包含合适间隔子(如PEG)和配体(如生物素)以提供与核酸、SAM、底物(如氮化硅或顺磁性珠或蜡)的良好相互作用。
[0079]R珠去耦合
[0080]完整试验也可以等温完成。这如下完成:容器中的PNA探针溶液与四个基因座(La、Lb、Lc、Ld )相关位置处的T珠PNA探针互补。PNA-PNA结合优于PNA-NA结合。溶液中的PNA探针侵入使NA固定于T珠的PNA-NA双链体，并允许NA和结合的R珠游离。拉开PNA-NA双链体如下促进:在初始PNA探针上具有与NA不互补的突出。这随后松散。新PNA探针与此突出和剩余探针序列互补，结合并更有效地侵入PNA-NA双链体。
[0081 ]定量遗传标记指数
[0082]在另一试验中，有单一传感器而无3舰。基因座靶向(1^;上、1^):
[0083]a.对于存在基因或基因座A、B和C:1a+1b+1c=X3信号
[0084]b.对于基因或基因座A和D:1a+1d = X2信号。
[0085]此技术无法区分A、B、C和D并假定各自赋予关于感兴趣问题的等同信息。例如，A、B、C和D可以是入侵昆虫物种的四个遗传标记，所述物种无法通过眼睛与天然物种区分。存在任何一种这些物种表明有问题。类似地，所述四个基因座可代表易导致遗传病的已知突变。动物中存在一个或多个这些突变可使该动物剔除另一动物(就所有这些突变而言测试为阴性)变得可取。相反，所述四个基因座可以是SNP，其都视作就相关性状如奶生产饲养的在动物中是同样可取的。本申请中产生的上述来自基于电容试验的信号量与可能产生优质产奶量的动物相关。
[0086]采用现有基于扩增的方法如终点PCR或LAMP，不太可能分辨存在一种SNP与两种SNP之间的差异。用不同标记探针的qPCR法至少半定量，但具有之前概括的所有劣势。由于本发明方法直接且定量，处理各SNP或靶序列作为附加物的试验能返回关于农场动物品质的指数。此类信息会帮助畜牧业的协调决策。由于所述技术使用直接定量且仅用采样的组织量(如来自动物耳朵的标准化Imm3组织)产生样品中DNA的基线，可能“计数”多种SNP。存在的两种SNP应产生两倍的信号，等等。
[0087]截短的转录物检测
[0088]在此实施方式中，根据上面的多重试验，四个R珠基因座中的三个都位于一种感兴趣mRNA上。产生终止密码子的细胞中的突变或引起移码的插入/缺失事件引起mRNA转录物截短和蛋白质的正确翻译失败。此类突变在许多形式的癌症中是重要的。关键地，重要癌基因能用此系统靶向并检测导致转录物缩短的新生突变。截短的转录物是遗传性BRCA乳腺癌风险的主要诱发因素。所述三个传感器各自捕获等同数量的R珠时，观察到全转录物。转录物截短时，观察到大部分下游R珠的结合减少。在管家基因如S0X21的表达中提供对照。
[0089]反义链靶向和基因表达
[0090]多重试验的变化性允许靶向有义和反义链。有义链NA包括DNA和更多的mRNA，而反义NA仅包括DNA。非互补正向探针(Fl和F2，图12)在同一基因有义和反义链上，而非不同基因，靶向略有不同的基因座。有义和反义链都在T珠上捕获，非互补反向探针(Rl和R2，图12)覆盖的两类R珠与T珠和NA—起孵育，捕获并转运到传感器芯片20上，释放，搅拌并结合各电容传感器21、22 (图13)上的正确SAM。检测到的反义链特异性R珠可提供样品中DNA量的基线。有义链特异性R珠的数目应更多且反映有义链DNA和mRNA的数量。通过比较有义和反义链的信号，能用此技术获得感兴趣基因的基因表达水平的准确和直接量度。在单一试验中，根据马示例，相同策略会使捕获的R珠数目加倍并提高灵敏度。
[0091 ]裂解容器中的T珠和R珠连接
[0092]在此实施方式中，T和R珠连接在裂解容器中更上游发生，缩短总分析时间。共价结合的PNA探针中包被的R珠在细胞裂解步骤期间加入Che I ex溶液(5-20 % w/v)并用靶NA立即连接到T珠。在后续磁性移出步骤中，仅连接T珠的R珠从裂解容器中移出，从而提供靶核酸的特异性和定量，如上面多个实施方式所述。
[0093]本发明不限于所述实施方式，但可在构建和细节方面变化。所述靶不必定是NA。例如，其可另外是蛋白质、抗原、细菌、病毒或任何其它微生物学实体。
【主权项】
1.一种检测样品中靶微生物学实体的方法，所述方法包括步骤: 提供附着第一珠的第一探针； 将所述第一珠置于样品中，从而任何靶微生物学实体附着所述第一探针； 提供第二探针，其也附着所述靶微生物学实体，从而任何所述靶微生物学实体连接所述第一和第二探针;和 检测所述珠的电容并处理电容数据以定量样品中存在的靶微生物学实体。2.如权利要求1所述的方法，其中所述第二探针固定化于传感器表面上。3.如权利要求2所述的方法，其中所述第二探针是固定的表面上的自组装单层。4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二探针是珠上的自组装单层。5.如权利要求4所述的方法，其中所述单层是有中性电荷的PNA单层。6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述传感器包含有平板式传感器表面的TSV芯片，且所述样品沉积于所述顶面上。7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将第二珠引入样品，所述第二珠具有附着的所述第二探针，且所述第一珠连接所述第二珠的程度指示靶微生物学实体存在的程度。8.如权利要求7所述的方法，其中所述样品集中在传感器上。9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中至少一些珠是有磁性的或顺磁性的。10.如权利要求9所述的方法，其中所述第一珠是有磁性的或顺磁性的，施加磁场引起所述第一珠担当传送第二珠的转运珠，所述第二珠通过靶微生物学实体连接所述第一珠。11.如权利要求7-10中任一项所述的方法，其中所述第一与第二珠连接的程度由传感器定量，其中校准所述传感器以根据珠的介电性能来定量珠的量。12.如权利要求11所述的方法，其中处理仅存在第一珠的样品相较于同时存在第一和第二珠的样品的电容差异以提供靶微生物学实体存在的量度。13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述传感器具有分析物通道和阴性通道，且校准传感器，从而如果分析物中不存在靶微生物学实体，则两个通道中都检测到相同电容。14.如权利要求13所述的方法，其中所述微生物学实体是核酸且所述校准用于单碱基差异。15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述传感器表面支持固定化的第二探针且其中向样品引入第二珠，所述第二珠具有附着的第二探针。16.如权利要求7-15中任一项所述的方法，其中所述第二珠的尺寸范围是0.5μπι-5μπι,优选 1.0wi1-3.0ym。17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述珠是有磁性的且对分析物进行磁力搅拌。18.如权利要求7-16中任一项所述的方法，其中所述珠被引入，从而连接发生的程度与靶微生物学实体的量成比例，从一个位置拉到另一位置的第二珠数目与靶微生物学实体的量成比例，且传感器检测第二珠数目以指示靶微生物学实体的程度。19.如权利要求7-18中任一项所述的方法，包括磁性移出连接的第一和第二珠的步骤，从而分离未连接的第二珠，且传感器检测第二珠数目，指示靶微生物学实体的量。20.如权利要求7-19中任一项所述的方法，其中所述至少一些珠是有磁性的，施加磁场以进行珠的磁分离。21.如权利要求20所述的方法，其中所述磁场移动。22.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微生物学实体是核酸且多种靶核酸或基因座被靶向，其中: c.对于基因或基因座A、B和C:1a+1b+1c= X3信号 d.对于基因或基因座A和B:2a+2b = X2信号。23.如权利要求22所述的方法，其中所述方法不区分多种基因如A、B和C并假定各自赋予关于感兴趣问题的等同信息。24.如权利要求23所述的方法，其中所述A、B和C是SNP，其都视作在为相关性状如奶生产而育种的动物中是同样可取的，校准传感器响应以指示动物是否可能具有特定特性，如可能产生优质的产奶量。25.如权利要求24所述的方法，其中基因组合代表易导致特定遗传病的已知突变。26.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微生物学实体是核酸并且反义链也被靶向，从而非互补性正向探针(Fl和F2)在同一基因有义和反义链上，而非不同基因，靶向略有不同的基因座，有义和反义链都从裂解物中捕获并运往下游。27.如权利要求26所述的方法，其中所述有义和反义链彼此不相互作用且无法改造，与R基因座互补的固定化的针对有义链的探针(Rf。)和针对反义链的探针(Rrc)都存在但物理上隔离，从而探针彼此不结合。28.如权利要求27所述的方法，其中每个探针处于不同位置，携带有义链的第一珠在一个位置结合而携带反义链的那些在另一位置结合。29.如权利要求26-28中任一项所述的方法，其中所述非互补反向探针(Rl和R2)中覆盖的两类珠与更大的珠和NA—起孵育，捕获并转运到传感器芯片上，释放，搅拌并结合多个电容传感器(21、22)中每一个上面的正确SAM。30.如权利要求29所述的方法，其中通过比较结合的有义链珠(有义链DNA和mRNA)数目与结合的反义链珠(仅反义链DNA)数目确定基因表达水平。31.如权利要求7-30中任一项所述的方法，其中序列特异性F基因座用于第一珠连接裂解物中的嫩，并且使用多个第二珠1?基因座(1?1、1?2、1?3)。32.如权利要求7-31中任一项所述的方法，其中靶向所述多种靶核酸或基因座(F1、F2、F3)且第二珠R基因座(R1、R2、R3)结合各NA的每一个。33.如权利要求32所述的方法，其中选择所述R基因座以提供除第一珠所赋予的特异性外的额外的序列特异性，但主要扩增第一珠所捕获各核酸的信号。34.如权利要求32和33所述的方法，其中所述R1、R2和R3基因座通过磁分离不同尺寸的第二珠在下游彼此区分。35.如权利要求32和33所述的方法，其中所述R^RdPR3基因座用不同传感器(10、11)上的不同固定化的第二探针在下游彼此区分。36.如权利要求32-35中任一项所述的方法，其中实施所述方法以检测截短的DNA或特别是RNA产物，该情况下产生终止密码子的细胞中的突变或引起移码的插入/缺失事件导致mRNA转录物截短和蛋白质的正确翻译失败。37.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中至少一些珠适合于在传感器上退行，所述退行通过加热到所述珠的至少一些变成整体的程度进行。38.如权利要求37所述的方法，其中 所述第二珠在水性溶液中稳定，但当移入传感器上的溶液中时分解，和/或 所述第二珠含有改变溶液电容的成分(如盐)，和/或 所述第二珠分解释放颗粒的细碎片(如铁氧体)，其立即增加电容传感器表面上的电容变化。39.如权利要求7-38中任一项所述的方法，其中所述微生物学实体包括NA，且其中通过薄蜡层包被第二珠实现将第二珠与第一珠和NA复合体分离，所述薄蜡层上包被链霉亲和素，加热以熔化蜡从而破坏R珠上的链霉亲和素结合下面的顺磁性珠，使得第二珠的核心分离。40.如权利要求7-39中任一项所述的方法，其中所述微生物学实体包括NA，且其中与第二珠上的那些互补的PNA探针用于分离第二珠与第一珠。41.如权利要求40所述的方法，其中所述分离在大致室温进行。42.如权利要求40或41所述的方法，其中所述第二珠在传感器上时，所述分析物含有互补PNA探针，且这些探针由于优先的PNA-PNA结合而取代靶核酸，并释放所述核酸。43.如权利要求7-42中任一项所述的方法，其中具有结合的不同NA的第一珠带有多个第二珠，第二珠熔化以与第一珠分离且其自由地与具有多个固定化的探针的传感器阵列混入口 ο44.如权利要求43所述的方法，其中所述第二珠覆盖有PNA探针并粘附于所述固定化的探针。45.如权利要求44所述的方法，其中所述固定化的探针是交替的如逐行交替，以确保各第二珠结合固定化的探针的机会均等。46.如权利要求45所述的方法，其中有多个不同靶待同时检测。47.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中PNA探针允许珠在细胞裂解期间通过核酸连接较大珠。48.一种检测设备，包含: 用于提供附着第一珠的第一探针的工具； 用于将所述第一珠置于样品中的工具，从而任何靶微生物学实体附着所述第一探针；用于提供第二探针的工具，所述第二探针也附着所述靶微生物学实体，从而任何所述靶微生物学实体连接所述第一和第二探针;和 电容传感器，用于检测所述分析物电容和处理电容数据以定量分析物中的靶微生物学实体的存在。
【文档编号】C12Q1/68GK105992826SQ201480075478
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2014年12月10日
【发明人】T·卡明斯, B·欧法雷尔
【申请人】阿尔查技术有限公司