一种可以调控微藻生长和其它功能的生长调节剂及其鉴定方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物代谢工程技术领域，具体的说是一种可以调控微藻生长和其它生 理功能的生长调节剂及其鉴定方法和应用。
【背景技术】
[0002] 微藻被认为是最有潜力的油脂生物质资源之一。尽管微藻用于生产生物燃料的 优势明显，但其经济可行性仍面临着巨大挑战，主要的技术瓶颈包括微藻生长密度低、抗 逆性能差和含油量低等。另一方面，随着微藻生物技术、基因工程技术以及分子生物学技 术的发展，使得对油脂代谢通路关键基因的分离克隆和调控逐渐成为可能。1990年，乙酰 辅酶 A 羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC)首次在 Cyclotella cryptica 中被克隆 (Roessler, 1990)，随后被成功的用于对娃藻C. cryptica和Navicula saprophila的改造 中；经检测工程微藻中的ACC酶活提高了 2-3倍，然而藻体内油脂的积累水平并未显著提高 (Dunahay et al·，1996)。这表明，通过对油脂代谢通路上的单一酶的改造，尚无法有效提 高油脂的积累。因此，需要寻找一种针对总体代谢或调控网络的调控手段。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种可以调控微藻生长和其它生理功能的生长调节剂及其 鉴定方法和应用。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0005] -种可以调控微藻生长和其它生理功能的生长调节剂，其特征在于：所述生长调 节剂为用于调节微藻生长发育的化合物。
[0006] 所述生长调节剂为生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯、油菜素留醇、独脚 金甾醇、水杨酸或茉莉酸等；以及生长调节剂的代谢和信号传递通路；激素合成酶、激素分 解酶、激素衍生化酶（乙酰化或糖基化等)、激素转运蛋白、激素结合蛋白、激素信号传递蛋 白、转录因子或蛋白激酶。
[0007] -种微藻生长调节剂及其代谢和信号通路的鉴定方法，通过代谢物组学手段鉴定 微藻激素，通过功能基因组学手段阐释微藻激素的代谢、信号传递通路和调控网络；再通过 转录组学手段鉴定在微藻生长、抗逆和油脂合成过程中关键的激素代谢酶和信号传递相关 的蛋白。
[0008] 进一步的说，利用超高效液相色谱-电喷雾电离方式鉴定微藻激素的存在，利用 超高效液相色谱-电喷雾电离方式鉴定微藻激素的种类并测定其含量，而后利用功能基因 组学手段阐释微藻激素的代谢通路、信号传递通路和调控网络，最后利用转录组手段鉴定 微藻激素的代谢酶和信号传递网络调控蛋白。
[0009] 所述微藻为自养、异养或兼性营养型单细胞或多细胞藻类；或，通过基因工程手段 获得的工程藻、通过物理化学诱变获得的突变子。
[0010] 所述微藻为绿藻、红藻、硅藻、褐藻、裸藻、甲藻、黄藻、金藻或真眼点藻；或，生产高 值蛋白、药物、动物疫苗、高值化合物（中性脂、虾青素、二十二碳六烯酸）的工程藻。
[0011] 将所述微藻激素代谢和信号通路相关的酶和蛋白通过改造进而作为调控微藻生 理状态，提高其生长速率的手段。
[0012] 方法中所述证明微藻内源性激素存在的方法为超高效液相色谱-电喷雾电离技 术或其等效技术。
[0013] 所述的超高效液相色谱-电喷雾电离技术的等效技术包括免疫酶联技术、质谱技 术、细胞学技术等已知或尚待开发的可用于发现特定激素的技术。
[0014] 方法中所述阐释微藻激素的代谢和信号传递通路及调控网络的手段包括功能基 因组学手段或其等效手段。
[0015] 所述的功能基因组学手段的等效手段包括分子生物学手段、蛋白质组学手段、酵 母杂交技术、基因工程技术、化学工程技术、细胞学技术等已知或尚待开发的可用于鉴定激 素的代谢、信号传递和调控网络的技术。
[0016] 方法中所述的鉴定微藻激素的代谢通路、信号传递通路和网络调控的关键酶和蛋 白的手段包括转录组技术或其等效技术。
[0017] 所述的转录组技术的等效技术包括高通量测序技术、芯片技术、荧光定量技术、分 子生物学技术、细胞生物学技术、植物生理学技术、蛋白质组学手段、酵母杂交技术、基因工 程技术、化学工程技术等已知或尚待开发的可用于鉴定微藻激素的代谢通路、信号传递和 网络调控的关键酶和蛋白的技术。
[0018] 一种微藻激素及其代谢和信号通路的应用，所述通过改造上述鉴定获得的微藻激 素及其代谢通路和信号通路，提高微藻的生长速率、抗逆性以及生物质、油脂和高附加值化 合物的积累。
[0019] 方法中所述的可以提高微藻和植物抗逆性能及其生物质、油脂和高附加值化合物 积累的技术包括外源施加激素或其等效技术。
[0020] 所述的外源施加激素的等效技术包括基因工程改造激素代谢和信号传递通路、化 学物理方法诱变激素代谢和信号传递通路、外源施加激素代谢或信号传递化学抑制剂、外 源施加可产生激素的微生物等任何物质。
[0021] 方法中所述的通过扰动激素代谢或信号传递而改良的性状为微藻和植物的抗逆 性能、生长速率或其它可提高微藻经济价值、降低微藻工业化成本的性状。
[0022] 所述的可提高微藻经济价值、降低微藻工业化成本的性状包括生物质合成、高能 量密度物质合成和高附加值化合物合成等。
[0023] 与现有技术相比，本发明实现了藻类学技术的重点突破，具有如下有益效果：
[0024] 1.本发明提供用于鉴定微藻激素及其代谢通路和信号通路的方法。利用该方法可 以阐释与藻类生理密切相关的激素代谢的酶、信号蛋白和相关调控机理，并用于改良生物 的农艺性状。
[0025] 2.本发明提供了可用于调控微藻生理的植物激素的种类和含量。可用于针对性的 调控相应激素的代谢和信号通路，改善微藻生理性状。
[0026] 3.本发明提供了可用于鉴定调控微藻生理过程的激素代谢和信号传递的关键酶 和蛋白的方法。可以筛选获得调控特定生理性状的酶或蛋白，针对性的提高微藻特定的生 理性状。
[0027] 4.本发明利用外源施加植物激素的方法调控微藻生理性状，并能有效提高微藻的 生长速率、光合效率和抗逆性能。可以用于改良微藻、作物或其它植物的各种经济性状。
[0028] 5.本发明能通过基因工程手段调控激素代谢或信号通路，实现外源基因在微藻或 植物中高效表达并有效改善其各种经济性状。
[0029] 6.本发明能通过调控激素代谢或信号通路，提高工程藻经济价值，用于大量生产 各种目的蛋白、生物制剂(生长素、干扰素、血清蛋白、胰岛素等)、疫苗(霍乱、狂犬病、炭疽 病、破伤风、阿米巴等)、高附加值化合物(虾青素、植物留醇、虾青素、二十二碳六烯酸、色 素、蛋白质）和高能量密度化合物（中性脂、类萜、长链烃、长链脂肪醇)。
[0030] 7.借助本发明技术，可使微藻具备更加优越的规模培养性状，如高生长速率和高 抗逆性(抗生物或非生物胁迫)等。设计与构建结合本发明的针对特定微藻的低成本高光效 反应设施，降低规模培养成本。
[0031] 8.本发明所采用的微藻具有光合效率高、繁殖快、环境适应性强的特点，而后通过 调控激素代谢和信号通路，可以进一步提高其光合效率，固碳效率，减排产能。
[0032] 9.多种微藻基因组序列已经测定，借助本发明可以进一步在微藻中发掘激素代谢 和信号通路相关的酶和蛋白以及网络调控机理。
【附图说明】
[0033] 图1为本发明实施例提供的微拟球藻留体激素组成和含量效果图，简写：油菜素 内酯（brassinolide，BL)、油菜素留酮（castasterone，CS)、香蒲留醇（typhasterol，TY)、 扁?留内醋（dolicholide，DL)、高油菜素留丽（homocastasterone，homoCS)和 28-去甲基 油菜素内醋（28-norbrassinolide，norBL)。
[0034] 图2为本发明实施例提供的微拟球藻细胞分裂素组成和含量效果图。简写： 顺式-玉米素（cis-zeatin，cZ)、顺式-玉米素核苷（cis-zeatin riboside, cZR)、顺 式-玉米素-〇-葡萄糖苷（cis-zeatin-〇-glucoside，cZOG)、顺式-玉米素核苷-〇-葡 萄糖苷（cis-zeatin riboside-〇-glucoside，cZROG)、顺式-玉米素核苷 _5' -单憐酸 (cis-zeatin riboside-S，-monophosphate, cZRMP)、反式-玉米素（trans-zeatin, tZ)、反 式-玉米素核苷（trans-zeatin riboside，tZR)、反式-玉米素-核苷酸（tZR-nucleotide， tZRMP)、反式-玉米素核苷-〇-葡萄糖苷（trans-zeatin-〇-glucoside，tZOG)、反式-玉 米素核苷 _〇_ 葡萄糖苷（trans-zeatin riboside-〇-glucoside，tZROG)、反式-玉米 素 _9_ 葡萄糖苷（trans-zeatin-9-glucoside，tZ9G)、二氢玉米素（dihydrozeatin，DHZ)、 二氢玉米素核苷（dihydrozeatin riboside，DHZR)、二氢玉米素核苷酸（dihydrozeatin riboside nucleotide，DHZRMP)、二氢玉米素-〇_ 葡萄糖苷（dihydrozeatin-〇-glucoside， DHZ0G)、二氢玉米素核苷-〇_ 葡萄糖苷（dihydrozeatin riboside-〇-glucoside, DHZR0G)、二氢玉米素核苷-9-葡萄糖苷（dihydrozeatin-9-glucoside，DHZ9G)、异戊 烯基腺噪呤（isopentenyladenine，iP)、异戊烯基腺噪呤核苷（isopentenyladenine， iPR)、异戊烯基腺嘌呤-核苷酸（iPR-nucleotide，iPRMP)、异戊烯基腺嘌呤-葡萄糖苷 (isopentenyladenine-9_glucoside，iP9G)。（b)芳香族细胞分裂素组成和含量。简写： meta-topolin (mT)、meta_topolin riboside (mTR)、meta_topolin-〇-glucoside (mTOG)、 meta-topolin riboside-〇-glucoside (mTROG)、 meta-topolin-9-glucoside (mT9G)、 ortho-topolin (oT)、 ortho-topolin riboside (oTR)、 ortho-topolin-O-glucoside (〇TOG)、 ortho-topolin riboside-〇-glucoside (oTROG)和 ortho_topolin-9-glucoside (〇T9G)。图3为本发明实施例提供的微拟球藻赤霉素组成和含量效果图。赤霉素 I (GA1X 赤霉素4 (GA4)、赤霉素13 (GA13)、赤霉素15 (GA15)、赤霉素19 (GA19)、赤霉素20 (GA20)、 赤霉素24 (GA24)、赤霉素29 (GA29)、赤霉素34 (GA34)和赤霉素53 (GA53)。
[0035] 图4为本发明实施例提供的光合真核生物中激素代谢和信号通路图。仅列出了异 戊二烯来源的激素。黑色表示e-value彡Ie-IO ;红色表示e-value < le-50。缩写：S，合 成（synthesis) ;H，水解（hydrolysis) ;C，衍生化（conjugation) ;T，转运（transporter); R，受体（receptors);SC，信号组分（signaling components)。Cm，红藻 C.merolae ;Pt，娃藻 P. tricornutum ;Tp，娃藻 T. pseudonana ;Fc，娃藻 F. cylindrus ;No,真眼点藻 Ν· oceanica ; Es，褐藻 Ε· siliculosus ;Mi，绿藻 Micromonas sp. RCC299 ;0t，绿藻 0· tauri ;Cv，绿藻 C. variabiIis NC64A ;Cp，绿藻 C. pyrenoidosa ;Cs，绿藻 C. subellipsoidea C-169 ;Cr，绿 藻 C. reinhardtii ;Vc，绿藻 V. carteri ;Pp，苔藓 R patens ;Sm，地钱 S. moellendorfii ;Zm， 单子叶Z. mays和At，双子叶A. thaliana。
[0036] 图5为本发明实施例提供的微拟球藻激素代谢通路图。以微拟球藻（N. oceanica) 和拟南芥（Arabidopsis)为例进行对比。仅列出了异戊二烯来源的激素。黑色箭头表示代 谢和信号通路；虚线箭头表示省略的步骤。酶或蛋白用方框表示；红色方框表示在微拟球 藻中存在的酶。绿色斜体表示微拟球藻中存在的化合物。
[0037] 图6为本发明实施例提供的异戊二烯类细胞分裂素在缺氮诱导下的变化谱。顺 式-玉米素（cis-zeatin，cZ)、顺式-玉米素核苷（cis-zeatin riboside，cZR)、顺式-玉 米素-〇-葡萄糖苷（cis-zeatin-〇-glucoside，cZOG)、顺式-玉米素核苷-〇-葡萄糖苷 (cis-zeatin riboside-〇-glucoside，cZROG)、顺式-玉米素核苷 _5'_ 单憐酸（cis-zeatin riboside-5^ -monophosphate，cZRMP)、反式-玉米素（trans-zeatin，tZ)、反式-玉米素 核苷（trans-zeatin riboside，tZR)、反式-玉米素-核苷酸（tZR-nucleotide，tZRMP)、 反式-玉米素核苷 -〇葡萄糖苷（奸3118-263丨；!_11-〇-8111(3081(16，丨206)、反式-玉米素核 苷-〇-葡萄糖苷（trans-zeatin riboside-〇-glucoside，tZROG)、反式-玉米素-9-葡萄 糖苷（trans-zeatin-9-glucoside，tZ9G)、二氢玉米素（dihydrozeatin，DHZ)、二氢玉米 素核苷（dih