CR仪进行反应，反应条件为：94°C2分钟，循环1次；94°C15 秒，55°C1分钟，68°C3分钟，共35个循环；68°C1分钟，循环1次。
[0055] 将PCR产物回收并纯化，目的片段约2. 8kb，回收后产物连接pEASY-Blunt载体并 转化T0P10感受态细胞，菌落PCR鉴定阳性克隆并进行测序，测序正确的克隆提取质粒以备 后续实验使用。
[0056] 二、致突变5'UTR-HPURA3A40-3'UTR片段转化ATCC26012,筛选尿嘧啶营养缺陷型 汉逊酵母菌株（DL-l.ura3_)菌株。
[0057] 1、致突变片段转化汉逊酵母ATCC26012(DL-1)菌株
[0058]参考FaberKN，HaimaP，HarderW，etal?High1y_efficient electro-transformationoftheyeastHansenulapolymorpha[J].Currentgenetics， 1994, 25 (4) :305-310中的电转化方法进行感受态细胞制备和电转条件设置。
[0059] 感受态细胞制备：挑单克隆于10ml非选择性YH)培养基中37°C培养过夜。取2ml 培养物，接种至含lOOmlYH)培养基的摇瓶，37°C培养至0D600 = 1. 3-1. 5。4°C，3000g离心 10min收集细胞，用0. 2倍体积预冷的50mM磷酸盐缓冲液悬浮细胞，37°C孵育15min。如上 离心，用1倍体积预冷的STM缓冲液悬浮清洗细胞。如上离心，用0. 5倍体积的预冷的STM 缓冲液悬浮清洗细胞。如上离心，用0. 005倍体积的预冷的STM缓冲液悬浮细胞，至终体积 约 0. 4ml。
[0060] 电转化条件设置：取100ul上述细胞与10-20ug线性化DNA混合，转入预冷的2mm 电转杯中。同时设置阴性对照组：只取l〇〇ul上述细胞转入预冷的2mm电转杯中。在冰上 放置5min。设置电极参数：1.51^，50沾，150〇，进行电转。电转后立即加入11111预冷的￥?0 至电转杯中，将悬浮液转移至灭菌离心管中。于37°C培养箱中静置培养lh。取菌悬液涂布 含lg/L5-F0A，105yg/mlUra的MD平板，置于37°C恒温培养箱培养3-5天，筛选转化子。
[0061] 2.筛选转化子中的尿嘧啶营养缺陷型菌株（DL-l.ura3_)
[0062] 挑取在步骤5中生长的转化子，分别在MD+Ura(105yg/ml)和MD固体培养基平板 上划线，置于37°C恒温培养箱培养1-2天进行表型鉴定结果，挑取在MD+Ura(105yg/ml) 平板上生长，而在MD平板上不生长的菌株，分别转入MD+Ura(105yg/ml)和MD液体培养基 中，37°C，220rpm培养过夜。结果表明菌株在含有Ura的培养基中能顺利生长啊，而在未添 加Ura的MD培养基中不上长，证明该菌株为尿嘧啶营养缺陷，命名该菌株为DL-1.ura3-。
[0063] 3.尿嘧啶营养缺陷型菌株（DL-1.ura3_)的分子鉴定
[0064]引物 9 :5 '-CCTGTCGTAGTCGAGTCACTTAGTTA-3'
[0065]引物 10:5 ' -TAGATGAAGAACAGTTGGAGAAAAC-3 '
[0066]引物11 :5' -GACCTTCAACAATTCCTGCGCCAGTCACTCC-3'
[0067] 以上述尿嘧啶营养缺陷型菌株（DL-l.ura3_)基因组DNA为模板，用引物9和引物 10进行PCR反应，具体反应条件为：50y1反应体系，包含1y1的KOD-Plus聚合酶，5y1 10XBuffer，5y1dNTP，2y1 25mMMgS04,1. 5y1 引物 1，1. 5y1 引物 2,1y1 模板，33y1 ddH20。用Bio-Rad的PCR仪进行反应，反应条件为：94°C2分钟，循环1次；94°C15秒， 55°C1分钟，68°C1. 5分钟，共35个循环；68°C1分钟，循环1次。如图2左所示，突变体菌 株能够扩增出~1. 5kb左右的目的片段，野生型对照菌株未扩出。而用引物10和引物11 进行PCR反应，反应体系及条件同上，如图2左所示，野生型菌株扩出相应片段，突变体菌株 未能扩出。结果表明突变体中的URA3基因表达框确实被破坏。
[0068] 4.尿嘧啶营养缺陷型菌株（DL-1.ura3_)互补表型验证
[0069] 引物12:同引物1
[0070] 引物13:同引物2
[0071] 以汉逊酵母（HansenulaPolymorpha)ATCC26012的总基因组DNA为模板，用引物 1和引物2进行PCR反应，具体反应条件为：50y1反应体系，包含1y1的KOD-Plus聚合 酶，5y1 10XBuffer，5y1dNTP，2y1 25mMMgS04,1. 5y1 引物 1，1. 5y1 引物 2,1y1 基 因组模板，33y1ddH20。用Bio-Rad的PCR仪进行反应，反应条件为：94°C2分钟，循环1 次；94°C15秒，55°C1分钟，68°C3分钟，共35个循环；68°C1分钟，循环1次。将PCR产物 回收并纯化，直接电转尿嘧啶营养缺陷型菌株〇)L-l.ura3_)，并涂MD平板，37°C，倒置培养 3~5天，具体汉逊制备酵母感受态制备方法和电转方法同上。挑选能够在MD平板上生长 的阳性克隆，该结果表明汉逊酵母URA30RF能够互补突变体表型，该突变体确实为尿嘧啶 营养缺陷型菌株。
[0072] 三、鉴定尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母菌株（DL-l.ura3_)遗传稳定性、生物量测定 及互补鉴定
[0073] 1、尿喃啶营养缺陷型汉逊酵母菌株（DL-1.ura3_)遗传稳定性验证
[0074] 用接种环将尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母菌株（DL-l.ura3_)在MD+5F0A(lg/ L)+Ura(105mg/L)平板上划线，挑取单克隆菌接种于MD+Ura(105mg/L)液体培养基中， 37°〇，220印111，震荡培养16小时左右，此后依次将每天按10%体积比，将菌种传代，供传代 转接6次以上。最后将MD+Ura(105mg/L)培养基置换为MD培养基后，37°C，220rpm，饥饿培 养4小时以上，然后吸取1y1菌液，分别点板于MD和MD+Ura(105mg/L)固体培养基平板， 于37°C倒置培养1~2天。如图3所示，经过多次传代之后，单菌落能在MD+Ura(105mg/L) 平板上生长，而在没有添加Ura的MD平板上不能生长，并且没有发生回复突变现象，证明本 发明构建的尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母菌株（DL-l.ura3_)遗传特性稳定。
[0075] 2、尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母菌株（DL-l.ura3_)生物量测定
[0076] 用接种环分别将野生型汉逊酵母（DL-1)和尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母菌株 (DL-1.ura3_)在YPD(+105mg/LUra)固体平板上划线，于37°C倒置培养1~2天。分别挑 取单克隆接种到10mlYPD(+105mg/LUra)液体培养基中，37°C，220rpm，震荡培养16小时左 右。再按10%的接种量转接到l〇〇mlYPD(+105mg/LUra)液体培养基中，于37°C，220rpm， 震荡培养。每隔2小时取样，测0D600值，虽然在起始阶段，突变体生长稍微慢于野生型，也 许是需要适应培养基，但到生长后期，野生型0D600为17. 728,突变体0D600为17. 928,详 细测量数据见表1。证明尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母菌株0)L-1.ura3_)与野生型菌株在生 物量上无明显差异，生长比较稳定。
[0077]表1:生物量测定
【主权项】
1. 一种汉逊酵母突变体为乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因（URA3)被阻断表达的突变体 稳定菌株。
2. 根据权利要求1所述的汉逊酵母突变体，其特征在于：所述突变体稳定菌株为尿嘧 啶营养缺陷型菌株（DL-1. ura3_)。
3. -种构建权利要求2所述汉逊酵母突变体的方法，包括以下步骤： 1) 构建用于致突变5' UTR-HPURA3 A40-3' UTR的基因片段； 2) 将步骤1)中的基因片段转化入野生型汉逊酵母中，利用5-F0A筛选尿嘧啶营养缺陷 型菌株（DL-1. ura3_)。
4. 根据权利要求2或3所述方法，其特征在于所述野生型汉逊酵母菌株为ATCC26012。
5. -种重组表达载体，是含有酿酒酵母URA3表达框、G418表达框、汉逊酵母自主复制 序列（ARS)、原核细胞自主复制序列（ori)、甲醇氧化酶基因启动子、转录终止子序列。
6. 根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体具有正反向 筛选标记，既具有G418表达框，同时具有酿酒酵母URA3表达框。
7. 根据权利要求5或6所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为 pMOXUR(S. OKARSlo
8. -种表达重组乙肝表面抗原的表达载体，其特征在于：所述乙肝表面抗原核苷酸序 列是编码氨基酸序列为SEQ ID No :1的序列。
9. 根据权利要求8所述的重组乙肝表面抗原的表达载体，其特征在于：所述乙肝表面 抗原核苷酸序列是为SEQ ID No :2的DNA序列。
10. -种生产重组乙肝表面抗原的汉逊酵母菌，是利用权利要求5-9所述的重组表达 载体导入权利要求2-4所述的尿嘧啶营养缺陷型菌株（DL-l.ura3_)菌株。
11. 根据权利要求1-10所述汉逊酵母突变体和重组表达载体在生产外源蛋白方面的 应用。
12. 根据权利要求11所述的应用，其特征在于：所述外源蛋白为重组乙肝表面抗原。
13. -种分离纯化汉逊酵母表达重组乙肝表面抗原的方法。
14. 根据权利要求13所述方法，其特征在于：具体步骤包括菌体破菌、澄清、硅胶吸附、 离子交换、超滤浓缩和分子筛层析步骤。
【专利摘要】本发明公开了一种汉逊酵母突变体及其表达载体在重组蛋白表达方面的应用，其目的是提供一种遗传较稳定的汉逊酵母突变体，及其专属的表达载体在重组蛋白表达方面的应用。本发明所提供的汉逊酵母为乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(UPA3)被阻断表达的突变体稳定菌株，其专属表达载体含有汉逊酵母自主复制序列及多种筛选标记，能够以高拷贝数稳定整合到菌株当中。本发明的突变体菌株及表达载体能够高效表达重组乙肝表面抗原，且能正确组装成VLP，工艺简单，非常适合于工业化生产表达蛋白，具有较大的实际应用价值。
【IPC分类】C07K1-36, C07K1-18, C07K1-34, C12P21-02, C12N15-81, C12R1-85, C12N1-19
【公开号】CN104745492
【申请号】CN201510190967
【发明人】李建强, 任苏林, 徐晓威, 葛君, 周童, 陈晓晓, 孙莹, 孙洪林, 黄红颖, 顾月
【申请人】江苏赛锘威生物医药有限公司
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年4月21日