从发酵微生物中回收细胞内组分的方法
【专利说明】从发酵微生物中回收细胞内组分的方法
[0001] 本发明涉及一种回收生物来源材料例如酵母、藻类、细菌和/或霉菌的细胞内组 分的方法。
[0002] 本领域已知细胞微生物的悬浮液可以通过扰动和破坏细胞膜例如通过改变渗透 压力来溶解。例如，简单的降低液体环境的离子力，或者加入表面活性剂并且适度搅拌悬浮 液，会使得细胞溶胀和使得它们溶解。另一方面，在其他情况中，需要强力搅拌该悬浮液，同 时施加强的热、机械或声波作用来破坏细胞膜，这伴随着细胞溶解成本的增加。例如，细菌、 酵母和藻类的细胞是明显更耐受的，并且将它们溶解来回收细胞内组分是困难的，因此必 须诉诸于比渗透更有效的方法来获得它们。
[0003] 在"Disruptionofmicrobialcellsforintracellularproducts'，，Enzim MicrobTech.，1986,第8卷中，提出了破坏细胞壁的主要方法，其是：
[0004] a)机械方法：
[0005] _依靠细胞和固体材料之间的摩擦力，例如使用珠磨机或者X-压碎器或者Hughes 压碎器；
[0006]-依靠在细胞悬浮液中的摩擦力，例如用超声波或者用高压均化器或者用所谓的 费氏压碎器。
[0007] b)非机械方法：
[0008] _依靠酶、化学溶解（使用清洁剂、溶剂或者抗生素）或者物理溶解（渗透性冲击 或者压力）。
[0009] 在工业方法中（其在发酵结束时提供了微生物的收集和它们的细胞破坏或者溶 解来释放细胞内产物），油性和含水酶相经常伴随着细胞的残留物。
[0010] 工业上从种子中萃取油的一种方案是使用这样的处理装置（揉捏法），其具有通 过螺旋桨搅拌的足够的体积，该螺旋桨以20-30rpm的速率旋转，并且确保了用于释放油性 液泡的破碎方法的充足停留时间（1-2或更多小时）。该方法在低温（20-30°C)在空气中 进行。
[0011] 工业设施通常可以包括串联（在这种情况中，经常叠加来限制阻碍空间）或者并 联布置的更多个捏合机，依靠水力系统机械装入离开碾碎机的油糊剂。该方法产生了温和 的热溶解（其与该糊剂缓慢的再混合有关），允许释放油相，其然后通过浮选法来分离。该 技术对于尺寸大于几十微米的微生物是有效的，但是它对于耐受性微生物例如一些但不仅 是油脂酵母（Lypomyces)、红酵母（Rhodotorula)和隐球酵母（Cryptococcus)种类是无效 的。用于指示该方法的技术参数是操作的温度和持续时间。温度对于随后的萃取中的产率 是基本的，并且与细胞内容物的释放阶段严格相关。时间参数与运行模式相关联。
[0012] 对于需要剧烈的温度和压力条件的细胞溶解的情况来说，另一类型的能够进行该 方法的工业机器是由固定的或者旋转的汽缸组成的机器，其装备有能够混合、破坏和伴随 待溶解的细胞的内叶片或者混合器。该机器在食品工业中用于热水解，并且有时用于硫酸 的酸性环境（参见例如Anco-EaglinInc的机器）。
[0013] 美国专利申请US2010/0006515A1描述了一种用于热机械细胞溶解的机器，其充 当了螺杆压碎器，用于大于5巴的压力和高于120°C的温度。在说明书中，它显示了该机器 还能够在用于细胞产品的热溶解方法过程中，用特征为强的热/机械破坏强度的膜来进行 细胞液体的分离。
[0014] 使用玻璃或者陶瓷珠磨机允许强力摇动和破坏该糊中待溶解的细胞。该方法已经 使用了多年，并且被认为可用于酵母和真菌、微细菌、孢子和微藻类的生物族。最近已经用 于土壤样品以及植物和动物组织的小样品。
[0015] 虽然两种方法（基于磨机和基于螺旋转鼓的那些）对于某些类型的细胞是有效 的，但是它们的特征在于高的操作成本以及装置成本。后者来源于进行溶解作用所必需 的时间，以及有时候，归因于伴随着细胞微生物的生长环境的化学品侵蚀，如在藻类的情况 中，其中氯的存在需要使用高耐受性材料例如主要基于镍和铬的合金。
[0016] 最近，已经使用了基于声学或者磁性溶解过程的方法，这意味着较低的最终能量 成本。
[0017] 液体的强超声作用例如产生了声波，其在液体介质中以交替的高压和低压循环来 传播。在低压循环期间，在液体中产生了高浓度的小尺寸真空泡。因此使用空穴方法来内 破该液体泡，其由此允许产生能够机械破坏细胞结构的剪切力。这种效应被用于从藻类中 萃取脂质。为了有效地从水相和细胞碎片中分离油相/脂质相，需要添加溶剂，因为否则该 细胞碎片也将保持吞噬在油相/脂质相中。
[0018] 其他方法包含依靠将高压（20, 000-30, OOOpsi，或者140-210MPa)送过具有窄口 的阀来压碎细胞。该流体因此经历了高剪切力，因此破坏了细胞。用于优化细胞的破裂的 剪切力通过控制压力来限定。该系统需要高能量和冷却样品，这需要穿过该系统的多个步 骤。
[0019] 机械均化包括在这些机械方法中，其在高压条件下操作，并且使用了高能密度，其 基于使用压力和微阀来分开颗粒，直到它们已经减少到最小尺寸（低于1微米）。均化阀是 分尺寸的，以在最低可能的压力时获得期望的微粉化和分散度，这取决于不同的应用。它们 是连续的工业机器，其也可以使用低的比能来管控大体积流量（例如这样的机器，其需要 等于315kW的功率来在1，500巴的过压时处置6m 3/h的液体流量）。
[0020] 用于热溶解的另一方案描述在名称为"Hydrothermal treatment"的文献中，其 实验上可用于藻类的溶解，并且提出用于萃取油性种子中所含的脂质。该方法提供了用 于释放藻类中所含的脂质的实验数据。操作由在压力（200大气压）和250-300°C的温 度，在液-固悬浮液上的热溶解机构组成。脂质从固体的溶解的细胞物质中最终萃取用正 己烷来进行。用于由该在后技术所形成的问题的技术方案，与使用增压均化系统的那些 相同，也需要昂贵的工业应用，尤其是对于所用的材料，其必须确保对于包含在溶解方法 条件下待处理的悬浮液的物理化学系统应有的耐受性（"Hydrothermal processing of high-lipid biomass to fuels''Johnson，Michael C.，Ph. D. Massachusetts Institute of Technology. Dept, of Chemical Engineering Massachusetts Institute of Technology Issue Date :2012)。
[0021] 国际专利申请W099/15638涉及一种改变微生物、真核生物或者原核生物、脂质 体、囊泡或者存活细胞的脂质膜例如双脂质层的结构的方法。具体地，该方法产生了脂质结 构的不稳定（扰动），其允许融合脂质膜，而不包括细胞的溶解。
[0022] W099/15638中所述的方法提供了使用低温喷雾干燥机，来将液体介质例如生理溶 液、牛奶、血液、血清、发酵培养液和水（含有脂质结构）雾化成液滴，将其高速引入处于受 控温度的含有蒸气的环境中。
[0023] 在W099/15638的方法中，用于在雾化过程中悬浮待融合的细胞或脂质结构的液 体介质通过在这些的部分上的溶解，而促进细胞膜的融合过程。所用的液体介质必须因此 不有利于这些膜的破坏，而是有利于它们的聚集。W099/15638的方法的目标不是破坏两种 或更多种不同细胞体的膜，而是保持未改变的源细胞的特性，因此使得细胞膜部分融合。以 此方式，该方法产生了分子聚集体，其合并了多细胞混合物中的聚集细胞的特性。
[0024] 在细胞的溶解中，想要从进行了发酵或者培养的微生物中回收该过程的产物，并 且必须首先进行溶解或者破坏，例如在过程体积或者反应器中，在适于获得高于120°C的温 度下，在至少5巴的压力和适度搅拌下用热方式进行10分钟到4-5小时的时间，即微生物 溶解所必需的条件。随后必需：开启反应器冷却；从反应器中萃取作为固体残留物、油、水 和其他细胞内产物的悬浮液的物质；和最后必须添加有机或无机溶剂或者其混合物，通过 随后进行增溶和液体与固体分离操作，来获得发酵或者培养过程所产生的细胞内容物。
[0025] 该方法的特征在于萃取发酵过程产物的整个方法所需能量的超过90%归因于在 发酵的微生物上所进行的热溶解。
[0026] 所以非常令人感兴趣的是寻找一种获得发酵的生物材料的细胞内组分的新方法， 其中整个方法的能量需求远低于常规方法的能量需求。
[0027] 本发明涉及一种热溶解方法，用于回收（萃取）生物来源材料的细胞内组分，所述 生物来源材料例如培养的酵母、藻类、细菌和/或霉菌，或者具体地发酵的产品，其使得所 述生物产业过程的溶解方法所用的操作成本和装置成本最小化。
[0028] 本发明的方法包括：
[0029] _将至少两种物流共同进料到雾化器，其中第一物流包含待溶解的细胞微生物的 含水悬浮液，第二物流包含液态或气态溶剂（雾化溶剂）；