专利名称：基于Taqman探针的水产品中麦氏弧菌的荧光定量PCR快速检测方法
技术领域：
本发明涉及一种基于Taqman探针的水产品中麦氏弧菌(Vibrio metschnikovii)的荧光定量PCR快速检测方法。
背景技术：
麦氏弧菌(Kibrio me tschniko rii )是革兰氏阴性菌，短小稍弯曲的弧状菌,无芽孢、无荚膜，有偏端单鞭毛一根，运动方式呈直线穿梭样，嗜盐菌，TCBS (Thiosulfatecitrate bile salts sucrose agar culture medium)平板上生长，菌落呈黄色。麦氏弧菌是一种致病性弧菌，广泛存在于河流、海湾和下水道中。麦氏弧菌被国内外学者公认为11种致病性弧菌之一，能够引起腹泻、创伤性感染和败血症。在饮用水中与腹泻病之间存在着密切的联系。现有麦氏弧菌的检测方法主要有传统常规分离鉴定法、普通PCR检测法、ATB细菌鉴定法等。基于Taqman探针的荧光定量PCR技术通过TaqMan探针与模板的特异性杂交来鉴别模板，具有很高的准确性，假阳性低，特异性好。目前尚未见用TaqMan探针快速检测水产品中麦氏弧菌的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测速度快、灵敏度高的快速检测水产品中麦氏弧菌的基于Taqman探针的荧光定量PCR方法。
研究表明:麦氏弧菌携带的rpoB基因是RNA聚合酶β亚单位编码基因，具有较高的保守性。本发明根据NCBI (美国国立生物技术信息中心)网站上公布的麦氏弧菌rpoB基因全序列，以该特异基因的保守序列设计特异性引物和TaqMan探针，并且采用荧光定量PCR快速技术检测麦氏弧菌，具有快速、特异性强、灵敏度高等优点。可以作为水产品中麦氏弧菌的快速、简便、准确的检测方法。本发明的技术解决方案是:一种快速检测麦氏弧菌的方法，其特征在于有如下步骤:
Cl)首先提取待检样品TCBS平板上可疑菌落的基因组DNA。(2)荧光定量PCR反应液(25μ 体系):
其中包括提取的基因组 DNA，2PL ； 10 XPCR buffer, 2.5μ ；Mg2+, 2mmol/L ；Taq 酶 2U ；UNG酶IU ;dNTP 0.2mmol/L ;麦氏弧菌特异性引物IOpmol ;TaqMan探针5pmol,最后加灭菌去离子水至25μ 。(3)荧光定量PCR仪程序参数:94°C预变性5min ;94°C变性30s，58°C退火30s，同时收集FAM荧光，72°C延伸30s，40个循环。其中麦氏弧菌特异性引物为:上游引物 Vmetschnikovi1-1:5’- GCTATTCGAAAGTTTATTCTTC -3’
下游引物 Vmetschnikovi1-2:5’- CCAAGATGGTCGATATCATC -3’
特异性TaqMan探针为:
Vmetschnikovi1-3:5’- CGTAGGTCGTATGAAGTTCAATAGT-3’
荧光定量PCR反应结束后，麦氏弧菌能形成典型的S型扩增曲线，而且Ct值〈35。方法建立后利用麦氏弧菌标准菌株和其他弧菌进行了特异性和敏感性实验。I荧光定量PCR特异性
利用建立的荧光定量PCR方法检测麦氏弧菌标准菌株ATCC 700040，结果显示麦氏弧菌用荧光定量PCR检测为阳性扩增，生成S形的荧光曲线，对溶藻弧菌ATCC 17749、最小弧菌CGMCC(B) 1.1969、副溶血弧菌ATCC 17802、创伤弧菌CCGMC 1.1758、哈维氏弧菌CGMCC(B) 1.1593和弗尼斯弧菌CGMCC(B) 1.1613的检测结果均为阴性，结果见附图1。2荧光定量PCR敏感性
麦氏弧菌标准菌株ATCC 700040在营养肉汤中36±1°C培养24小时后，10倍梯度稀释后，荧光定量PCR检测结果显示，25μ 反应体系中，最低检测下线为102 CFU/25PL，此时荧光定量PCR扩增可以生成S形 的荧光曲线，结果见附图2。本发明提供了扩增麦氏弧菌的特异性引物Vmetschnikovi1-l、Vmetschnikovi1-2和TaqMan探针Vmetschnikovii_3,从而提供了一种快速检测麦氏弧菌的方法，同现有检测技术相比具有如下优势:
快速性:没有后处理，不用电泳、拍照，实时缩短了反应时间。灵敏度高:光谱技术和计算机技术的联合使用，极大提高了检测的灵敏度。特异性强:荧光信号的产生不仅强烈依赖于靶模板同探针的杂交，而且同时强烈依赖于靶模板的扩增，二者缺一不可，故不存在非特异性扩增现象。有效解决PCR污染:整个过程均在单管中进行，且勿需打开管盖，避免了 PCR产物对实验室的污染。
图1是荧光定量PCR的特异性试验。图2是荧光定量PCR的敏感性试验。图中，1:1XlO6 CFU/25PL;2:1XlO5CFU/25PL;3:1XlO4 CFU/25PL ;4:1XlO3 CFU/25PL ;5:1XlO2 CFU/25PL ;6: 1X10CFU/25PL。
具体实施例方式首先无菌操作取25g待测水产品，充分剪碎，放入盛有225mL灭菌海水的灭菌容器中，进行10倍梯度稀释后，选择2 3个适当稀释度，各以0.1mL涂布到TCBS平板上，在360C ±1°〇培养箱中，倒置培养2411±311。挑取5个可疑菌落提取基因组DNA并稀释备用。如果平板上的可疑菌落少于5个，则应该全部挑取进行基因组DNA提取并稀释备用。最后进行荧光定量PCR反应，每个荧光定量PCR反应总体积为25PL，其中包括提取的基因组 DNA，2PL ； 10 X PCR buffer, 2.5μ ;Mg2+，2mmol/L ；Taq 酶 2U ；UNG 酶 IU ；dNTP
0.2mmol/L ;麦氏弧菌特异性引物IOpmol ;TaqMan探针5pmol,最后加灭菌去离子水至25μ 。设置荧光定量PCR仪器的程序参数为:94°C预变性5min ;94°C变性30s，58°C退火30s，同时收集FAM荧光，72°C延伸30s，40个循环。其中麦氏弧菌特异性引物为:
上游引物 Vmetschnikovi1-1:5’- GCTATTCGAAAGTTTATTCTTC -3’
下游引物 Vmetschnikovi1-2:5’- CCAAGATGGTCGATATCATC -3’
特异性TaqMan探针为:
Vmetschnikovi1-3:5’- CGTAGGTCGTATGAAGTTCAATAGT-3’
荧光定量PCR反应结束后 ，麦氏弧菌能形成典型的S型扩增曲线，而且Ct值〈35。
权利要求
1.一种基于Taqman探针的快速检测水产品中麦氏弧菌的荧光定量PCR方法，其特征在于首先提取TCBS平板上的可疑菌落的基因组DNA并稀释备用；再利用麦氏弧菌保守性强的基因组DNA序列设计特异性引物和探针；最后使用该引物和探针对待测水产品TCBS平板上可疑菌落的基因组DNA进行荧光定量PCR扩增和荧光信号的检测；其中所述的麦氏弧菌特异性引物为: 上游引物 Vmetschnikovi1-1:5，- GCTATTCGAAAGTTTATTCTTC -3’ ； 下游引物 Vmetschnikovi1-2:5，- CCAAGATGGTCGATATCATC -3’ ； 特异性TaqMan探针为:Vmetschnikovi1-3:5’- CGTAGGTCGTATGAAGTTCAATAGT-3’ 。
2.根据权利要求1所述的基于Taqman探针的快速检测麦氏弧菌的荧光定量PCR方法，其反应总体积为25μ ，包括提取的基因组DNA，2PL ； 10 XPCR buffer, 2.5μ ；Mg2+, 2mmol/L ；Taq 酶 2U ；UNG 酶 IU ；dNTP,0.2mmol/L ;麦氏弧菌特异性引物 IOpmol ；TaqMan 探针 5pmol，最后加灭菌去离子水至25μ 。
3.根据权利要求1所述的基于Taqman探针的快速检测麦氏弧菌的荧光定量PCR方法，其荧光定量PCR仪器的程序参数为:94°C预变性5min ；94°C变性30s，58°C退火30s，同时收集FAM荧光，72°C延伸30s，40个循 环。
全文摘要
本发明公开了一种基于Taqman探针的麦氏弧菌(Vibriometschnikovii)的荧光定量PCR快速检测方法，采用麦氏弧菌特异性引物和TaqMan探针，即可对水产品中麦氏弧菌进行检测与监控 。其中上游引物Vmetschnikovii-15'-GCTATTCGAAAGTTTATTCTTC-3'，下游引物Vmetschnikovii-25'-CCAAGATGGTCGATATCATC-3'，特异性TaqMan探针为Vmetschnikovii-35'-CGTAGGTCGTATGAAGTTCAATAGT-3'。检测麦氏弧菌的方法包括细菌基因组DNA的提取、麦氏弧菌的荧光定量PCR检测。其优点是快速、特异性强、灵敏度高。另外，本发明与普通PCR技术相比，不需要凝胶电泳拍照观察，实现了检测流程一体化封闭检测，避免了PCR产物对实验室的污染。
文档编号C12R1/63GK103215347SQ20131007685
公开日2013年7月24日 申请日期2013年3月12日 优先权日2012年3月13日
发明者贾俊涛, 吴振兴, 李正义, 祝素珍, 姜英辉, 马云, 张健 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心