核酸扩增反应装置以及核酸扩增方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及核酸扩增反应装置以及核酸扩增方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，由于基因的利用技术的发展，基因诊断、基因治疗等利用基因的医疗受到 瞩目。另外，即使在农业、畜牧业领域中，也开发出很多将基因用于鉴别品种、改良品种的方 法。作为用于利用基因的技术，PCR(Polymerase Chain Reaction聚合酶链反应）等技术 正在广泛普及。如今，PCR在生物体的信息解析中成为必不可缺的技术。PCR是对包含成为 扩增对象的核酸（靶核酸）以及试剂的溶液实施热循环，从而使靶核酸扩增的方法。作为 PCR的热循环，通常是以两个梯度或者三个梯度的温度来实施热循环的方法。
[0003] 另一方面，医疗机构中对以流行性感冒为代表的传染病的诊断，现状是使用免疫 层析试剂盒等简易检查套件成为主流。但是，在这样的简易检查中，存在精度不够的情况， 因而希望将能够期待更高的检查精度的PCR应用于传染病的诊断。另外，医疗机构的普通 门诊患者等由于诊察的时间受限的关系，所以检查所花费的时间被限制在短时间内。因此， 现状是例如对流行性感冒的检查牺牲检查的精度，而通过简易的免疫层析试剂盒等的检查 而实现短时间化。
[0004] 根据这样的情况，在医疗机构中，为了实现基于能够期待更高的精度的PCR进行 的检查，需要缩短反应所需的时间。作为用于在短时间内进行PCR反应的装置，例如在专利 文献1中公开了一种生物体试样反应装置，其通过使生物体试样反应用芯片绕水平方向的 旋转轴旋转，从而使反应液移动来实施热循环，其中所述生物体试样反应用芯片填充有反 应液、和不与反应液混合且比重比反应液小的液体（专利文献1)。另外，作为PCR的一个方 法，公开有以下方法，即：使用了磁性粒子的方法（专利文献2)、通过使用磁性粒子作为液 滴的移动机构，使基板上在温度变化区域的液滴移动，由此进行PCR的热循环的方法（专利 文献3)等。
[0005] 专利文献1 :日本特开2009-136250号公报
[0006] 专利文献2 :日本特开2009-207459号公报
[0007] 专利文献3 :日本特开2008-012490号公报
[0008] 在使用磁性粒子的核酸提取方法中，在使核酸从磁性粒子表面向溶液（溶出液） 脱离时，若对溶出液进行加热，则溶出效率提高。作为其方法，考虑有利用加热块对溶出部 进行加热的方法，但在使用细管进行的提取中，会导致细管被加热块覆盖。但是，若导致细 管被加热块覆盖，则存在导致细管与磁铁的距离分离，从而无法对磁性粒子施加足够的磁 力，因此利用磁力对溶出液中的磁性粒子进行感应变得困难的情况。
【发明内容】
[0009] 本发明是鉴于上述情况所做出的，目的在于提供一种核酸提取用设备，能够对被 加热块包围的管内的溶出液中的磁性粒子施加较强的磁力。
[0010] 本发明所涉及的核酸扩增反应装置的特征在于，旋转体，其具有能够安装筒的安 装部，所述筒具备管和核酸扩增反应用容器，其中在所述管的内部依次具备：由油构成的第 一液柱；由清洗液构成的第二液柱，其与油相互分离并对结合有核酸的核酸结合性磁性载 体进行清洗；由油构成的第三液柱；由溶出液构成的第四液柱，其与油相互分离并使所述 核酸从结合有所述核酸的核酸结合性磁性载体溶出；以及由油构成的第五液柱，所述核酸 扩增反应用容器与所述管的配置有所述第五液柱的一侧连通且将核酸扩增反应试剂保持 于油中；加热部，其用于对所述第四液柱进行加热，该加热部具有筒状槽，当在所述安装部 安装有所述筒时，所述管卡合于所述筒状槽并且从所述筒状槽的开口部呈狭缝状露出；以 及磁力施加机构，其对所述核酸结合性磁性载体施加磁力，使所述核酸结合性磁性载体沿 所述管的长度方向移动，所述旋转体旋转而使所述筒的姿势发生变化，由此包含有从所述 管导入的所述溶出液的液滴在所述核酸扩增反应容器的内部移动。也可以具有第二加热 部，其对所述核酸扩增反应用容器的与所述管连通的一侧的一端亦即第一部分进行加热。 也可以具有第三加热部，其对所述核酸扩增反应用容器的与所述第一部分不同的另一端亦 即第二部分进行加热。
[0011] 本发明所涉及的核酸扩增方法的特征在于，是使用上述核酸扩增反应装置来进行 核酸扩增反应的方法，该核酸扩增方法包括以下工序：对导入到所述管内的所述核酸结合 性磁性载体施加磁力，以使其移动到所述管的所述第四液柱的位置的工序；利用所述加热 部对所述溶出液液柱进行加热的工序；以及将所述溶出液从所述管推出并使其流入所述核 酸扩增反应用容器的工序，在对所述溶出液液柱进行加热的工序中，将所述磁铁按压于所 述开口部。
[0012] 对于本发明的其他特征，根据本说明书以及附图的记载能够明确。
【附图说明】
[0013] 图IA以及图IB是筒1的说明图。
[0014] 图2A~图2C是筒1的动作说明图。
[0015] 图3A~图3D是罐3的说明图。
[0016] 图4是固定爪25以及导板26与安装部62的说明图。
[0017] 图5A以及图5B是PCR容器30的周边的说明图。
[0018] 图6A是PCR装置50的内部结构的立体图。图6B是PCR装置50的主要结构的侧 视图。
[0019] 图7是PCR装置50的框图。
[0020] 图8A是旋转体61的说明图。图8B是在旋转体61的安装部62安装了筒1的状 态的说明图。
[0021] 图9A~图9D是安装筒1时的PCR装置50的状态的说明图。
[0022] 图10是使磁铁71向下方移动时的磁性粒子7的动作的概念图。
[0023] 图IlA~图IlC是核酸溶出处理的说明图。
[0024] 图12是使磁铁71摆动时的磁性粒子7的动作的概念图。
[0025] 图13A~图13C是液滴形成处理的说明图。
[0026] 图14A以及图14B是热循环处理的说明图。
[0027] 图15A以及图15B是第二实施方式的筒1的说明图。
[0028] 图16A是第二实施方式的筒1的初始状态的说明图。图16B是从图16A的状态按 压柱塞10而使密封件12A与下注射筒22接触时的侧视图。图16C是按压柱塞10后的第 二实施方式的筒1的说明图。
[0029] 图17A以及图17B是第二实施方式的PCR容器30的周边的说明图。
【具体实施方式】
[0030] 以下，对本发明的实施方式进行详细地说明。另外，本发明的目的、特征、优点及其 构思通过本说明书的记载，能够使本领域技术人员明确，根据本说明书的记载，只要是本领 域技术人员则能够容易地再现本发明。以下所记载的发明的实施方式表示本发明的优选的 实施方式，为了例示或者说明而示出，本发明不限定于此。能够本说明书所公开的本发明的 意图以及范围内，基于本说明书的记载，进行各种改变以及修饰对于本领域技术人员而言 是显而易见的。
[0031] 第一实施方式
[0032] 首先，对安装于PCR装置50 (核酸扩增反应装置）的筒进行说明，然后对本实施方 式的PCR装置50的结构、动作进行说明。
[0033] 筒 1
[0034] 图IA以及图IB是筒1的说明图。图2A~图2C是筒1的动作说明图。图2A是 筒1的初始状态的说明图。图2B是从图2A的状态按压柱塞10而使密封件12A与下注射 筒22接触时的侧视图。图2C是按压柱塞10后的筒1的说明图。
[0035] 筒1是进行使核酸从结合有核酸的磁性粒子7溶出的核酸溶出处理的容器，并且 是对成为PCR溶液的溶出液47进行用于聚合酶反应的热循环处理的容器。
[0036] 核酸提取处理在罐3中进行，在通过管20的期间被精制。管20的材质不做特别 地限定，例如能够列举玻璃、塑料等树脂、金属等。特别是若选择透明的玻璃、树脂作为管 20的材质，则能够从管20的外部观察内部，因此更加优选。另外，若管20的材质选择透过 磁力的物质或非磁性体，则在使磁性粒子通过管20的情况等下，通过从管20的外部赋予磁 力，由此容易使磁性粒子移动，因此是优选的。另外，由于在管的附近配置有加热器（后述 的溶出用加热器65A、高温侧加热器65B)，所以管的材质优选至少具有KKTC以上的耐热性 的材质。另外，管20的材质也可以与罐的材质相同。
[0037] 管20具有清洗液液柱45、溶出液液柱47以及油柱。结合有核酸的磁性粒子7被 外部的磁铁吸引，因此通过使磁铁沿着管20在外部移动，从而磁性粒子7在管20内移动， 并穿过清洗液液柱45而到达溶出液液柱47。与磁性粒子7结合的核酸，在清洗液液柱45 被清洗液清洗，并在溶出液液柱47溶出。其中，所谓"液柱"意味着：特定的液体在管20内 占据一个区域的情况下的液体。例如，在图2A~图2C中，将在细管23内保持为柱状的液 体称为"液柱"。另外，油与其他溶液相互分离（不与其他溶液混合），因此由油构成的液柱 具有防止其两侧的水溶性的液柱相互混合的功能。优选在液柱中、液柱之间不存在气泡或 其他液体，但只要磁性粒子7能够穿过液柱，则可以存在气泡或其他液体。
[0038] 油的种类不做特别地限定，能够使用矿物油、硅油（2CS硅油等）、植物油等，但通 过使用更高粘度的油，在使核酸结合性固相载体在与上侧的液柱的界面移动的情况下，能 够提高油所带来的"洗掉效果"。由此，在使核酸结合性固相载体从上侧的液柱向由油构成 的液柱移动的情况下，能够更加难以将附着于核酸结合性固相载体的水溶性的成分带入到 油内。
[0039] 热循环处理在筒1的PCR容器30中进行。PCR容器30被油填满，溶出液47与该 油相互分离，因此若从管20将溶出液液柱47推出到PCR容器30中，则成为液滴状，另外， 由于比重比油大，所以成为液滴状的溶出液47沉降。利用外部的加热器在PCR容器30内 形成高温区域36A和低温区域36B，若反复使筒1整体与加热器一同上下翻转，则液滴状的 溶出液47在高温区域36A与低温区域36B之间交替地移动，从而能够对PCR溶液亦即溶出 液47实施两个梯度的温度处理。
[0040] PCR容器30的材质不做特别地限定，但例如能够列举玻璃、塑料等树脂、金属等。 另外，由于在PCR容器30的附近存在高温侧加热器65B，所以PCR容器30的材质优选至少 具有KKTC以上的耐热性。若PCR容器30的材质选择透明或者半透明的材质，则荧光测量 (亮度测量）变得容易，因此是优选的。但是，不需要在PCR容器30的全部区域均为透明或 者半透明，只要至少与荧光测量仪55对置的部位（例如PCR容器30的底部35A)为透明或 者半透明即可。另外，PCR容器30的材质也可以与罐3、柱塞10的材质相同。
[0041] 筒1由罐3以及筒主体9构成。作为构成筒1的套件，与罐3以及筒主体9 一同 预先准备接续器5。经由接续器5将罐3与筒主体9进行连接，由此能够组装筒1。但是， 也能够构成为将罐3直接安装于筒主体9。
[0042] 在以下的筒1的构成要素的说明中，如图2A所示，将沿着长条的筒1的方向称为 "长度方向"，将罐3侧称为"上游侧"，将PCR容器30侧称为"下游侧"。另外，有时将上游侧 简称为"上"，将下游侧简称为"下"。
[0043] (1)罐
[0044] 图3A~图3D是罐3的说明图。
[0045] 在套件中预先准备的罐3中收纳有溶解液41以及磁性粒子7。在罐3的开口安 装有能够取下的盖3A(参照图3A)。作为溶解液41，使用5M硫氰酸胍、2% Triton X-100、 50mM Tris-HCl (ρΗ7· 2)。工作人员取下盖3A而打开罐3的开口（参照图3B)，将附着有病 毒的棉棒浸入罐3内的溶解液41，从而将病毒采集于溶解液41(参照图3C)。在对罐3内 的液体进行搅拌时，也可以在图3C的状态下振荡罐3,但这样溶解液41容易溢出，因此如 图3D所示，优选在将附带盖5Α的接续器5安装于罐3的开口后，振荡罐3。由此能够对罐 3内的物质进行搅拌，从而病毒粒子由溶解液41溶解，且核酸游离，并且涂敷于磁性粒子7 的二氧化硅吸附核酸。磁性粒子7相当于核酸结合性固相载体。然后，工作人员取下安装 于罐3的开口处的接续器5的盖5Α，经由接续器5将罐3安装于筒主体9 (参照图2Α)。
[0046] 罐3由具有挠性的树脂构成，罐3能够膨胀。在柱塞10滑动而从图2Α的状态成 为图2Β的状态时，罐3膨胀，由此能够抑制管20内的液体的压力过于上升，从而能够抑制 管20内的液体被推出至下游侧。优选以罐3容易膨胀的方式在罐3形成变形部3Β。
[0047] 另外，对核酸进行提取、扩增的样品，不局限于病毒，也可以是细胞。对细胞的来源 也不做特别地限定，可以是微生物，也可以是高等生物的组织切片、血液等。
[0048] 另外，溶解液41只要含有促溶物质，则不做特别地限定，但也可以以破坏细胞膜 或者使细胞中所包含的蛋白质变性为目的而含有表面活性剂。作为该表面活性剂，通常 只要是从细胞等提取核酸所使用的表面活性剂，则不做特别地限定，具体而言，能够列举 Triton-X等Triton类表面活性剂、Tween20等Tween类表面活性剂那样的非离子表面活性 剂、以及N-月桂酰肌氨酸钠（SDS)等阴离子表面活性剂，但特别地优选将非离子表面活性 剂使用为〇. 1~2%的范围。并且，在溶解液优选含有2-巯基乙醇或者二硫苏糖醇等还原 剂。溶解液也可以是缓冲液，但优选是PH6~8的中性。考虑这些因素，具体而言，优选含 有3~7M的胍盐、0~5%的非离子表面活性剂、0~0. 2mM的EDTA、以及0~0. 2M的还原 剂等。
[0049] 促溶物质只要具有在水溶液中产生促溶离子（离子半径较大的一价的阴离子）而 增加疏水性分子的水溶性的作用，并有助于核酸向固相载体的吸附，则不做特别地限定。具 体而言，能够列举硫氰酸胍、盐酸胍、碘化纳、碘化钾、高氯酸钠等，其中，优选蛋白质变性作 用较强的硫氰酸胍或者盐酸胍。这些促溶物质的使用浓度根据各物质不同而不同，例如，在 使用硫氰酸胍的情况下，优选在3~5. 5M的范围内使用，在使用盐酸胍的情况下，优选在5M 以上使用。
[0050] 另外，采集样品的器具不做特别地限定，只要根据用途选择抹刀、棒、刮刀等来取 代棉棒即可。
[0051] 罐