一种高产3-甲硫基丙醇的酿酒酵母菌基因工程菌的构建方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种高产3-甲硫基丙醇的酿酒酵母基因工程菌的构建方法与应用， 属于食用香料生物制造领域，制备的天然3-甲硫基丙醇香料可用于多种食用香精调配，广 泛应用于食品、医药、日化等行业。
【背景技术】
[0002] 3-甲硫基丙醇（3-Methylthio-l-propanol)是一种重要的食用香料。3-甲硫基 丙醇是具有低香气阈值的挥发性风味物质，呈现出肉味、煮熟土豆味和蔬菜味，天然存在于 蔬菜、水果、酒类以及多种发酵食品和调味料中，是芝麻香型白酒、红葡萄酒和酱油的重要 风味物质。3-甲硫基丙醇及其衍生物（3-甲硫基丙醛、3-甲硫基丙酸乙酯和3-甲硫基丙 酸甲酯）均为安全的食用香料，广泛应用于肉味香精、果蔬香精以及酒用香精等多种食品 香精的调配。
[0003] 3-甲硫基丙醇的制造主要通过化学方法利用烯丙醇与甲硫醇氧化进行。虽然化 学合成香味物质具有成本低、产量高等优势，但存在着环境污染严重，产生有毒副产物等弊 端。随着人们对健康关注程度的日益增强，食品和化妆品等的生产也越来越倾向于使用天 然香料。利用食品微生物通过生物合成方法制备的香味物质，构型单一，香气品质高，被视 为等同于天然香料，产品容易被消费者接受，并且生产过程产生的污染少，符合"环境友好 型"。因此，利用微生物通过代谢合成香味物质是下一代天然香料生产的重要发展方向。
[0004] 3_甲硫基丙醇的合成在Brevibacterium、Arthrobacterspp.、乳酸菌和酵母菌中 均有报道。研宄表明，利用蛋氨酸生产3-甲硫基丙醇是酿酒酵母菌的共同特征，并且酿酒 酵母也具有多种生理优势（菌体健壮、耐受低pH值等）能够满足工业生产的需要。
[0005] 关于酿酒酵母中3-甲硫基丙醇的合成途径、关键酶及其基因已有一些研宄。酿酒 酵母主要通过艾利希途径利用L-蛋氨酸分解代谢生成3-甲硫基丙醇。L-蛋氨酸首先通过 转氨反应生成4-甲硫基-2-氧代丁酸，然后通过脱羧反应生成3-甲硫基丙醛，最后再通过 还原反应生成3-甲硫基丙醇。研宄表明，转氨反应和脱羧反应是3-甲硫基丙醇合成的关键 反应。艾利希途径中编码转氨酶活性的基因有两个，分别为AR08和AR09,二者编码的转氨 酶Ar〇8p和Ar〇9p都具有广泛的底物催化特性；然而，对于利用蛋氨酸为氮源生成3-甲硫 基丙醇而言，Ar〇8p的催化活性更强。因此，AR08是酿酒酵母中3-甲硫基丙醇合成的关键 的转氨酶基因。艾利希途径中可能编码脱羧酶的基因有多个，包括AR010、THI3、roCl、PDC5 和H)C6。Vuralhan等研宄发现在THI3、PDC1、H)C5和H)C6四个基因失活的情况下，AR010 依然能够提供足够的苯丙酮酸脱酸酶活性；有研宄进一步表明AR010编码的ArolOp在蛋氨 酸代谢过程中能够特异性的作用于2-酮基-4-甲硫基丁酸的脱羧反应。因此，对于3-甲 硫基丙醇的合成，AR010是关键的脱酸酶编码基因。
[0006]综上所述，AR08和AR010是酿酒酵母中3-甲硫基丙醇合成过程中催化关键反应 的关键酶的编码基因，增强二者的表达水平将有利于目的产物3-甲硫基丙醇的合成代谢 流量的增强和产量的提高。
[0007] 本申请专利通过在酿酒酵母中对基因AR08和AR010进行克隆与过量耦合表达，增 强目的产物3-甲硫基丙醇的代谢流量，提高其产量，构建高产3-甲硫基丙醇的酿酒酵母工 程菌；并利用上述工程菌通过蛋氨酸发酵生产天然的3-甲硫丙醇香料。
【发明内容】
[0008] 本发明提供一种高产3-甲硫基丙醇的酿酒酵母基因工程菌的构建方法与应用。 以SaccharomycescerevisiaeS288c为出发菌株，克隆了3-甲硫基丙醇合成代谢艾利希 途径中的转氨酶和脱羧酶编码基因AR08和AR010,并构建了两个基因的过量耦合表达工程 菌810 ;通过增强关键酶基因的表达，工程菌810中3-甲硫基丙醇合成量有显著提高，能够 在以蛋氨酸为氮源的发酵培养基中高效生产天然的3-甲硫基丙醇香料。
[0009] 生物材料保藏相关情况的说明
[0010] 生物材料保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0011] 保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0012] 保藏日期：2014年03月28日
[0013]保藏编号：CGMCCNo. 8971
[0014]分类命名：酿酒酵母Saccharomycescerevisiae810
【附图说明】
[0015] 图1重组质粒载体的构建
[0016] pYES-pgk:大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒载体
[0017] pYES-pgk-AR08 :携带AR08基因的重组质粒载体
[0018] pYES-pgk-AR010 :携带AR010基因的重组质粒载体
[0019] pYES-pgk-AR0810 :携带AR08和AR010基因的重组质粒载体
[0020] 图2酿酒酵母菌株中转氨酶活性检测
[0021]S288c:野生型酿酒酵母菌株
[0022]SCK:转入空质粒载体pYES-pgk的酿酒酵母菌株
[0023] S8 :转入重组质粒载体pYES-pgk_AR08的酿酒酵母菌株
[0024]S10 :转入重组质粒载体pYES-pgk-AP010的酿酒酵母菌株
[0025]S810 :转入重组质粒载体pYES-pgk-AR0810的酿酒酵母菌株
[0026] 图3酿酒酵母菌株中脱羧酶活性检测
[0027]S288c:野生型酿酒酵母菌株
[0028]SCK:转入空质粒载体pYES-pgk的酿酒酵母菌株
[0029] S8 :转入重组质粒载体pYES-pgk_AR08的酿酒酵母菌株
[0030]S10 :转入重组质粒载体pYES-pgk-AR010的酿酒酵母菌株
[0031]S810 :转入重组质粒载体pYES-pgk-AR0810的酿酒酵母菌株
[0032] 图4酿酒酵母菌株中3-甲硫基丙醇的合成
[0033] 一：野生型酿酒酵母菌株S288c
[0034] :转入空质粒载体pYES-pgk的酿酒酵母菌株SCK
[0035] ?:转入重组质粒载体pYES-pgk-AR08的酿酒酵母菌株S8
[0036] ▲:转入重组质粒载体pYES-pgk-AR010的酿酒酵母菌株S10
[0037] ?:转入重组质粒载体pYES-pgk_AR0810的酿酒酵母菌株S810
【具体实施方式】
[0038] 1 ?AR08和AR010基因的克隆
[0039] 1.ISaccharomycescerevisiaeS288c基因组DNA的提取
[0040] 将新鲜活化的S.cerevisiaeS288c菌种接种至YH)液体培养基中，置于摇床中 30°C，220rpm震荡培养过夜。
[0041] (1)取lmL菌液至1. 5mL离心管中，常温12000rpm离心lmin，弃上清；
[0042] (2)向菌体沉淀中加入600yL山梨醇Buffer，加入100mg/mL的蜗牛酶100yL，充 分混勾后置于30°C水浴摇床中220rpm震荡处理90min;
[0043] (3)采用YeastDNAKit(天根生化科技（北京）有限公司）提取酿酒酵母基因组。
[0044] 1.2AR08基因的克隆
[0045] 以SaccharomycescerevisiaeS288c基因组DNA为模板，设计特异性引物，利用 PCR技术扩增AR08基因片段。
[0046]AR08基因引物序列：
[0047]上游引物：5 ' -CGGGATCCATGACTTTACCTGAATC-3 '
[0048]下游引物：5 ' -GCTCTAGACTAITGGAAATACCAAAT-3 '
[0049] PCR反应体系
【主权项】
1. 一株高产3-甲硫基丙醇的重组酿酒酵母菌基因工程菌株的构建方法，其特征为携 带含有转氨酶基因和脱羧酶基因的游离型表达载体。
2. 权利要求1中所述的构建方法运用的新设计思路，即内源转氨酶基因和脱羧酶基因 在酿酒酵母菌中的共表达及其对3-甲硫基丙醇合成量的显著提高作用。
3. 权利要求1中所述的酿酒酵母菌为Saccharomyces cerevisiae S288c，其特征为野 生型菌株含有内源转氨酶基因AR08和脱羧酶基因AROlO。
4. 扩增权利要求3中所述转氨酶基因AR08的特异性引物，分别为： 上游引物：5' -CGGGATCCATGACTTTACCTGAATC-3' 下游引物：5' -GCTCTAGACTAITGGAAATACCAAAT-3'。
5. 扩增权利要求3中所述脱羧酶基因AROlO的特异性引物，分别为： 上游引物：5' -ITCGAGCTCATGGCACCTGTTACAAIT-3' 下游引物：5' -GCTCTAGACTAmTTTAITTCTTTTAAG-3'。
6. 权利要求1中所述的表达载体为pYES-pgk-AR0810,其特征为携带有酿酒酵母菌转 氨酶基因AR08和脱羧酶基因AR010,上述两个基因都携带独立的启动子P pgkl和转录终止子 为Tctqtt，该质粒还包含以下元件：酿酒酵母菌高拷贝质粒复制子2 y、大肠杆菌质粒复制子 pUCl、氨苄青霉素抗性基因Amp、G418和卡那霉素抗性基因G418。
【专利摘要】本发明涉及一种重组酿酒酵母菌工程菌株及其制备方法，该酿酒酵母菌工程菌株携带有串联的转氨酶基因和脱羧酶酶基因的表达载体。该工程菌株的制备方法包括如下步骤：1)通过PCR的方法分别从酿酒酵母菌基因组中扩增过转氨酶基因和脱羧酶酶基因片段；2)设计特定的限制性酶切位点，串联构建到大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒载体pYES-pgk上；3)通过PEG/LiAc法将重组质粒转化到酿酒酵母菌中。通过本发明制备的重组酿酒酵母菌工程菌株能显著提高香味物质3-甲硫基丙醇的合成量，能应用于食品、医药和日化等工业中。CGMCC No.897120140328
【IPC分类】C12R1-865, C12N15-11, C12N1-19, C12N15-81
【公开号】CN104745491
【申请号】CN201410431635
【发明人】尹胜, 王成涛, 孙宝国
【申请人】北京工商大学
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2014年8月29日