一株能够高产脂的卷枝毛霉及应用
【专利说明】一株能够高产脂的卷枝毛霉及应用 【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域，更具体地，本发明涉及一株卷枝毛霉及其用途，特别 是一株能够高产脂肪酸的卷枝毛霉及其生产油脂的发酵培养方法。 【【背景技术】】
[0002] 微生物油脂又称单细胞油脂，是指微生物在一定条件下（如某种营养物质受限 制，如氮源限制）积累的油脂。油脂含量大于20%生物量的微生物则称作产油微生物。
[0003] 利用微生物生产油脂的研宄最早可追溯到第一次世界大战期间，当时德国曾准备 利用内孢霉属（Endomyces)和单细胞藻类镰刀属（Fusarium)的某些菌种生产油脂以解决 食用油匮乏问题。随后美国、日本等国也开始研宄微生物油脂的生产。第二次世界大战前 夕，德国科学家筛选到了适于深层培养的菌种，并进行规模生产。后来发现利用微生物生产 普通油脂成本太高，无法与动、植物来源的油脂相竞争。有关微生物油脂的探索此后一度集 中在获取功能性油脂，如富含多不饱和脂肪酸的油脂。近年来，随着现代生物技术的发展， 已获得更多具有高产油能力或其油脂组成中富含稀有脂肪酸的产油微生物资源，提高了微 生物产油的效率。日本、德国、美国等国目前已有商品菌油面市。
[0004] 随着人类社会资源压力和环境问题日益突出，通过微生物转化可再生资源生产油 脂及其它相关代谢产品，部分替代化石资源，将是可持续发展的必然。微生物油脂与传统油 脂（动植物油脂）相比，还拥有自身的优点，如它们含油量较高，油脂生产周期短，微生物培 养条件简单，不像植物依赖季节与气候，还有重要的一点就是微生物油脂的不饱和脂肪酸 含量较为丰富。
[0005] 卷枝毛霉，作为一种产油微生物，含有丰富的不饱和脂肪酸γ-亚麻酸（顺式-6， 9,12-十八碳三烯酸），其在上世纪已被作为生产γ-亚麻酸的模式菌株。γ-亚麻酸是组 成人体各组织生物膜的结构材料，也是合成前列腺素的前体。其在营养保健方面有重要的 作用，它能够抗心血管疾病，降血脂，降血糖，抗癌以及美白和抗皮肤老化，其潜在的药用价 值受到广泛的关注。然而，由于卷枝毛霉总脂肪酸含量较低，导致其生产γ-亚麻酸成本较 高，经济因素导致卷枝毛霉在γ-亚麻酸的工业化受到阻碍。
[0006] 目前，在已报道的卷枝毛霉中，其在以酒石酸铵为氮源培养条件下脂肪酸含量大 约是15~25% (脂肪酸/细胞干重）。已报道的卷枝毛霉菌株的脂肪酸积累能力较低，这 严重影响了卷枝毛霉在生产功能性油脂和生物能源方面的应用前景。
[0007] 因此，获得能够高产脂肪酸的卷枝毛霉菌株具有十分重要的意义。本发明获得一 株能够高产脂肪酸的卷枝毛霉WJl 1，其脂肪酸含量在以酒石酸铵作为氮源培养条件下达到 30~40%，这是目前为止在卷枝毛霉中脂肪酸含量最高的一株。 【
【发明内容】
】
[0008] [要解决的技术问题]
[0009] 本发明提供了一株高产脂肪酸及γ -亚麻酸的卷枝毛霉（Mucor circinelIoides)WJll0
[0010] 本发明的另一个目的是应用所述卷枝毛霉WJll生产油脂。
[0011] [技术方案]
[0012] 本发明是通过下述技术方案实现的。
[0013] 本发明涉及的一株高产脂肪酸的卷枝毛霉WJll分离自无锡江南大学蠡湖校区土 壤。其具体步骤如下：
[0014] A. 土壤样品的采集
[0015] 土壤取自无锡江南大学蠡湖校区。先用小1产子去除表面泥土，取离地表5~IOcm 处的泥土，装入蓝盖瓶4°C保存备用。
[0016] B.真菌的分离纯化
[0017] 取土壤样品5份，每份取20g加入180ml无菌水中，摇匀得到土壤悬浮液；吸取 IOOul接到PDA平板上，30°C恒温培养5~7天后，挑取平板上菌落形态有差异进行划线分 离纯化，获得的菌株转接到PDA斜面，共得到21株菌，对其编号保藏。
[0018] α产油真菌的筛选
[0019] 将分离纯化的21株真菌接入氮限制培养基中，于30°C摇床150rpm培养5天，菌丝 用布氏漏斗真空抽滤，冷冻干燥，氯仿甲醇提脂。结果显示只有WJll菌株油脂含量超过生 物量的20%，达到30 %以上（图1)。
[0020] D.产油霉菌WJll的菌种鉴定
[0021] 产油霉菌WJl 1，利用18SrDNA序列，形态特征、培养性状和生理生化特征及结果鉴 定为卷枝毛霉，18SrDNA序列见序列表，其菌丝体在基物上或基物内能广泛的蔓延，无假根 和匍匐菌丝，孢囊梗直接由菌丝体生出，菌丝体无膈，总状分枝，囊轴与孢囊梗相连接处无 囊托，孢囊孢子椭圆形。该菌株已于2014年9月17日在中国典型培养物保藏中心保藏，其 保藏号为CCTCC NO :M 2014424,保藏单位地址为中国武汉武汉大学，分类命名为卷枝毛霉 WJll Mucor circinelloides WJll0
[0022] 根据本发明的实施方式，所述的氮限制培养基组成如下：50g/L葡萄糖、2g/L酒石 酸铵、7g/L KH2P04、2g/L Na2HP04、l. 5g/LMgS04 · 7Η20、1· 5g/L 酵母粉、0· lg/L CaCl2 · 2H20、 0. 008g/L FeCl3 · 6H20,0.0 Olg/L ZnSO4 · 7H20,0.0 OOlg/L CuSO4 · 5H20,0.0 OOlg/L Co(NO3)2 · 6H20 与 0· OOOlg/L MnSO4 · 5H20。
[0023]
[0024]
[0025] 本发明涉及一种利用卷枝毛霉WJll发酵生产油脂的方法。
[0026] 该方法的步骤如下：
[0027] A、菌种活化
[0028] 将卷枝毛霉WJll孢子液按与活化培养基的体积比1 : 1000~2000接入装有活 化培养基的带挡板三角瓶中，在摇床中温度25~35°C与转速100~200rpm的条件下恒温 培养16~30h，得到一种活化菌种液；
[0029] B、种子培养
[0030] 在无菌的条件下，将步骤A得到的活化菌种液按种子培养基体积的5~15%接入 装有种子培养基的带挡板三角瓶中，在摇床中温度25~35°C与转速100~200rpm的条件 下恒温培养16~30h，得到一种种子培养液；
[0031] C、发酵培养
[0032] 在无菌的条件下，将步骤B得到的种子培养液按体积为发酵培养基体积的5~ 15%接入装有发酵培养基的发酵罐中，在通气流量1~3L/min、pH为5. 0~7. 0、温度25~ 35°C与转速500~1000 rpm的条件下恒温培养80~120h，得到一种发酵培养液；
[0033] D、冷冻干燥
[0034] 将步骤C得到的发酵培养液经过滤，然后在冷冻干燥机中冻干至恒重，得到含有 油脂的卷枝毛霉WJll的干菌体。
[0035] E、脂肪酸提取
[0036] 将步骤D得到的干菌体研磨，采用氯仿甲醇法提取油脂。
[0037] 根据本发明的实施方式，所述的卷枝毛霉WJll菌体含有以该菌体总重量计 30-40 %脂肪酸。
[0038] 根据本发明的一种优选实施方式，所述的活化培养基与种子培养基组成如下： 30g/L葡萄糖、3.3g/L酒石酸铵、7.0g/L KH2P04、2.0g/L Na2HP04、1.5g/L MgS04.7H20、1.5g/ L 酵母粉、0· lg/L CaCl2 · 2Η20、0· 008g/L FeCl3 · 6Η20、0· OOlg/L ZnSO4 · 7Η20、0· OOOlg/L CuSO4 · 5Η20、0· 0001g/L Co(NO3)2 · 6Η20 与 0· 0001g/L MnSO4 · 5Η20。
[0039] 根据本发明的实施方式，所述的发酵培养基组成如下：50~120g/L葡萄糖，优 选 80g/L、0. 1 ~5g/L 酒石酸铵，优选 2g/L、5 ~10g/L KH2P04、1 ~5g/L Na2HP04、l ~5g/ LMgSO4 · 7Η20、0· 1 ~2. 0g/L 酵母粉、0· IgAXaCl2 · 2H20、0· 008g/L FeC13 · 6Η20、0· 001g/L ZnSO4 · 7Η20、0· OOOlg/L CuSO4 · 5Η20、0· OOOlg/L Co (NO3)2 · 6H20 与 0· 0001g/LMnS04 · 5H20。
[0040] 采用上述培养方法研宄了卷枝毛霉WJll生长、营养消耗、脂肪酸积累、脂肪酸合 成关键酶活：
[0041] 1、卷枝毛霉WJll的生长
[0042] 本发明收集上述发酵菌体，冷冻干燥后测得卷枝毛霉WJll在发酵过程中不同时 间点的生物量，卷枝毛霉CBS277. 49作为对照，其结果列于图2。这些结果表明，卷枝毛霉 WJll相比较CBS277. 49生长速率较快，其中菌株W