基于微液滴的数字核酸扩增定量分析方法及系统的制作方法

基于微液滴的数字核酸扩增定量分析方法及系统的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种数字核酸扩增定量分析方法及系统，该方法配制待检测核酸扩增反应液，其包含待检测核酸模板、反应缓冲水溶液、脱氧核糖核苷三磷酸、引物、聚合酶和产物标记物质；将所述配制的待检测核酸扩增反应液载入两端均有开口的微管道，所述微管道位于开口容器上方，所述开口容器盛有含有表面活性剂的油性液体；将所述微管道一端开口在所述开口容器的液面表面上下往复振动，或在液面以下左右往复振动，生成多个液滴，平铺在开口容器底部；将所述开口容器中的多个液滴进行核酸扩增反应；采集所述核酸扩增反应后的产物信号，对核酸模板进行定量分析。所述数字核酸扩增分析法能实现微体系中低浓度核酸物质定量检测，操作简便，效率高、成本低。
【专利说明】基于微液滴的数字核酸扩増定量分析方法及系统

【技术领域】
[0001]本申请涉及核酸定量分析【技术领域】，具体涉及一种基于微液滴的数字核酸扩增定量分析方法及系统。

【背景技术】
[0002]传统的定量PCR(Polymerase Chain React1n，聚合酶链式反应)技术基于反应过程中核酸模板呈指数扩增，核酸模板的定量可以通过比较扩增循环数，以及分析扩增结束后PCR产物量来实现。然而，有多种因素导致传统的定量PCR方法有一定的局限性和不精确性，例如，扩增起始时不呈指数形式而会影响分析方法的精确性；过低浓度核酸模板扩增以后难以检测或者只有扩增存在两倍或两倍以上才能被检测出来等。
[0003]以数字PCR为代表的数字核酸扩增技术是新型的核酸模板定量技术，它将待测核酸模板样品分隔成为大量的微反应体系，且核酸模板在这些微体系中的分布符合泊松分布，即绝大多数微体系中只有一个或没有核酸模板，每一个微体系中都可以进行独立的核酸扩增反应，扩增结束以后，可以通过计算阳性微体系的数目而对起始核酸模板进行绝对定量。该方法对于研宄基因序列上的变异，如拷贝数变异以及点突变的检测等尤为适用。
[0004]数字核酸扩增技术主要采用微流控或微滴化方法形成微反应体系，目前微流控芯片上的液滴的生成需要满足特定的流速、油水界面张力以及通道构型和通道表面修饰等条件，液滴体积调节的范围也受到以上因素的制约。另外，液滴在微流控芯片通道内生成后，需要特定的步骤和装置转移到储存容器中，难以对单个液滴的条件进行定制，液滴的定位、提取和分析等操作较为不便。
[0005]通过毛细管等微通道注射或喷射微量液体，并将液体注入微坑或点样在基片，这在原理上是一种简便的液滴生成策略。然而，在实际操作中，液滴在脱离毛细管时，存在液滴与管内连续液体分离的表面张力，以及液滴与管口表面的附着力，使液滴体积的精确定量受到影响。通常，现有技术采用压电陶瓷、热激膨胀、高压电喷和超声等特殊的喷射或液滴激发方式，增加液滴脱离微通道出口的动能，以克服表面张力的影响(Tekin E, et al.1nkjet printing as a deposit1n and patterning tool forpolymers and inorganic particles.Soft Matter 2008，4 (4):703-713;Meacham JM, etal.Droplet format1n and eject1n from a micromachined ultrasonic dropletgenerator: Visualizat1n and scaling.Physics of Fluids 2005, 17 (10):100605 ；Ferraro P，et al.Dispensing nano—pico droplets and liquid patterning bypyroelectrodynamic shooting.Nature Nanotechnology 2010,5:429-435)，通过微通道出口的特殊构型以及硅烷化或涂层处理，降低液滴在管口的附着力(Tavana H，etal.Nanolitre liquid patterning in aqueous environments for spatially definedreagent delivery to mammalian cells.Nature Materials 2009，8 (9): 736-741) 0 然而，上述这些方式依赖于较为复杂的流体驱动装置等，成本较高，不利于数字核酸扩增的应用。


【发明内容】

[0006]有鉴于此，本申请提供一种基于微液滴的数字核酸扩增定量分析方法及系统，本申请提供的数字核酸扩增能实现微体系中低浓度核酸物质的定量检测，操作简便，效率高、成本低。
[0007]本申请提供一种基于微液滴的数字核酸扩增定量分析方法，包括以下步骤:
[0008]a)配制待检测核酸扩增反应液，所述待检测核酸扩增反应液包含待检测核酸模板、反应缓冲水溶液、脱氧核糖核苷三磷酸、引物、聚合酶和产物标记物质；
[0009]b)将所述步骤a)配制的待检测核酸扩增反应液载入两端均有开口的微管道，所述微管道位于开口容器上方，所述开口容器盛有含有表面活性剂的油性液体；
[0010]c)将所述步骤b)中微管道一端开口在所述开口容器的液面表面上下往复振动，或在液面以下左右往复振动，生成多个液滴，平铺在开口容器底部；
[0011]d)将所述步骤c)中开口容器中的多个液滴进行核酸扩增反应；
[0012]e)采集所述步骤d)核酸扩增反应后的产物信号，对核酸模板进行定量分析。
[0013]优选的，所述步骤a)中，所述待检测核酸扩增反应液为以脱氧核糖核酸为模板的核酸扩增反应液、以核糖核酸为模板的逆转录核酸扩增反应液或环介导等温扩增反应液。
[0014]优选的，所述步骤c)中，所述上下往复振动或者左右往复振动的振幅为0.1毫米?10毫米。
[0015]本申请提供一种基于微液滴的数字核酸扩增定量分析系统，包括:
[0016]液滴生成装置；
[0017]核酸扩增控温装置，使所述液滴生成装置生成的多个液滴进行核酸扩增反应；和
[0018]产物信号采集装置，用于采集所述核酸扩增反应后的产物信号；
[0019]所述液滴生成装置包括:
[0020]开口容器，用于储存生成的多个液滴并提供进行核酸扩增反应的场所；
[0021]位于所述开口容器上方的微管道，所述微管道用于载入待检测核酸扩增反应液，其两端均有开口 ；和
[0022]用于驱动所述微管道往复振动的振动设备。
[0023]优选的，所述开口容器为一维或二维的储液池阵列。
[0024]优选的，所述微管道具有圆柱管开口或锥形开口 ；所述微管道内径为5微米至250微米，且外径为10微米至500微米。
[0025]优选的，所述微管道为I根加样微管道、8根加样微管道、12根加样微管道或者96根加样微管道阵列。
[0026]优选的，所述振动设备为电磁铁式、压电陶瓷式或偏心轮式电机振动设备。
[0027]优选的，所述核酸扩增控温装置为水浴锅、金属浴设备、温箱或核酸扩增仪。
[0028]优选的，所述荧光信号采集装置为光学显微成像系统、荧光扫描仪或集成化图像传感器。
[0029]与现有技术相比，本申请实施例提供的数字核酸扩增定量分析方法首先在位于开口容器上方的微管道中装载待检测核酸扩增反应液，所述开口容器盛有含有表面活性剂的油性液体；由振动设备驱动控制所述微管道管口的运动，在所述开口容器的液面表面上下往复振动，或者在液面以下左右往复振动，生成多个液滴，单层平铺铺满开口容器底部；在核酸扩增控温装置的作用下，所述开口容器内生成的大小均一的液滴阵列进行数字核酸扩增；通过采集核酸扩增反应后的产物信号，对核酸模板进行定量分析。在本申请中，基于振动的液滴自动生成技术具有精确液滴大小可控和方法简便的优越性，通入溶液的微管道通过在气-油界面的上下振动，或者在油相中的左右振动，依靠液面张力等作用，实现均一大小油包水微液滴的生成；依靠重力的沉降作用，生成的液滴会沉入开口容器底部并自动平铺为液滴阵列。对于生成的均一大小液滴，本申请进行核酸扩增反应并采集产物信号，如荧光、紫外吸收、浊度等信号，在满足液滴数量多于核酸分子数量的前提下，利用扩增与非扩增液滴在组成上的差异，对获得目标序列扩增的液滴数量进行分析，最终实现对核酸分子的定量分析。本申请将所述液滴自动生成方法与数字核酸扩增技术两者结合，利用了数字核酸扩增的特点，实现了在微体系中低浓度核酸物质的定量检测；同时不需要任何芯片结构就可以快速高效地完成数字核酸扩增功能，避免了繁杂的芯片制作和微流控液路的集成工艺。因此，本申请提供的核酸扩增定量分析方法操作简便，效率高，成本低，将成为最为简易便捷的核酸物质定量分析方法，具有无可估量的科研价值和市场前景。

【专利附图】

【附图说明】
[0030]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0031]图1为本发明实施例提供的数字核酸扩增方法的流程图；
[0032]图2为本发明实施例提供的液滴生成装置的结构示意图；
[0033]图3为本发明实施例1?4中流速与生成液滴体积的关系图；
[0034]图4为本发明实施例1生成的液滴平铺于96孔板其中一孔底部的显微视图；
[0035]图5为本发明实施例1扩增之后的液滴在GFP通道中的荧光图；
[0036]图6为本发明实施例2生成的液滴的显微视图；
[0037]图7为本发明实施例2?4不同体积的液滴反应后的示意图；
[0038]图8为本发明实施例3生成的液滴的显微视图；
[0039]图9为本发明实施例4生成的液滴的显微视图；
[0040]图10为本发明实施例5毛细管在矿物油液面以下水平振动生成液滴的示意图；
[0041]图11为本发明实施例5生成的液滴的显微视图；
[0042]图12为本发明实施例6生成的液滴的显微视图；
[0043]图13为本发明实施例7生成的液滴的显微视图；
[0044]图14为本发明实施例8所采用的一种可快速装卸的一次性或多次使用带储液仓式微管道的正视图；
[0045]图15为本发明实施例8所采用的一种可快速装卸的一次性或多次使用带储液仓式微管道的剖视图；
[0046]图16为本发明实施例9提供的液滴生成装置的结构示意图；
[0047]图17为本发明实施例10提供的液滴生成装置的结构示意图；
[0048]图18为本发明实施例11提供的二维阵列式液滴大批量同时生成装置的结构示意图；
[0049]图19为本发明实施例11提供的二维阵列式液滴大批量同时生成装置的剖面示意图；
[0050]图20为本发明实施例12提供的二维阵列式液滴大批量同时生成装置的结构示意图。

【具体实施方式】
[0051]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0052]本申请提供了一种基于微液滴的数字核酸扩增定量分析方法，包括以下步骤:
[0053]a)配制待检测核酸扩增反应液，所述待检测核酸扩增反应液包含待检测核酸模板、反应缓冲水溶液、脱氧核糖核苷三磷酸、引物、聚合酶和产物标记物质；
[0054]b)将所述步骤a)配制的待检测核酸扩增反应液载入两端均有开口的微管道，所述微管道位于开口容器上方，所述开口容器盛有含有表面活性剂的油性液体；
[0055]c)将所述步骤b)中微管道一端开口在所述开口容器的液面表面上下往复振动，或者在液面以下左右往复振动，生成多个液滴，平铺在开口容器底部；
[0056]d)将所述步骤c)中开口容器中的多个液滴进行核酸扩增反应；
[0057]e)采集所述步骤d)核酸扩增反应后的产物信号，对核酸模板进行定量分析。
[0058]本发明涉及的领域为利用自动生成的液滴进行核酸定量分析的领域，具体涉及一种利用振动微管道生成大小可控液滴、并在其中进行核酸扩增反应及定量分析的方法。本申请提供的基于振动生成微液滴进行核酸物质数字定量分析的方法，具有操作简易快捷、能精确控制液滴体积、可检测范围广以及成本低等优点。
[0059]参见图1，图1为本发明实施例提供的数字核酸扩增方法的流程图，本申请实施例的方法依次包括:样品溶液制备、样品载入微管道、相界面振动制备液滴、液滴在储液池内反应和液滴在储液池内检测。
[0060]首先，本申请实施例配制待检测核酸扩增反应液，其包含待检测核酸模板、反应缓冲水溶液、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、引物、聚合酶和产物标记物质如荧光物质。同时，可配制阴性对照反应液，其中不加入模板。
[0061]在本申请中，所述待检测核酸扩增反应液即进行核酸分析的溶液，其是本领域技术人员常用的核酸扩增反应液，可以是以脱氧核糖核酸(DNA)为模板的核酸扩增反应液(可称为DNA扩增反应液)，也可以是以核糖核酸(RNA)为模板的逆转录核酸扩增反应液(可称为RNA反转录反应液)，还可以是其它核酸扩增反应液，如环介导等温扩增(LAMP)反应液。其中，所述DNA扩增反应液的特点是含有DNA扩增所需要的dNTP、缓冲液、无机盐离子、聚合酶、引物、待检测的DNA模板以及荧光染料或荧光探针等。所述RNA反转录反应液的特点是含有RNA反转录所需要的反转录酶、RNA抑制剂、缓冲液、无机盐离子、引物以及RNA模板等。反应液中的荧光染料或荧光探针能指示核酸扩增扩增，可以是SYBR Green等与DNA结合的荧光染料，也可以是同时含有荧光基团和淬灭基团的寡糖核苷酸探针，如TaqMan荧光探针等。
[0062]本申请优选将配制的核酸分析溶液如能够进行DNA扩增的反应液或RNA反转录的反应液，预先在离心管或其他容器中混合，以使反应液更均匀，并在反应液中加入荧光染料或焚光探针等。
[0063]制备好待检测核酸扩增反应液后，本申请实施例将其以一定流速通入或吸入两端均有开口的微管道中。本申请实施例可将装载反应液的微管道固定在振动设备上，并且一端管口悬于装有油相及一定浓度表面活性剂的开口容器正上方。或者，本申请实施例先将微管道固定于所述开口容器上方，再通过导管连接装载待分析目标分子与扩增引物、扩增酶等试剂的混合溶液即待检测核酸扩增反应液的注射泵，进行样品溶液的载入。
[0064]在本申请中，所述微管道可为注射开口微管道，能以固定流速注射一定体积的液体，如采用上端带储液仓、下端为垂直微管道的可装卸型微管道；也可以通过导管通入液体，如采用毛细管通过导管连接注射泵。所述微管道两端均有开口，一端开口用于载入反应液，另一端开口(即管口或管道出口)使所述反应液流出。所述微管道的优选构型为圆柱管开口或锥形开口，更优选为拉尖的锥形构型。在本申请的实施例中，所述微管道内径为5微米至250微米、优选40微米至200微米、更优选25微米至150微米、最优选10微米至100微米，且外径为10微米至500微米。为提高液滴产生的效率，本申请实施例可以采用I根加样微管道、8根加样微管道为一行，或者12根加样微管道为一列或者96根加样微管道阵列形式的微管道，通过同步振动同时生成液滴。
[0065]为了使生成的液滴更加均一，本申请可以对微管道出口的表面进行低表面能处理，即所述微管道优选为开口处经低表面能处理的微管道。所述低表面能处理可为低表面能涂层处理，或娃烧化处理，本申请优选采用全氟娃烧(如1H, I H, 2H, 2H-perf Iuorooctyltrichlorosilane, Fluorochem Ltd.，Derbyshire, UK)，对微管道如毛细管的外壁进行娃烧化处理；所述硅烷化处理为本领域技术人员熟知的技术手段。
[0066]本申请所述微管道内载入反应液，并能够连续或间歇地注射反应液。在本申请实施例中，微管道注射液体可以是伴随微管道口的运动连续注射，也可以是在微管道运动到任一特定位置点开始，按照设定流速和时间注射核酸扩增反应液。
[0067]在本申请中，作为优选，所述微管道的另一端连接有流体驱动设备；所述流体驱动设备为任意可能产生连续或间歇性核酸扩增反应液液流的流体驱动设备。本申请可以使用蠕动泵、注射泵、压力驱动泵、气压驱动泵或电渗驱动泵等，优选微量注射泵，精度较高且可设定注射体积至纳升级。本申请对微管道和流体驱动设备的连接方式没有特殊限制，如可以通过特氟龙(Teflon)毛细管连接，并保证密闭性。
[0068]本申请提供开口容器，其内预先装入比重低于水溶液的不互溶的油相，并能接受和储存微管道中注入的核酸扩增反应液的液滴。所述开口容器为任意能够存储微升至毫升体积液体的开口容器，可称为储液池。在本申请中，所述开口容器优选为一维或二维排列的储液池阵列，更优选为标准的平底24孔、96孔或384孔板。本申请可以利用多个储液池，分别存储一种特定大小的液滴，避免不同大小液滴的混合，从而实现对液滴大小的控制。
[0069]在本申请中，所述油相的特点是比重小于水溶液，以保证生成的水溶液液滴能够下沉；不能与储液池发生反应、化学性质稳定、不易挥发、没有荧光干扰等；需要加入一定的表面活性剂，以避免液滴之间的融合；也需要进行无菌处理。本申请对开口容器中的油性液体和表面活性剂没有特殊限制，采用本领域常用的即可。在本申请中，所述微管道位于开口容器的液面上方，所述微管道的开口端朝向开口容器的液面。
[0070]本申请将所述微管道一端开口在所述开口容器的液面表面有规律地上下往复运动，或者在液面以下左右往复振动，生成多个液滴，单层平铺铺满开口容器底部。具体的，本申请实施例通入核酸分析溶液的微管道朝开口容器运动，管道出口接触并进入开口容器中的油相载液液面，此时，微管道注射的溶液进入油相；随即微管道远离开口容器运动，管道出口脱离开口容器中的油相载液，此时，微管道口外的溶液被留在油相中，形成油相包裹水溶液的液滴，多次重复而形成大量大小均一的液滴，平铺于开口容器底部。并且，生成的液滴在开口容器底部之间单层排列，达到铺满底部的效果。
[0071]在本申请的一个实施例中，可以使用加样微管道上下往复振动或者96孔板上下往复振动的方式，这种往复式振动是为了使水相油相有序的接触和分离，从而完成油相对水相的切割。在本申请的另一个实施例中，还可以采用微管道相对于96孔板作水平往复运动，通过控制水平抖动的速度实现油相对水相的切割。本申请实施所述振动时，可以是开口容器位置固定，微管道做振动运动；也可以是微管道位置固定，开口容器做振动运动；还可以是两者相对振动。本申请实施例微管道出口在液滴收集储液池中的不互溶油相表面上下振动或者液面下左右振动，生成大小均一液滴，平铺于储液池底部。
[0072]本申请能够持续的以固定的频率和速率进行上下振动或左右振动，且振幅可调；本申请对所述振动的控制优选采用自动移动台操作的方式，所述上下往复振动或者左右往复振动的振幅优选为0.1毫米?10毫米，更优选为0.5毫米?5毫米。在本申请中，通过调整水相溶液的流动速度以及振动的频率，对生成液滴的大小、速度以及通量进行控制，液滴大小可以达到纳升甚至皮升级别，进而对样品中的低浓度至高浓度的核酸物质进行绝对定量分析。
[0073]生成液滴后，本申请实施例将装有液滴的开口容器进行大量液滴的同步核酸扩增反应。所述核酸扩增反应的条件等为本领域技术人员熟知的，本申请并无特殊限制。
[0074]核酸扩增反应结束以后，本申请实施例将所述开口容器取出，采集产物信号如荧光、紫外吸收、浊度等信号，进行核酸物质的定量分析。本申请实施例之前可根据液滴直径以及储液池底部的面积计算铺满底部所需要的液滴总体积，在信号读取和分析时，计算阳性液滴的数目，从而分析得到核酸模板的定量结果。
[0075]相应的，本申请提供了一种基于微液滴的数字核酸扩增定量分析系统，包括:
[0076]液滴生成装置；
[0077]核酸扩增控温装置，使所述液滴生成装置生成的多个液滴进行核酸扩增反应；和
[0078]产物信号采集装置，用于采集所述核酸扩增反应后的产物信号；
[0079]所述液滴生成装置包括:
[0080]开口容器，用于储存生成的多个液滴并提供进行核酸扩增反应的场所；
[0081]位于所述开口容器上方的微管道，所述微管道用于载入待检测核酸扩增反应液，其两端均有开口 ；和
[0082]用于驱动所述微管道往复振动的振动设备。
[0083]本申请提供的数字核酸扩增定量分析系统主要包括基于振动的液滴生成装置、核酸扩增控温装置和产物信号采集装置，其中的液滴生成装置包括开口微管道、用于液滴收集存储的开口容器和振动设备等，以实现上述数字核酸扩增定量分析方法。
[0084]本申请提供的数字核酸扩增定量分析系统包括液滴生成装置，参见图2，图2为本发明实施例提供的液滴生成装置的结构示意图。图2中，I为微管道，2为开口容器，3为振动设备，4为注射泵，5为核酸扩增反应后的开口容器。
[0085]在本申请中，所述液滴生成装置包括开口容器2，用于储存生成的多个液滴并提供进行核酸扩增反应的场所。所述开口容器与上文所述的开口容器一致，在此不再赘述。
[0086]所述液滴生成装置包括微管道1，位于开口容器2上方；所述微管道用于按照一定体积和流速载入待检测核酸扩增反应液，其两端均有开口。所述微管道与上文所述的微管道一致，在此不再赘述。
[0087]在本申请中，作为优选，所述微管道的另一端连接有流体驱动设备；所述流体驱动设备为任意可能产生连续或间歇性核酸扩增反应液液流的流体驱动设备。本申请可以使用蠕动泵、注射泵、压力驱动泵、气压驱动泵或电渗驱动泵等，优选微量注射泵，如图2中的注射泵4，精度较高且可设定注射体积至纳升级。本申请对微管道和流体驱动设备的连接方式没有特殊限制，如可以通过特氟龙(Teflon)毛细管连接，并保证密闭性。
[0088]所述液滴生成装置包括振动设备3，用于驱动微管道I往复振动。所述振动设备能够实现短行程高速往复振动，本申请可以使用电磁铁式、压电陶瓷式或机械偏心轮式振动设备。本申请所述振动设备的振动频率固定，可以通过调节输入电压控制其振幅，对输入电压的控制可选用电磁振动器、直线电机、伺服电机或步进电机。
[0089]本申请实施例所述液滴生成装置的操作流程为:微管道I固定于开口容器2的上方，通过导管连接装载核酸扩增反应液的注射泵4，由振动设备3控制微管道I管口的运动；启动注射泵4，并使微管道I出口在振动设备3的驱动下有规律的在油相液面上下往复运动或者在液面下左右往复运动，实现均一大小油包水微液滴的生成，再依靠重力的沉降作用，生成的液滴沉入开口容器2底部，并自动平铺为液滴阵列。
[0090]在本申请中，所述数字核酸扩增定量分析系统包括核酸扩增控温装置，能够精确控制并保持核酸扩增反应所需要的温度，使所述液滴生成装置生成的多个液滴进行核酸扩增反应。在本申请中，所述核酸扩增控温装置可以是水浴锅、金属浴设备、温箱或核酸扩增仪，优选为PCR仪。本申请实施例可将装有液滴的开口容器4置于PCR控温装置，进行大量液滴的同步核酸扩增反应，得到核酸扩增反应后的开口容器5。
[0091]所述数字核酸扩增定量分析系统包括产物信号采集装置，用于采集所述核酸扩增反应后的产物信号。所述产物信号采集装置可以仅采集液滴的荧光、紫外吸收、浊度等信号，也可以既采集信号又读取分析信号。在本申请中，所述产物信号采集装置可以是光学显微成像系统、荧光扫描仪或集成化图像传感器如集成化高灵敏度图像传感器等本领域技术人员熟知的信号采集装置，优选为荧光显微成像系统，可观察液滴发荧光的现象，并通过统计荧光液滴的总数而反映起始核酸扩增反应液中模板DNA的数量。本申请实施例可以直接采用图像传感器成像，一次性获得所有液滴的信号，再进行液滴信号的分析，检测分析方法比较简便。
[0092]本申请将无需微流控芯片的可自动化的液滴生成装置与数字核酸扩增反应巧妙结合，使数字核酸扩增操作简易快捷，无需任何复杂芯片结构和微流控液滴生成液路，极大地降低了成本。基于振动生成液滴的装置和方法可以通过调节流体的注射流速和微管道的运动而精确控制所生成的液滴的体积和数量，液滴大小可以方便调控，可生成纳升甚至皮升级均一液滴，本申请应用于核酸扩增检测的范围很大。因此，本申请既综合了液滴生成装置的高效率、高通量和可控性强的优势，又兼具数字核酸扩增低浓度定量检测的特点，为低浓度、稀有样品如DNA定量检测及其后续全基因组测序、单核苷酸多态性(SNP)分析、拷贝数变异、基因点突变、多重基因表达分析等提供良好的操作平台。
[0093]为了进一步说明本申请，下面结合实施例对本申请提供的一种基于微液滴的数字核酸扩增定量分析方法及系统进行具体地描述，但不能将它们理解为对本申请保护范围的限定。
[0094]实施例1
[0095]振动设备为一电磁打点计时器，由电压6V、频率为50Hz的交流电源供电。接通电源后，电磁打点计时器的振动片以每秒50次的频率振动。振动的幅度4_。所使用的微管道为长5cm、内径为75 μπκ外径为150 μπι的拉尖的石英毛细管，拉尖处的内径为30微米、外径为60 μπι。石英毛细管的一端通过内径300 ym的Teflon管连接充满矿物油的50 μ L微量注射器(上海高鸽)，毛细管和Teflon管连接处用环氧树脂胶密封。微量注射器固定在微量注射泵(哈佛仪器，美国)上，按设定流速抽拉或注射固定体积样品。所采用的储液池为透明聚苯乙稀平底96孔板，每个储液池的体积为200 yL，内径为8_ ;并在储液池内加Λ 150 μ L矿物油作为液滴覆盖相。
[0096]利用微量注射泵将微量注射器内的矿物油注入Teflon管和石英毛细管，排出气泡。将300ng/ μ L的λ -DNA进行16倍稀释，在PCR仪(Mastercycler，艾本德公司，德国)中进行变性，程序设置为95°C、10分钟，程序结束后迅速将模板取出置于冰上保存。
[0097]按以下比例配制LAMP反应液:2 X反应缓冲液12.5 μ L，引物FIP和BIP各40pmol，Loop-F 和 Loop-B 各 20pmol，F3 和 B3 各 5pmol，酶溶液 I μ L，Calcein I μ L，预变性的λ -DNA I μ L，10mg/mL的BSA溶液3 μ L，用灭菌水补足25 μ L。在96孔板的孔中加入300 yL含有3% ABIL EM90 (赢创德固赛公司，德国)的矿物油。
[0098]添加的六种LAMP 扩增引物序列为:FIP:CAGCA TCCCT TTCGG CATAC CAGGTGGCAA GGGTA ATGAGG ；BIP:GGAGG TTGAA GAACT GCGGC AGTCG ATGGC GTTCG TACTC ；F3:GMTG CCCGT TCTGC GAG；B3:TTCAG TTCCT GTGCG TCG ;Loop-F:GGCGG CAGAG TCATAAAGCA；Loop-B:GGCAG ATCTC CAGCC AGGAA CTA。
[0099]将如上配制的25 μ L的LAMP反应液通过微量注射泵吸入石英毛细管及与石英毛细管相连的300 μπι内径的尖端，使石英毛细管头和连接石英毛细管的尖端垂直固定在振动器的振片上，并悬于平底96孔培养板的一个储液池内矿物油液面的正上方。
[0100]上下调节石英毛细管尖端，使其距矿物油液面上方I毫米。将振动器接通电源，振片携带石英毛细管以50ΗΖ的频率上下振动，振动幅度为2毫米，石英毛细管口在矿物油液面上下振动。调节装有注射器的注射泵流速为100nL/S，加注总体积为4yL，开启注射泵后，液滴开始在矿物油中生成，在加注4 μ L以后，生成的液滴能铺满整个孔的底部的90%。液滴体积参见图3，图3为本发明实施例1?4中流速与生成液滴体积的关系图。
[0101 ] 停止注射泵和频率发生器，将96孔板平放于PCR仪中，调节温度至63°C，进行大量液滴的同步核酸扩增反应，反应I小时后取出。
[0102] 将96孔板放于倒置光学显微成像系统(型号为Eclipse，尼康公司，日本)上，用2倍物镜在明场下观察孔中液滴的状态，结果如图4所示，图4为本发明实施例1生成的液滴平铺于96孔板其中一孔底部的显微视图。切换至绿色荧光通道再次观察孔中液滴的状态，结果如图5所示，图5为本发明实施例1扩增之后的液滴在GFP通道中的荧光图。观察液滴发荧光的现象并统计荧光液滴的总数，总数为306，该数目反映了起始模板DNA的数量。
[0103]实施例2
[0104]按照实施例1的方法，获得体积为4nL的液滴并进行核酸扩增反应；区别在于，注射泵的流速为200nL/s。
[0105]生成的液滴参见图6，图6为本发明实施例2生成的液滴的显微视图；液滴体积参见图3。产生荧光信号的液滴参见图7，图7为本发明实施例2?4不同体积的液滴反应后的示意图。
[0106]实施例3
[0107]按照实施例2的方法，获得体积为1.7nL的液滴并进行核酸扩增反应；区别在于，注射泵的流速为80nL/s，加注体积为2.5 μ L。
[0108]生成的液滴参见图8，图8为本发明实施例3生成的液滴的显微视图；液滴体积参见图3。产生荧光信号的液滴参见图7。
[0109]实施例4
[0110]按照实施例2的方法，获得体积为0.25nL的液滴并进行核酸扩增反应；区别在于，注射泵流速为10nL/s，加注体积为I yL。
[0111]生成的液滴参见图9，图9为本发明实施例4生成的液滴的显微视图；液滴体积参见图3。产生荧光信号的液滴参见图7。
[0112]由以上实施例可知，对于相同模板浓度的样品，在含不同体积的液滴的微坑内，产生荧光信号的液滴的数量和比例不同，如图7所示。本申请通过多种体积液滴的分别生成，并统计液滴的体积和数量，可以提高数字核酸扩增线性范围，从而能得到更加精确、检测线性范围更广的数字核酸扩增核酸绝对定量分析结果，有利于在临床病毒载量分析、突变检测和拷贝数差异等方面的应用。
[0113]实施例5
[0114]采用实施例1中的设备，在矿物油液面以下水平振动生成水的液滴，具体操作为:
[0115]将Teflon管内充满水，一端连接充满矿物油的50 μ L微量注射器，另一端连接拉尖的毛细管。将毛细管垂直扎入矿物油中，接通电源，调节电源频率为固定50Hz，调节电压为3V，使毛细管在矿物油中水平振动，液滴的生成参见图10，图10为本发明实施例5毛细管在矿物油液面以下水平振动生成液滴的示意图。图10中，I为毛细管，2为储液池。在此电压下振幅为2mm，开启注射泵，以50nL/s的流速注入水，此条件下生成的液滴如图11所示，图11为本发明实施例5生成的液滴的显微视图。
[0116]实施例6
[0117]按照实施例5的方法，获得纯水液滴。区别在于，调节电压为5V，振幅为3_。
[0118]此条件下生成的液滴如图12所示，图12为本发明实施例6生成的液滴的显微视图。
[0119]实施例7
[0120]按照实施例5的方法，获得纯水液滴。区别在于，调节电压为7V，振幅为4_。
[0121]此条件下生成的液滴如图13所示，图13为本发明实施例7生成的液滴的显微视图。
[0122]实施例8
[0123]图14为本发明实施例8所采用的一种可快速装卸的一次性或多次使用带储液仓式微管道的正视图，图15为本发明实施例8所采用的一种可快速装卸的一次性或多次使用带储液仓式微管道的剖视图。图14和图15中，I为微管道，2为样品存储仓，3为待测样品，4为矿物油。微管道的构造与一次性注射器针头相似。微管道材质为不锈钢，内径为60微米，外径为200微米，管长2厘米。微管道I上方为样品存储仓2，其内径为4毫米，体积为150微升；腔体底部为锥形，以保证存储仓不存在样品残留死角，所有样品都能形成液滴并进入液滴储液池。
[0124]使用时，微管道储液仓2内先加入50微升样品溶液3，再在样品3上方加入100微升矿物油4。由于矿物油比重比水轻，微管道内的样品溶液位于底部，并充满微管道。在加样时，只需将储液仓固定在4毫米直径的流体驱动输出口上，即可开始注射样品，生成液滴。
[0125]本实施例由于采用了锥形构造的样品存储仓，样品溶液能够完全从微管道向外注射，不存在样品残留和死体积。
[0126]实施例9
[0127]微管道振动驱动采用电磁振动臂，振动频率为50Hz，振动幅度为5mm。振动臂上固定一维阵列式微管道，加样器具有I个管状入口、I个长方形的连通腔体和8个管状出口，间距为9mm，每个管状出口接一个液滴生成微管道，如图16所示，图16为本发明实施例9提供的液滴生成装置的结构示意图。图16中，I为微管道阵列，2为标准96孔板，3为振动臂。其中，微管道出口齐平，规格如实施例8所采用的带样品存储仓式微管道；存储仓内加入20微升液滴相样品。微管道I在振动臂3上的排列是8个一排，与下方孔内预先加入100微升矿物油的96孔板的8个竖排孔一一对齐。即，在微管道阵列I下方为一水平放置的标准96孔板2，孔内径为8mm，孔体积为200微升，每个小孔内加入100微升轻质矿物油。阵列微管道的出口对准一排孔，并使微管道靠近孔内矿物油液面2mm;振动臂中充满矿物油。
[0128]开始操作，入口与气压驱动装置(为氮气钢瓶带调压阀，未在图16中显示)连接，驱动一维阵列注射，振动臂带动8根针振动；在振动臂以50赫兹的频率振动，8个微管道在矿物油和空气的界面上上下振动，分别以每秒50个的速度同时生成液滴，即在96孔板的一个竖排孔内产生液滴。完成以后，振动臂抬起，向96孔板的下一个8孔竖排方向移动并与孔一一对齐，并使微管道距离矿物油液面2_，重复前面的振动生成液滴的操作，完成以后继续向下一排移动，一共生成12排，就可以完成一个96孔板液滴的生成。
[0129]实施例10
[0130]振动设备为电磁振动臂，振动频率为50Hz，振动幅度为5mm。振动臂上固定一维阵列式微管道，加样器具有I个管状入口、I个长方形的连通腔体和12个管状出口，间距为9mm，每个管状出口接一个液滴生成微管道，如图17所示，图17为本发明实施例10提供的液滴生成装置的结构示意图。图17中，I为微管道，2为标准96孔板，3为振动臂。其中，微管道出口齐平，规格如实施例8所采用的带储液仓的微管道；储液仓内加入20微升液滴相样品。微管道I在振动臂3上的排列是一排12个，与下方孔内预先加入100微升矿物油的96孔板的12个横排孔对齐。即，在加样器I下方为一水平放置的标准96孔板2，孔内径为8mm，孔体积为200微升，每个小孔内加入100微升轻质矿物油。阵列微管道的出口对准一排孔，并使微管道靠近孔内矿物油液面2mm ;振动臂中充满矿物油。
[0131]开始操作，入口与气压驱动装置(为氮气钢瓶带调压阀，未在图17中显示)连接，驱动一维阵列注射，振动臂带动12根微管道振动；在振动臂以50赫兹的频率振动，8个微管道在矿物油和空气的界面上上下振动，分别以每秒50个的速度同时生成液滴，即在96孔板的一个横排孔内产生液滴。完成以后，振动臂抬起，向96孔板的下一个12孔横排方向移动并与孔一一对齐，并使微管道距离矿物油液面2mm，重复前面的振动生成液滴的操作，完成以后继续向下一排移动，一共生成8排，就可以完成一个96孔板液滴的生成。
[0132]以上两个实施例通过一维阵列化设计，使多根微管道组成的注射针头等间距排列，同时向阵列微坑中生成液滴，利用同步制备提高液滴生成的通量，实现多样品同时分析，降低系统的成本。
[0133]实施例11
[0134]参见图18和19，图18为本发明实施例11提供的二维阵列式液滴大批量同时生成装置的结构示意图；图19为本发明实施例11提供的二维阵列式液滴大批量同时生成装置的剖面示意图。图18和19中，I为加样微管道，2为96孔板，3为振动臂。加样器为8X12的二维阵列式微管道；96根微管道的构造同实施例8。加样器的外部尺寸为12cmX8cm，厚5mm,内部为一矩形的中空腔体。加样器下方为与腔体相连的微管道固定管，间距为9_，阵列大小为12X8，内径为4mm，外径为6mm。每个固定管上固定一个加样针头，微管道规格如实施例8，末端齐平；微管道排列与标准96孔板相对应。每一根微管道与下方孔内预先加入100微升矿物油的96孔板的96个孔一一对齐，并使微管道距离矿物油液面2mm。
[0135]使用时，振动臂带动96根微管道以50Hz的速度振动，在96孔板的每一个孔内同时以每秒50个的速度广生液滴。完成以后，振动臂抬起，下面可以换另外一块装有100微升矿物油的96孔板，重复上面的液滴生成操作。
[0136]实施例12
[0137]本实施例的装置与实施例11相同，如图20所示，图20为本发明实施例12提供的二维阵列式液滴大批量同时生成装置的结构示意图。图20中，I为加样微管道，2为96孔板，3为振动臂。
[0138]本实施例与实施例11的区别在于，阵列式微管道保持不动，使其下面的装有100微升矿物油的96孔板进行上下振动而生成液滴。
[0139]由以上实施例可知，本申请将所述液滴自动生成方法或装置与数字核酸扩增技术两者结合，利用了数字核酸扩增的特点，实现了在微体系中低浓度核酸物质的定量检测；同时利用相界面振动，快速将微升体积的待测样品分割成皮升至纳升体积的均一液滴，不需要任何芯片结构就可以快速高效地完成数字核酸扩增功能，避免了繁杂的芯片制作和微流控液路的集成工艺。因此，本申请提供的核酸扩增定量分析方法操作简便，效率高，成本低，是一种简易便捷、高灵敏度的核酸物质数字定量分析方法，具有无可估量的科研价值和市场前景。
【权利要求】
1.一种基于微液滴的数字核酸扩增定量分析方法，包括以下步骤: &)配制待检测核酸扩增反应液，所述待检测核酸扩增反应液包含待检测核酸模板、反应缓冲水溶液、脱氧核糖核苷三磷酸、引物、聚合酶和产物标记物质； 幻将所述步骤4配制的待检测核酸扩增反应液载入两端均有开口的微管道，所述微管道位于开口容器上方，所述开口容器盛有含有表面活性剂的油性液体； 0)将所述步骤4中微管道一端开口在所述开口容器的液面表面上下往复振动，或在液面以下左右往复振动，生成多个液滴，平铺在开口容器底部； (1)将所述步骤0中开口容器中的多个液滴进行核酸扩增反应； 6)采集所述步骤(1)核酸扩增反应后的产物信号，对核酸模板进行定量分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4中，所述待检测核酸扩增反应液为以脱氧核糖核酸为模板的核酸扩增反应液、以核糖核酸为模板的逆转录核酸扩增反应液或环介导等温扩增反应液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤0中，所述上下往复振动或者左右往复振动的振幅为0.1毫米?10毫米。
4.一种基于微液滴的数字核酸扩增定量分析系统，包括: 液滴生成装置； 核酸扩增控温装置，使所述液滴生成装置生成的多个液滴进行核酸扩增反应；和 产物信号采集装置，用于采集所述核酸扩增反应后的产物信号； 所述液滴生成装置包括: 开口容器，用于储存生成的多个液滴并提供进行核酸扩增反应的场所； 位于所述开口容器上方的微管道，所述微管道用于载入待检测核酸扩增反应液，其两端均有开口 ；和 用于驱动所述微管道往复振动的振动设备。
5.根据权利要求4所述的系统，其特征在于，所述开口容器为一维或二维的储液池阵列。
6.根据权利要求4所述的系统，其特征在于，所述微管道具有圆柱管开口或锥形开口；所述微管道内径为5微米至250微米，且外径为10微米至500微米。
7.根据权利要求5所述的系统，其特征在于，所述微管道为1根加样微管道、8根加样微管道、12根加样微管道或者96根加样微管道阵列。
8.根据权利要求4所述的系统，其特征在于，所述振动设备为电磁铁式、压电陶瓷式或偏心轮式电机振动设备。
9.根据权利要求4所述的系统，其特征在于，所述核酸扩增控温装置为水浴锅、金属浴设备、温箱或核酸扩增仪。
10.根据权利要求4所述的系统，其特征在于，所述产物信号采集装置为光学显微成像系统、荧光扫描仪或集成化图像传感器。
【文档编号】C12M1/38GK104450891SQ201410655309
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月17日 优先权日:2014年11月17日
【发明者】杜文斌, 李昂, 徐鹏, 盛广济 申请人:中国科学院微生物研究所