用于扩增核酸的方法

专利名称：用于扩增核酸的方法
技术领域：
本发明涉及将来自样品的靶标核酸与固体支持物上的捕获核酸杂交，以及涉及扩增所述杂交的核酸。
背景技术：
Illumina Solexa, AB SOLiD和Roche454的第二代测序技术通过在大量平行的模式中运作从而实现了其高通量以及相对低廉的每个测序碱基的成本。其创建了总输入DNA的许多随机片段，在珠上或者在阵列上分别扩增每个片段，在单一流通室内读取那些序列，并且能够通过将所有的单个读数与参照基因组序列匹配从而仅仅检测突变(Margulies Met al.(2005) Nature437, 376-380)。此运作方式具有的缺点是对许多基因组中不相关的部分也进行了测序。这在临床测序中尤其突出，其中通常仅有几十个至几百个基因的组才是与诊断相关的。因此，目前使用不同的技术以便在将样品引入测序仪之前选择基因组DNA中相关的部分。最常见地，是将DNA杂交至微阵列上特异性结合相关部分的捕获探针。在第二步中，将未结合的不相关部分洗掉，随后将结合的片段洗脱并准备载入测序仪(Okou D.e t al.(2007) Nat Methods4, 907-909)。通常，基因组的 0.1%_1% 的革巴标部分能够在预先选择的样品中被富集至60-80%。以此种流程，信息的处理并非最佳。在阵列上进行预先选择期间，关于DNA片段的基因组位置信息是可以利用的，因为它们特异性地结合至空间上分离的探针并且是可以被鉴别的。然而，阵列的洗脱是在单一室内进行的过程，由此所有被选择的片段又再次混合。因此，在测序后必需将所有的读数单独地与完整的参照序列进行匹配，这需要大量的计算工作。如果可以将基因组信息从阵列预先选择保留至测序反应，则会显著地降低对计算的要求。保留此信息的最简单方式是在相同表面上的同一位点进行预先选择和测序。此方法在美国申请US2009/0117573中有描述。由于目前的测序技术需要扩增每个单独的DNA片段以便在测序期间获得足够的信号，此扩增在相同的位点发生。基于桥式扩增(bridge amplification)技术的原理，描述了解决此问题的方法，其中所述桥式扩增技术是表面附着的扩增(例如Illumina的测序技术)。这可以在任何固体表面(载片、载体等)上进行，只要能够辨别出单独扩增的群落。在这些方法中，在可进行测序前使用了不同的杂交、延伸和连接的步骤。仍旧需要更加有效和快捷的方法。发明概述本发明特定的和优选的方面在所附的独立和从属权利要求中给出。从属权利要求的特征可以视情况与独立权利要求的特征以及与其它从属权利要求的特征组合，而并不仅仅如权利要求中所给出的那样。本发明描述了用于直接在捕获探针的位点上对捕获的靶标核酸片段进行扩增和测序的方法。在这些方法中，将发夹衔接子连接至探针-靶标双链体，其可以被用作人工桥。特异性的捕获探针则成为桥式扩增所需的单一引物。本发明涉及用于扩增靶标核酸的方法，所述方法包括如下步骤:a)提供具有多个核酸捕获探针的支持物，其中所述多个探针通过核酸的5’末端固定在支持物上，b)将靶标核酸与捕获核酸探针杂交以形成探针/靶标复合物，c)用聚合酶延伸捕获探针核酸，其中靶标核酸被用作捕获探针核酸延伸的模板，d)将经延伸的靶标/探针双链核酸连接至发夹核酸，其中将发夹核酸的5’末端连接至经延伸的探针的3’末端并且将发夹核酸的3’末端连接至靶标核酸的5’末端，e)使靶标核酸的3’末端结合至所述支持物上的所述多个核酸捕获探针中的另外的探针，f)通过聚合酶延伸所述另外的探针的3’末端，g)通过重复步骤e)和f)扩增步骤f)中所获得的核酸在其它特定的实施方案中，步骤c)中的聚合酶不具有末端转移酶活性或3’至5’校正外切核酸酶活性并且其中所述发夹核酸形成平端茎。例如，步骤c)中的聚合酶是Pfu (激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)) DNA 聚合酶。在特定的实施方案中，步骤c)中的聚合酶具有3’末端转移酶活性，导致在双链核酸的3’末端的突出端，并且其中所述发夹核酸具有5’突出端，与双链核酸的3’互补。例如，步骤c)中的聚合酶是Taq (水生栖热菌(Thermophilus aquaticus)) DNA聚合酶，生成一个腺嘌呤的3’突出端，并且其中发夹的5’突出端是一个胸腺嘧啶核苷。在本发明另外的优选实施方案中步骤c)中的聚合酶是Klenow聚合酶。此酶可在存在单一类型的核苷酸时使用，沿着捕获的片段序列生成一系列相同的核苷酸。在另外的特别 优选的实施方案中，所述单一类型的核苷酸是dTTP。在另外的优选实施方案中，步骤d)的将经延伸的靶标/探针双链核酸连接至发夹核酸是在连接反应中存在PEG8000时进行的。在特别优选的实施方案中，步骤d)的将经延伸的靶标/探针双链核酸连接至发夹核酸是在连接反应中存在5%的PEG8000 (40w/v)时进行的。在另外的特定实施方案中，用具有3’末端转移酶活性的酶进一步处理双链平端核苷酸。在本发明方法特定的实施方案中，靶标核酸是DNA.
在本发明方法另外的特定实施方案中，发夹核酸在其环中包含用于罕见的限制性内切核酸酶的序列。在另外的特定实施方案中，支持物是平面支持物(planar support),包含不同的区别(distinct)区域，每个区域包含多个不同的探针。在本发明方法特定的实施方案中，支持物是微载体，其中所述微载体包含多个一种核酸捕获探针(a plurality of one nucleic acid capture probe)。本文中的微载体任选包含可检测的标记，其中所述可检测的标记限定了附着至微载体的捕获探针的序列。在本发明方法另外的特定实施方案中，在步骤g)中的扩增之后进行相应于靶标核酸的核酸序列确定，以及还包括将确定的序列与平面支持物上的区域或微载体上的标记相关联的步骤。附图简述本发明上文以及其它的特性、特征和优势将通过如下的详细描述结合附图而显现，其通过实施例的方式说明了本发明的原理。本说明书仅仅是为了进行举例说明，而并非是要局限本发明的范围。如下所引用的参考图是指所附的图片。

图1显示了本发明所描述的方法的实施方案。A)靶标DNA的杂交；B)捕获探针的延伸；C)发夹的连接；D)变性与重退火；E)桥式扩增；F)线性化;G)序列确定。图2显示了图1的C部分所描述的方法步骤实施方案的两个实施例。左半部分说明了用不具有末端转移酶活性或具有3’至5’外切核酸酶活性的酶所进行的延伸，其中生成了平端双链DNA用于与平端发夹核酸连接。右半部分说明了用具有3’末端转移酶活性的酶如Taq DNA聚合酶所进行的延伸，其中产生了具有单一腺嘌呤3’突出端的双链用于与具有单一 5’胸腺嘧啶核苷突出端的发夹核酸连接图3显示了比较实例，其中对于将发夹连接至单链DNA的连接效率(左半部分)和将平端发夹连接至平端双链DNA的连接效率进行了比较。图4说明了使用Klenow聚合酶和单一类型核苷酸的引物延伸实施方案。图5显示了在与荧光标记的发夹连接之后的荧光测量，其中以不同的核苷酸使用Klenow聚合酶。图6显示了在用dATP或dTTP进行末端修复之后用dNTP_C*混合物所获得的实验结果，表明4nt的突出端完全是由dATP或dTTP所填充的。获得了参照(用dNTP-C*末端修复)的荧光点(中间的两排)，但是当用未标记的ATCG进行初始末端修复时，仅仅获得A或者仅仅获得T核苷酸而未从dNTP- C*混合物获得荧光信号。这表明末端在初始末端修复反应中已经完全填充，而与此反应中所使用的核苷酸无关，因为在第二个反应中并没有经标记的C-核苷酸被构建进去。在不同的附图中，相同的参照标记指代相同的或者相似的元件。本发明将依照特定的实施方案并参考某些附图来进行说明，但是本发明并不局限于此，而是由权利要求所限定。权利要求中的任何参照标记不应被理解为对范围的限定。所描述的附图仅仅是示意图并且是非限定性的。在附图中，基于说明的目的，一些元件的尺寸可以是被扩大的而并非按照比例描绘。当本发明的说明书和权利要求中使用术语“包含”时，其并不排除其它的元件或步骤。当使用不定冠词或者定冠词(例如"a"或"an"、"the")描述单数名词的时候，其包括了该名词的复数，除非另有其它具体陈述。此外，说明书和权利要求中的术语第一、第二、第三等，是用于区别类似的元件而并不必然用于描述排序顺序或时间顺序。应理解所使用的术语在适当的情况下可以互换，并且本文所描述的本发明的实施方案能够用于本文所描述的序列之外的其它序列。以下所给出的术语或定义仅仅用于帮助理解本发明。这些定义不应被理解为其具有的范围小于本领域技术人员所理解的范围。实施方案详述定义“捕获探针”或“捕获寡核苷酸”是指附着于固体支持物的核酸。“靶标DNA”或“靶标核酸”是指从样品中获得的核酸。“核酸”是指DNA以及RNA，并且可以含有非天然存在的核苷酸或修饰。“校正(proofreading) ”是用于具有3’至5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶的背景。
“黏着(Sticky) ”是指双链核酸的末端其中5’或3’末端具有一或多个核苷酸的延伸而其并未形成碱基对。其与“平端(blunt)”相反，平端中末端的5’核苷酸与3’末端核苷酸形成碱基对。“发夹核酸”是指具有在3’末端在5’末端的回文序列从而形成分子内碱基对的寡核苷酸。这些碱基对序列代表了“茎(stem) ”。在这些回文序列之间存在保持不配对的核苷酸区段，形成环。环和茎形成类发夹的结构。本发明所使用的"(微)载体"涉及具有0.1至1000微米直径的固体颗粒。同义词有〃(微)珠〃，〃(微)颗粒"或〃(微)球〃。微珠的形状并不看作是对本发明的限制。本发明描述的方法涉及固体支持物上靶标核酸的扩增。从前的扩增方法使用溶液中的引物，导致在溶液中相等的扩增产物。近来的扩增方法使用附着至支持物的引物，从而使扩增的产物保持相等地附着至支持物。这在多重方法(multiplexing method)中具有优势，因为用不同的引物所获得的不同的扩增产物保持附着在支持物上。这使得可以将扩增的产物与支持物上引物的位置相关联。可以设想不同的方式来提供支持物上的引物。在某些实施方案中，将引物附着至阵列上专门的位置。现代固定技术使得可以将高达数百万的不同的引物附着至I至100 μ Hi2范围的表面上。或者，可以将引物附着至玻璃的、塑料的或金属的微颗粒。在某些实施方案中，此种颗粒是磁性颗粒，使得可以在磁场中进行操作。可以用光学条形码、图案、文字数字编码、颜色(例如量子点(quantum dot))等来标记微颗粒，以便鉴别出微颗粒和已经附着至该微颗粒的引物。本发明描述的方法不依赖于使用PCR反应中通常所用的寡核苷酸对。在本发明的方法中，通过5’末端将寡核苷酸附着至支持物。这些探针还称作“捕获探针”。本发明所使用的核酸捕获探针通常具有大约15至150个核苷酸的长度，例如20至1000个核苷酸或20至个核苷酸，以使得可以特异性地结合至设想的靶标核酸而没有或很少有错配。在本发明方法另外的步骤中，将靶标核酸杂交至核酸捕获探针。相同序列的多个探针被应用为支持物上的位点，从而使几千、几万、几十万或几百万拷贝出现在彼此附近，使得可以进行本发明所进一步解释的克隆扩增。此种位点的形状可以是圆形、矩形、椭圆形、楔形，并通常具有100 μ m2至10.000 μ m2、I至100 μ m2,或者甚至0.1至I μ m2的面积。根据位点的尺寸以及其在支持物上的密度，高达100，000、500，000、I百万、2百万、5百万、I千万、2千万、5千万或者甚至I亿个不同的位点可以应用于支持物上，每个位点包含多个相同的祀标探针。靶标核酸通常源自基因组DNA并且通过机械方法(例如超声处理、剪切)，化学方法(用金属复合物或酸处理)或酶方法(用普通限制性内切核酸酶或者DNase短暂消化以及用“罕见切割(rare cutter) ”酶集中消化)来制备。基因组DNA片段的平均长度通常在50至5000bp之间变化，通常在100至500之间，例如大约200bp。基因组DNA与捕获探针的杂交在微阵列技术中熟知的标准条件下发生。
在另外的实施方案中，将RNA (例如mRNA或miRNA)杂交至DNA捕获探针。用具有反转录酶活性的酶来延伸捕获探针，导致DNA-RNA杂化物(hybrid)。另外的步骤类似于对DNA靶标和DNA捕获探针所述的那些步骤。靶标DNA和捕获探针的杂化物可以包含捕获探针的部分，其仍旧是单链的或者可以包含一部分单链靶标DNA从捕获探针的5’末端延伸。但是这对本发明方法的其它步骤并没有影响。在本发明方法另外的步骤中，用聚合酶在捕获探针的3’末端对其进行延伸。本文中靶标核酸被用作捕获探针延伸的模板。根据所使用的聚合酶，另外两个实施方案是可能的。A)没有末端转移酶活性或具有校正活性的聚合酶。用这些DNA聚合酶 进行的DNA聚合导致具有平端的双链DNA，在3’末端没有突出端或者隐性(recessive)末端。此类别中的酶例如有Klenow聚合酶以及在95° C以下具有聚合酶活性的若干种聚合酶如Pfu聚合酶。作为结果，生成了具有捕获探针的延伸的3’末端和靶标DNA的原始5’末端的平端双链核酸。如上文所解释的，根据所形成的杂化物的类型，也可以发生靶标DNA的3’末端的延伸。在平端双链连接中可以无需其它步骤而使用通过这些酶所获得的经延伸的平端DNA。在此种实施方案中，将平端发夹连接至经延伸的靶标/探针核酸，其中将发夹核酸的5’末端连接至经延伸的靶标探针核酸的3’末端，并且其中将发夹核酸的3’末端连接至靶标核酸的5’末端(参见图2，左半部分)。B)具有末端转移酶活性和不具有校正活性的聚合酶.
DNA聚合酶如Taq聚合酶，不具有上文所述的外切核酸酶活性但是却具有3’末端转移酶活性，由此并入了额外的突出端核苷酸。使用Taq聚合酶获得一个腺嘌呤的3’突出端。因此，用这些聚合酶进行的DNA聚合导致黏附末端。根据这些特定的实施方案，使用了发夹核酸，其在其茎之上具有5’突出端，与DNA聚合酶所产生的3’突出端互补(参见图2，右半部分)。在其中使用Taq聚合酶并获得一个腺嘌呤的3’突出端的实施方案中，具有胸腺嘧啶核苷的5’突出端的发夹核酸被连接。此连接类似于所谓的TA克隆，其中将PCR产物克隆至具有5’ T突出端的载体内(Invitrogen的TA克隆试剂盒)。此种单一核苷酸的连接被认为比平端双链DNA的连接更有效率。然而，除了在克隆具有黏附末端的DNA时的优势之外，诸如Taq聚合酶的酶具有缺点，也即其聚合的出错率相较于校正酶要高得多。在测序计划中，用黏附末端所获得的连接效率的改善，可以弥补DNA聚合酶的出错率，因为连接在样品中以低频率出现的靶标DNA的机会会增加。在序列的准确性更加关键的方法中，例如在遗传诊断中，聚合酶的校正方面则会优于其它类型聚合酶的末端转移酶活性。在需要额外的方法步骤的另外的实施方案中，可以利用两种酶的优势。本文中使用靶标DNA对捕获探针的延伸是由校正酶来进行的，从而生成具有最少量错误的序列。用具有末端转移酶活性的聚合酶以及适当的dNTP来进一步处理生成的平端双链核酸，得到具有3’突出端的黏附末端使得可以进行黏附末端连接。在另外的实施方案中，步骤c)中所使用的聚合酶可以是Klenow聚合酶。此酶可在存在单一类型的核苷酸(例如dATP、dGTP、dCTP、dTTP)时使用。由此可以沿着捕获的片段序列生成一系列相同的或类似的核苷酸。优选使用单一核苷酸如dATP和dTTP。最优选一起使用Klenow聚合酶和dTTP。在本发明对发夹结构进行后续连接的另外的具体实施方案中，当加入与捕获的片段最后的核苷酸互补的序列特异性核苷酸时，可以改善结果。序列特异性核苷酸可以是A、G或C。因此，在具体的实施方案中，Klenow聚合酶可以与dTTP和dATP的组合、或者与dTTP和dGTP的组合、或者与dTTP和dCTP的组合一起使用。在另一实施方案中，在存在高分子量的聚合物分子的情况下进行步骤d):将延伸的靶标/探针双链核酸连接至发夹核酸。特别优选在连接反应中使用PEG8000。特别优选在存在大约2%至15%的PEG8000 (40w/v)时将经延伸的靶标/探针双链核酸连接至步骤d)的发夹核酸，更优选在存在大约3%至7%的PEG8000 (40w/v)时进行，更优选在存在大约5%的PEG8000 (40w/v)时进行。在这些步骤中，其中在用聚合酶延伸之后立即用发夹核酸进行连接，这与如Affymetrix的‘573申请中所描述的现有技术的方法有很大的不同。在现有技术中，发夹的连接之后总是进一步延伸发夹核酸。现有技术中尚未理解或者设想连接发夹(平端或具有5’突出端)从而获得不需要进一步延伸的双链核酸的可能性。此种不同使得可以显著缩短进行方法的所有步骤所需的时间，因为在连接反应后无需进行额外的延伸步骤。另外，已经证实用发夹核酸连接双链核苷酸核酸的产率，高于用发夹连接自由的、单链3’末端的产率。以此种方式，测序计划会使样品中存在的靶标DNA表现出更多的部分(fraction)。在用发夹核酸连接之后， 本发明所述的方法得到了始于支持物上在捕获探针的5’末端沿原始捕获探针序列的连续序列、经延伸的捕获探针序列、源于发夹的序列、以及如现有技术中所获得的截至靶标序列3’末端的靶标DNA序列。与现有技术中类似，此序列适于桥式扩增以及后续的序列确定。桥式扩增在现有技术中是已知的，例如US6300070、Westin et al.(2000)Nat.Biotechnol.18，199-204、Walker et al., (1992) Proc Natl Acad Sci USA89; 392-396、Shapero et al., (2001) Genome Res.11，1926-1934 以及 Ju et al.(2006) Proc Natl AcadSci USA.103, 19635-19640。在本文中，要扩增的靶标的一个末端通过第一个探针而被束缚(tethered)而另一末端则可自由与第二个探针杂交，所述第二个探针物理上与第一个探针足够接近从而使杂交可以发生。第二个探针在何种距离内可被定位将由靶标的长度来确定。序列确定可以在表面本身上进行。或者，将DNA从表面洗脱并测序。本发明所使用的平面载体或微载体的表面是由这样的材料制成或者经过这样的材料功能化，所述材料使得寡核苷酸可以结合至表面。将寡核苷酸偶合至表面是本领域内熟知的。这种偶合可以是可逆的或者不可逆的(例如通过巯基、酸性、或碱性不稳定基团)。在某些实施方案中，微颗粒所具有的尺寸和形状使得可以在微观流体装置中操作颗粒。微载体可具有电荷以使得可以在电场中进行操作。
在其它实施方案中，载体是磁性的或者可磁化的颗粒，使得可以在磁场中进行操作、旋转或定位。在其它实施方案中，使用光镊(optical tweezer)来对颗粒进行定位和或操作。当使用微载体时，它们可以包含标记或编码，其使得可以在多个载体中鉴别出个别的载体。载体的编码在多重方法中早已熟知，其中用具有不同的吸收或发射峰(maxima)的发色(例如突光的)标记来将载体功能化。例如Luminex(Austin, Texas)提供包含不同浓度的两种染料的微载体，导致100种不同的组合(blend)。在本发明的方法中，(并且这与微阵列技术相反)，捕获探针并不是通过其在基体(matrix)上的坐标来鉴别的，而是通过微载体的编码或者特性来鉴别的。因此，经编码的具有捕获探针的微载体可以至少在所述方法的一个步骤(甚至是所有步骤)中存在于溶液中。更高复杂度的编码是通过使用例如量子点来实现的，使得10种强度和6种颜色可用于高达一百万的复杂度。不同类型的条形码在本领域内是熟知的并且包括使用射频标签的电子条形码、激光蚀刻的条形码、金属纳米视杆(metallic nanorods)(在 Jain K.(2003)Expert Rev MolDiagn.3, 153-161;Lehmann(2002)Nature Materialsl, 12-13;Braeckmans et al.(2002)Nature review, drug discoveryl, 447-448中有综述)。在金属纳米视杆中，通过制造载体的不同材料来获得条形码。在特定的实施方案中，条形码是任意几何形状、设计或符号的小型化可读取编码，其可以写在表面甚至内部并且可以从微载体上读取。例如，编码可以写成数字或字母、或者符号形式的编码、图片、条形码、环形码(ring code)、或三维编码。环形码类似于条形码，除了其所使用的是同心圆而非直线。或者，使用二维的图案来表示编码。在特定的实施方案中，通过使用条形码来获得高复杂度，所述条形码通过荧光颗粒的部分光漂白而写到微载体上或其内。此方法允许在颗粒上写符号、线、数字等。可以在微载体上写线图案 从而获得可由光学装置读取的条形码图案。微载体的空间选择性光漂白在 Braeckmans et al.(2003)Nature Materials〗，169-173 和 Serveaux(2007)Langmuir.2510272-10279中有详细描述。条形码可以多次写在微载体上，使得无论微载体的朝向如何都可以读取条形码。在另外的特定实施方案中，微载体还包含磁性材料，其使得可以对颗粒进行磁性操作。此种颗粒的制作在专利申请W02007115815、EP1346224和W00063695中有详细描述。对于用于临床诊断的典型的靶标测序工作，需要对高达1000个基因进行测序。对于此种直接的捕获测序方法，对探针进行稠密堆砌(dense tiling)达到每个碱基是必要的，因为如果在与捕获探针的3’末端互补的片段中有突变则反应就不会进行。这意味着对平均每个1000个碱基的100个基因进行测序，需要100x1000x2链=200，000个不同的探针，对1000个基因测序则需要2，000, 000个探针。对于正确的及定量的突变检测，则可能需要对每个链的每个碱基进行200x或更多的测序覆盖。假设每次读数可以测序10个碱基并且80%的读数由于错误而丢失，那么需要捕获覆盖每个碱基的1000个DNA片段。这可以被分为超过10个不同的重叠探针，因此每个探针100个捕获的片段可能是足够的。Illumina的测序方法能够检测每个μ m2上0.1-1个扩增的群落，因此对于100个扩增的DNA片段则需要100-1000 μ m2的表面面积，这还在微阵列探针位」(6 - 36 μ η 0)的大小范围内。对于有效率的桥式扩增，捕获探针的密度可需要比片段的浓度高100-1000倍(8)，但是10-1000探针每μ m2还在大多数微阵列生产技术的可能性范围之内(美国专利 7，115，400;Kawasaki E.(2006)J.Biom.Techniquesl7, 200-206)。实现本发明的其它的体系安排和方法对于本领域技术人员将是显而易见的。应理解尽管本文中对本发明的装置讨论了其优选的实施方案、具体的构建和配置、以及材料，依然可以进行各种形式和细节的改变或修饰而不偏离本发明的范围和宗
旨
实施例实施例1下文讨论了 呈现本发明典型实施方案的应用于基因组DNA样品的实施例。本文的不同步骤描述了其中使用不具有末端转移酶活性的DNA聚合酶的实施方案。1.1.将靶标片段捕获至阵列表面上5’结合的捕获探针上(图1A)捕获的片段应当是充分间隔的，从而使其在扩增后能够在测序反应中被成像为单个的群落。靶标DNA的片段长度被选为长于捕获探针，从而使得片段的5’突出端一般都可以呈现。除了捕获和靶标核酸之间的完美匹配之外，捕获探针还可以被设计为允许特异性地结合稍微突变的DNA片段。在后者的情况中，此种捕获探针通常需要大约60个核苷酸的长度。对于将靶标DNA杂交至捕获探针，可以如本领域内熟知的那样使用标准的杂交缓冲液、条件以及杂交后清洗条件。如果设想与突变的靶标核酸杂交，则相应地调整为严格条件。1.2.捕获探针的延伸(图1B)将杂交的捕获探针的3’末端延伸从而形成平端的靶标DNA/捕获探针双链体。这可以通过标准的末端修复酶混合物来完成，所述酶混合物至少含有5’ -3’聚合酶和5’激酶以将双链体的5’末端磷酸化用以进一步连接至其它核酸片段。末端修复方案通常用于片段化的DNA。在此过程中，捕获的靶标还可以在其3’末端进行延伸，但却对方法中的另外的步骤没有影响。为了使捕获探针延伸，在3’末端需要自由的羟基。基于此原因，在本发明的方法中捕获探针用其5’末端附着至支持物。5’末端的附着通常是通过直接合成、通过单个寡核苷酸点样(spotting)随后化学附着5’末端、或者通过表面上合成的探针的反转来实现的(Kwiatkowski M.et al.(1999)Nucleic Acid Res.27，4710-4714)。1.3.发夹衔接子连接至探针/片段双链体(图1C)发夹衔接子的平端连接在本领域内是熟知的例如参见Ref.7。双链DNA发夹衔接子至少具有至少6-7个碱基对的茎(双链部分)和类似数目碱基的环以允许折叠。对于本发明的方法，一般使用具有更长长度的发夹分子，从而可以包括大约20个核苷酸的特异性的引物结合位点(通常大约15-25个核苷酸)(在步骤7中进一步解释)，以及基因组中一般不存在的限制性内切核酸酶位点，如1-SceI (步骤5、18个核苷酸)。具有类似特性的其它酶可以从商业途径获得。另外，需要总长度200至500个核苷酸的桥联分子(探针+延伸+发夹+靶标)以允许桥式扩增(在步骤4中进一步解释)。这会意味着，有了 50-200bp的靶标和探针+延伸的长度，需要大约100个核苷酸的发夹。一种相同的发夹核酸可用于连接不同的经延伸的靶标DNA/捕获探针核酸。1.4.变性并随后杂交至相邻的捕获探针，以及桥式扩增(图1D)具有发夹的经延伸的探针/靶标复合物，可以在变性后与其自己杂交。在本发明的方法中，附着至支持物的邻近的靶标探针数目在变性后相当高，源自靶标DNA的DNA序列更可能结合至邻近的捕获探针而不是源自捕获探针核酸的序列的互补部分。这些复合物通过所谓的“桥式扩增”用标准的热循环以热稳定聚合酶进行扩增或者通过等温扩增来进行扩增。与使用大约20-40个核苷酸的引物的PCR反应相比，桥式扩增中的复性步骤可能需要更长的时间，因为探针-引物长于标准的PCR引物。为了有效地进行桥式扩增，一般使用200-500个碱基的总的桥长度。这可以通过调整捕获探针、DNA片段、以及发夹分子的长度来实现。重复上述的变性、杂交和延伸的步骤。—般需要10至60循环的扩增以产生可以很好检测的群落。在扩增之后，继而用标准的缓冲液洗掉PCR试剂。1.5.双链体桥的切割(图1E)用限制性内切核酸酶在源自发夹衔接子的序列内的特异性识别位点切割扩增步骤之后获得的双链DNA。典型的限制性内切核酸酶识别位点是经选择的，在基因组序列中很罕见。具有大的识别位点的酶如1-SceI适宜于此种目的。

1.6.经切割的DNA的变性(图1F)经切割的双链体被变性(通过加热或者化学手段)并用标准缓冲液洗掉未附着至表面的DNA。得到了附着的分子，其由捕获探针核酸(底部的实线)、与靶标DNA互补的未知核酸(虚线)以及发夹衔接子核酸的部分(上面线上的实线)所组成。1.7.未知靶标DNA的测序(图1G)使用与发夹衔接子互补的通用引物(generic primer),由任意适宜的测序化学来进行测序反应，如一个碱基一个碱基地添加可逆终止核苷酸。实施例2.方法的实验细节2.1.靶标DNA与捕获探针的杂交市售氨基甲硅烷载片上具有58个核苷酸长度的捕获探针位点的内部点样阵列被用于40个核苷酸的靶标DNA的杂交，全部互补于捕获探针。该阵列与5’末端经Atto700荧光标记所标记的靶标DNA的IOpM或IOnM溶液杂交。用不能与靶标DNA杂交的参照探针(其是具有Atto700标记的非结合性DNA部分)和具有不相关序列的探针(非结合性探针)的位点进行了对照。用靶标DNA在3x SSC;0.1%SDS中于50° C进行了 30min杂交。对于基因组DNA(具有50-5000bp的片段长度)的杂交，适合进行更长时间(1-64小时)的杂交。用Ix SSC; 0.2%SDS于室温将杂交的探针洗涤3x5min。对标记的检测显示出，在参照探针之外，靶标DNA结合至捕获探针，而非结合性探针则未被检测到。
2.2.延伸修复进行另外的杂交试验，其中使用上述的条件、以及具有捕获探针(无荧光标记)参照和非结合性探针的类似的经点样阵列:-1OnM的62个核苷酸的靶标DNA具有与捕获探针互补的40个核苷酸以及包含鸟嘌呤的4个核苷酸的5’突出端。-OnM的58个核苷酸的靶标DNA具有与捕获探针互补的40个核苷酸且无5’突出端。杂交之后，用Klenow酶和dATP、dGTP、dTTP及Cy5_标记的dCTP在Klenow缓冲液+0.5%BSA中于37。C使捕获探针延长30-60min。通过用Ix SSC; 0.2%SDS洗涤3x5min而使反应停止。Cy5荧光标记仅与具有5’突出端的靶标探针一起被检测。形成平端复合物的无突出端的探针，并无核苷酸掺入(具有和不具有突出端的探针都在其3’有与捕获探针不互补的18bp的尾巴，其封闭了核苷酸在分子这一边的掺入)。2.3.衔接子连接.
用未标记的核苷酸重复上述的实验，并将500nM的5’磷酸化的发夹寡核苷酸(具有20个核苷酸的环和6个碱基对的茎或者具有28个核苷酸的环和33个碱基对的茎)按照如下进行连接:于37° C在连接酶缓冲液+0.5%BSA中用T4连接酶使探针-靶标双链体进行磷酸化 45_60min。在连接酶缓冲液+0. 5%BSA中用T4连接酶和发夹寡核苷酸于室温进行连接。通过用Ix SSC; 0.2%SDS洗涤3x5min来去除未连接的发夹发夹在其环区域含有内部Atto700标记以使得可以检测连接的发夹和评估连接产率。2.4.桥式扩增的第一步作为原理的证据，以未标记的发夹用IOnM的靶标DNA (40个核苷酸与捕获探针互补，无突出端)重复上述的实验。之后按照如下进行第一轮的桥式扩增:在3x SSC;0.1%SDS中于95° C将具有连接的发夹的双链体变性3min并于50° C重杂交(rehybridize) 30mino用Klenow 酶和 dATP、dGTP、dTTP 及 Cy5_ 标记的 dCTP 在 Klenow 缓冲液 +0.5%BSA中于37° C进行第二链合成30-60min。标记的检测证明了第二链的合成已经发生。实施例3.替代的衔接子连接步骤的实验细节经若干修改后重复实施例2 (见上文)所述的实验:使用组合了超结构(Schott)的Nexterion P MPX-16 载片(SCHOTT)代替 SAL-载片。此载片产生很低的背景、良好的信号-背景比；另外，不需要封闭。相应地，进行包括如下步骤的SCHOTT洗涤方案:洗涤缓冲液I (PBST，2.0%):具有2.0% Tween 20的PBS:由于该载片(包括超结构)已在缓冲液中完全浸溃，在缓冲液中去除了超结构的密封，导致洗涤缓冲液即刻流入。
洗涤缓冲液2 (PBS T, 1.0%):具有 1.0% Tween 20 的 PBS: 5min 并摇动洗涤缓冲液3 (PBS T, 0.5%):具有 0.5% Tween 20 的 PBS: 2min 并搅动洗涤缓冲液4 (PBS T, 0.1%):具有 0.1% Tween_ 20 的 PBS: 2min 并搅动PBS:2x2min 并揽动在37° C同时进行核酸的末端修复和磷酸化反应大约lh。4个核苷酸的末端修复可于5分钟内进行。随后，通过将5%的PEG8000 (40%w/v)加入至反应溶液来进行连接反应。连接在室温进行大约lh、2h、或 4h或者过夜。实验证明在室温连接大约2h足以产生良好的连接结
果O实施例4.延伸修复使用实施例2和3所述的条件、及具有捕获探针(无荧光标记)参照和非结合性探针的类似的经点样的阵列来进行另外的杂交反应:IOnM的74个核苷酸的靶标DNA具有与捕获探针互补的40个核苷酸以及包含鸟嘌呤残基的16个核苷酸的5’突出端。在杂交之后，用Klenow酶和dATP或者dTTP或者dATP和dCTP或dTTP和dCTP的混合物在Klenow缓冲液+0.5%BSA中使捕获探针于37° C延长30-60min。作为参照，进行了含有所有四种核苷酸的延长反应。在延长反应期间还进行了磷酸化反应以使用T4激酶在激酶缓冲液+0.5%BSA中对探针-靶标双链体进行磷酸化。用T4连接酶和发夹寡核苷酸在连接酶缓冲液+0.5%BSA和5%PEG8000 (40w/v)中于室温进行2小时的连接。通过使用Schott洗涤方案去除未连接的发夹。发夹在其环中含有内部Atto700标记以使得可以检测连接的发夹以及评估连接的产率。由于连接仅可以在平端上发生，检测到标记证明了 16-核苷酸的突出端完全被核苷酸所填充。如图5中所示，当使用正常核苷酸混合物(A、C、T和G)进行末端修复时(参照)发生连接，仅使用A核苷酸进行末端修复后不发生连接，而仅使用T核苷酸进行末端修复后发生不太理想的连接。对于仅使用T核苷酸进行末端修复后此特异性的序列连接，当将C核苷酸加入至末端修复反应时，可改善至参照反应的水平。因此，对于随后的发夹结构的连接，当加入序列特异性核苷酸时可以改善结果，例如本实施例的情况中互补于最后的核苷酸的C。对于其它序列，最终的核苷酸可以是不同的，因此，可以向包含T核苷酸的反应溶液中加入不同的核苷酸。该实例表明，可以用Klenow聚合酶与仅仅T核苷酸或者与包含T核苷酸的组合一起进行引物延伸步骤，以防止桥式扩增期间的自我杂交。实施例5.用ATCG、仅有A或仅有T核苷酸的延伸修复进行了另一个阴性对照实验，其中将具有4个核苷酸的突出端的片段序列杂交至压印在玻璃载片上的捕获探针。用Klenow聚合酶在分别在:存在全部四种核苷酸(A、T、C和G)时、在仅存在A核苷酸时或仅存在T核苷酸时进行末端修复反应。在此末端修复反应之后，用含有所有四种核苷酸(其中C-核苷酸被荧光标记)的核苷酸混合物进行第二个末端修复反应。在此第二个末端修复反应之后的荧光信号表明并不是所有的末端在第一个反应中都完成了，因此仅用A或T核苷酸进行的末端修复并未发挥作用(参见图6)，正如所预期的那样。此结果因此确认了实施例4所述的实验发现。实施例表明可以用Klenow聚合酶以及ATCG、仅有A或仅有T核苷酸来进行引物延伸反应。实施例6.比较实施例将平端发夹出个碱基对的茎和20个核苷酸的环)连接至单链捕获探针的效率与相同发夹核酸连接至杂交的因而是双链的捕获探针的效率进行比较(图3)。根据所测量的荧光信号(作为参照探针的％以纠正扫描之间的差异)并取若干个实验的平均，连接至双链探针的效率比连接至单链探针高10 倍。
权利要求
1.用于扩增靶标核酸的方法，所述方法包括如下步骤: a)提供具有多个核酸捕获探针的支持物，其中所述多个探针通过核酸的5’末端固定在支持物上， b)将靶标核酸与捕获核酸探针杂交以形成探针/靶标复合物， c)用聚合酶延伸捕获探针核酸，其中靶标核酸被用作捕获探针核酸延伸的模板， d)将经延伸的靶标/探针双链核酸连接至发夹核酸，其中将发夹核酸的5’末端连接至经延伸的探针的3’末端并且将发夹核酸的3’末端连接至靶标核酸的5’末端， e)使靶标核酸的3’末端结合至所述支持物上的所述多个核酸捕获探针中的另外的探针， f)通过聚合酶延伸所述另外的探针的3’末端， g)通过重复步骤e)和f)扩增步骤f)中所获得的核酸。
2.权利要求1的方法，其中步骤c)的聚合酶具有3’至5’的校正外切核酸酶活性并且其中所述发夹核酸形成平端茎。
3.权利要求1或2的方法,其中步骤c)的聚合酶是Pfu(激烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)) DNA 聚合酶。
4.权利要求1的方法，其中步骤c)的聚合酶具有3’末端转移酶活性，导致在双链核酸的3’末端的突出端，并且其中所述发夹核酸具有5’突出端，与双链核酸的3’互补。
5.权利要求1或3的方法，其中步骤c)的聚合酶是Taq(水生栖热菌)DNA聚合酶，生成腺嘌呤的3’突出端，并且其中发夹的5’突出端是胸腺嘧啶核苷。
6.权利要求1的方法，其中步骤c)中的聚合酶是Klenow聚合酶，其在存在单一类型的核苷酸时使用，沿着捕获的片段序列生成一系列相同的核苷酸。
7.权利要求6的方法，其中所述单一类型的核苷酸是dTTP。
8.权利要求1的方法，其中步骤d)的将经延伸的靶标/探针双链核酸连接至发夹核酸是在连接反应中存在PEG8000时进行的。
9.权利要求1至8任一项的方法，其中所述靶标核酸是DNA。
10.权利要求1至9任一项的方法，其中发夹序列在其环中包含用于罕见的限制性内切核酸酶的序列。
11.权利要求1至10任一项的方法，其中支持物是平面支持物，包含不同的区别区域，每个区域包含多个不同的探针。
12.权利要求1至10任一项的方法，其中支持物是微载体，其中所述微载体包含多个一种核酸捕获探针。
13.权利要求12的方法，其中所述微载体包含可检测标记并且其中该可检测标记限定了附着至微载体的捕获探针的序列。
14.权利要求1至13任一项的方法，其中在权利要求1的步骤g)中的扩增之后进行相应于靶标核酸的核酸序列确定。
15.权利要求14的方法，其中所述序列确定是在平面支持物上或者在权利要求13的标记的微载体上进行的，还包括将确定的序列与平面支持物上的区域或微载体上的标记相关联的步骤。
全文摘要
本发明描述了用于扩增靶标核酸的方法，其中靶标核酸与通过5'末端固定在支持物上的捕获探针核酸杂交。用聚合酶进一步延伸杂交产物以形成双链核酸。将发夹核酸连接至此双链核酸。将此连接产物进一步扩增并测序。
文档编号C12Q1/68GK103221552SQ201180042450
公开日2013年7月24日 申请日期2011年8月31日 优先权日2010年9月1日
发明者H·M·费特斯马, M·J·奥弗戴克, A·范德斯托尔佩, P·J·范德扎格 申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司