专利名称：一种结核分枝杆菌esat6抗原蛋白串联重组表达方法及其在结核检测中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域及医学免疫学领域，涉及结核病病人和结核杆菌感染者的快速、早期特异的检测方法，具体的涉及一种结核分枝杆菌ESAT6串联重组融合蛋白及其应用，特别是一种结核病抗原ESAT6串联重组融合蛋白特异的全血IFN-Y结核诊断试剂盒及TCELL-SP0T结核感染诊断试剂盒的制作方法和应用方法。
背景技术：
结核病是由结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)感染所致的人类疾病，主要通过呼吸道传播，且疫情发展日趋严重。结核病的预防、早期诊断和及时治疗意义重大。MTB标准菌株H37Rv被广泛应用于TB相关的生物医药研究，其特异性抗原的制备备受关注。目前常用的结核特异抗原可以通过基因工程方法大量制备，是结核诊断的基础。但是目前多集中于单独一种抗原的表达、单独抗原表位的表达、多种抗原联合表达的方法获得结核特异抗原，少有单一抗原串联重组表达的研究，且结核特异性抗原多直接用血清学方法检测结核感染，灵敏度低、特异性差。发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种用基因工程方法生产的结核ESAT6串联重组融合蛋白作为抗原，特异性强且易于纯化，用其作为特异抗原制备了全血IFN- Y结核诊断试剂盒及TCELL-SP0T结核感染诊断试剂盒，为结核病感染的检测提供更为特异、灵敏、准确的工具。
一种编码结核分枝杆菌ESAT6基因的密码子优化基因序列，其单拷贝核昔酸序列如SEQ ID N0.1所示，2次拷贝串联核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，3次拷贝串联核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，4次拷贝串联核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，5次拷贝串联核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示，6次拷贝串联核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示，ESAT6基因串联次数包括但不限于1-6次。
结核分枝杆菌 ESAT6串联重组融合蛋白，它由上述的密码子优化基因序列编码，其单拷贝氨基酸序列如SEQ ID N0.7所示，2次拷贝氨基酸序列如SEQ ID N0.8所示，3次拷贝氨基酸序列如SEQ ID N0.9所示，4次拷贝氨基酸序列如SEQ ID N0.10所示，5次拷贝氨基酸序列如SEQ ID N0.11所示，6次拷贝氨基酸序列如SEQ ID N0.12所示，ESAT6蛋白串联次数包括但不限于1-6次。
结核分枝杆菌ESAT6串联重组融合蛋白的表达载体，它是将上述的密码子优化基因序列分别插入到质粒pET-25b上，得到重组质粒ESAT6cl-pET25b、ESAT6c2_pET25b、ESAT6c3-pET25b、ESAT6c4_pET25b、ESAT6c5_pET25b 或 ESAT6c6_pET25b，载体包括但不限于pET25b。
—种表达结核分枝杆菌ESAT6串联重组融合蛋白的工程菌株,它含有上述的表达载体，其宿主菌为大肠杆菌{Escherichia coif)。
一种基于所述结核分枝杆菌ESAT6串联重组融合蛋白建立的体外检测结核杆菌感染的化学发光法试剂盒，其利用上述的结核分枝杆菌ESAT6串联重组融合蛋白，刺激受检者的外周血释放Y-干扰素，并通过化学发光的方法测定Y-干扰素的变化，诊断是否感染结核分枝杆菌。
一种基于所述结核分枝杆菌ESAT6串联重组融合蛋白建立的体外检测结核杆菌感染的TCELL-SP0T试剂盒，其利用上述的结核分枝杆菌ESAT6串联重组融合蛋白，刺激受检者的外周血T淋巴细胞，并通过ELISPOT的方法测定斑点形成的多少，诊断是否感染结核分枝杆菌。
所述的结核分枝杆菌ESAT6串联重组融合蛋白在制备单抗、多抗、检测试剂盒及蛋白芯片中的应用。
图1重组质粒ESAT6cl-pET16b的构建示意图； 图2重组质粒ESAT6c2-pET16b的构建示意图； 图3重组质粒ESAT6c3-pET16b的构建示意图； 图4重组质粒ESAT6c4-pET16b的构建示意图； 图5重组质粒ESAT6c5-pET16b的构建示意图； 图6重组质粒ESAT6c6-pET16b的构建示意图； 图7 ESAT6cl重组融合蛋白纯化图，图中泳道1: NEB蛋白Marker ;泳道2，3，4，5, 6, 7:ESAT6cl纯化带；泳道8:ESAT6cl纯化后；泳道9:ESAT6cl纯化前； 图8 ESAT6c2重组融合蛋白纯化图，图中泳道1:NEB蛋白Marker ;泳道2:ESAT6c2纯化前；泳道3:ESAT6c2纯化后；泳道4，5，6，7:ESAT6cl纯化带； 图9 ESAT6c3重组融合蛋白纯化图，图中泳道1:NEB蛋白Marker ;泳道2:ESAT6c3纯化前；泳道3:ESAT6c3纯化后；泳道4，5，6，7:ESAT6c3纯化带； 图10 ESAT6c4重组融合蛋白纯化图，图中泳道1:NEB蛋白Marker ;泳道2:ESAT6c4纯化前；泳道3:ESAT6c4纯化后；泳道4，5，6，7:ESAT6c4纯化带； 图11 ESAT6c5重组融合蛋白纯化图，图中泳道1:NEB蛋白Marker ;泳道2:ESAT6c5纯化前；泳道3:ESAT6c5纯化后；泳道4，5，6，7:ESAT6c5纯化带； 图12 ESAT6c6重组融合蛋白纯化图，图中泳道1:NEB蛋白Marker ;泳道2，3，4, 5, 6:ESAT6c6纯化带；泳道7:ESAT6c6纯化前；泳道8:ESAT6c6纯化后； 图13 TCELL-SP0T检测结果图，图中a为结核感染者阳性对照孔；b为结核感染者ESAT6cl检测孔；c为结核感染者ESAT6c2检测孔；d为结核感染者ESAT6c3检测孔；e为结核感染者ESAT6c4检测孔；f为结核感染者ESAT6c5检测孔；g为结核感染者ESAT6c6检测孔；h为结核感染者阴性对照孔。
具体实施方式
以下以通过优选实施例对本发明工艺作进一步的详细说明，但本发明的保护范围并不局限于此。
具体实施方式
下面对本发明进一步说明。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。
实施例1结核分枝杆菌ESAT6串联重组融合蛋白的制备 分析编码结核特异性抗原ESAT6的核苷酸序列，并结合疋coli的密码子偏好性，对ESAT6的核苷酸进行同义密码子的优化，并在其编码序列的两端加入设计好的限制性酶切位点，从而实现序列的串联表达。
经过优化的核苷酸序列如下: catatgggaattcccatggaggatccgatgacagagcagcagtggaatttcgcgggtatcgaggccgctgcaagcgcaatccagggtaatgtcacgtccattcattccctccttgacgaggggaagcagtccctgaccaagctcgcagcggcctggggcggtagcggttcggaggcgtaccagggtgtccagcaaaaatgggacgccacggctaccgagctgaacaacgcgttgcagaacctggcgcgtacgatcagcgaagccggtcaggcaatggcttcgaccgaaggcaacgtcactgggatgttcgcagcagatctggctaagcttcccgggtcgactcgagcggccgc 序列上游加入NcoI和BamHI ;在序列下游加入Hindlll，BglII和SalI等限制性酶切位点。并将上述序列委托大连宝生物通过基因合成的方式连入PMD-19T simple，命名为ESAT6cl-19T simple。
1.碱小量法质粒提取 a.将含有ESAT6cl-19T simple的大肠杆菌培养过夜后离心。向细菌沉淀中加入200μ L Solution I (GTE: 50 mmol/L 葡萄糖；25 mmol/L pH 8.0 Tris.HCl ; 10 mmol/LEDTA)，充分混匀，直至菌体完全重悬。
b.再向离心管加入新配制的 200 μ LSolutionI 1(1% SDS ; 0.2 mo I/L NaOH)，立即轻缓倒置数次，直至混合均匀溶液澄清。
c.加入 200 M-L SolutionIII ( 5mol/L 乙酸钾 60mL ;冰乙酸 11.5mL ;水28.5mL)，立即轻缓倒置数次，有大量白色沉淀出现，冰水浴中放置5 min。
d.2，000 r/min离心5 min,取上清,加入等体积的氯仿/异戍醇充分混勻。
e.12, 000 r/mi n离心10 min,取上清,加入2倍体积无水乙醇沉淀。
f.12, 000 r/min离心10 min,弃上清,加入500 70%乙醇洗漆沉淀。
g.12, 000 r/min离心5 min,弃上清,烘干后加入100 ρΗ8.0的TE缓冲液或无菌水，置于-20°C保存备用。
2.酶切 用BamH I和Hind III 37°C过夜双酶切对ESAT6cl_19T simple，获得带粘性末端的ESAT6目的基因。酶切体系如下: BamH I2ul Hind III2ul Buffer4ul ESAT6-19T simple20ul水12ul 用Bgl II和HindIII 37°C过夜双酶切ESAT6cl_19T simple，获得带同样粘性末端的ESAT6cl-19T’ simple片段。酶切体系如下: BamH I2ul Hind III2ul Buffer4ul ESAT6-19T simple20ul水12ul 3.胶回收 a.对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外条件下切除含有目的带的胶块，称重后加入3倍的Binding Buffer, 55°C水浴使胶完全溶解。
b.将DNA溶液转入DNA结合柱，套入到一个2 mL的收集管中室温10000 rpmin离心I min。
c.弃废液,用Wash Buffer洗柱两边后烘干。
d.将DNA结合住套入新的无菌离心管中，加入50 μ L无菌水，室温放置I min，大于13000 r/min离心I min。即得到目的基因的胶回收产物。
4.连接 16°C条件下用T4连接酶，连接过夜。反应体系如下: ESAT6cl-19T’ simple 1.5ul ESAT65.5ul BufferIul T4 LigaseIul 5.^.coli感受态细胞的制备 a.挑取平板上的大肠杆菌DH5 α单菌落接种于3 mL LB液体培养基中，37°C振荡(约150rpm)培养过夜。
b.取该过夜菌体培养液以1:100的比例接种于100 mL新鲜LB培养液中，37°C剧烈振荡(约150 rpm)培养至OD6tltl = 0.4 - 0.6 (约2.5 h)，放置冰浴中停止培养。
c.将b中新培养的菌液分装于已灭菌的离心管中，ImL/管，1，500 g，4°C离心5min,弃去上清(尽量除尽上清)。
d.在每个离心管加入100 μ L冰中预冷的solution A，轻轻弹动离心管使沉淀悬浮，禁止剧烈震荡。
e.1, 500 g,4°C离心5 min,弃去上清(尽量除尽上清)。
f.在每个离心管加入100 μ L冰中预冷的solution B，轻轻弹动离心管使沉淀悬浮。
6.转化 b.于每管感受态细胞中加入5 μ L连接反应物(体积比2 - 5%)，轻轻转动混匀后冰浴中放置30 min。
c.42°C热击6 0 sec后，迅速置冰上2 min。
d.每个离心管中加入900 yL37 °C预温的LB培养基。
e.37°C震荡(100 r/min)培养 I h。
f.取400 μ L上述菌液,涂布于含氨节青霉素(Amp, 100 μ g/mL)的LB平板上，37 °C倒置培养过夜。
7.重组质粒鉴定 将挑取转化后的平板单菌落过夜培养后，取Iml进行DNA测序，测序结果与所预期的结果一致，无突变，编码框正确无移码，命名为ESAT6c2-19T simple。
提取测序正确的重组质粒，用BamH I和Hind III双酶切，酶切后电泳检测为710bp左右，与ESAT6c2大小一致。Bgl II和Hind III双酶切，以ESAT6cl_19T为参照，电泳显示ESAT6c2-19T用Bgl II和Hind III双酶切后片段大于ESAT6cl_19T用Bgl II和Hind III双酶切后的片段，与预期结果一致。
8.目的基因三次串联重组质粒的构建 回收ESAT6c2-19T用BamH I和Hind III双酶切后产生的ESAT6c2片段，与具有粘性末端的ESAT6cl-19T相连，转化后同样进行酶切和测序鉴定，鉴定正确的即为ESAT6c3-19T。
9.目的基因四次串联重组质粒的构建 回收ESAT6c3-19T用Bgl II 和Hind III双酶切后产生的ESAT6c3_19T片段，与ESAT6cl片段相连，转化后同样进行酶切和测序鉴定，鉴定正确的即为ESAT6c4-19T。
10.目的基因五次串联重组质粒的构建 回收ESAT6c4-19T用Bgl II和Hind III双酶切后产生的ESAT6c4_19T片段，与经BamHI和Hind III双酶切后产生的ESAT6c4片段相连，转化后同样进行酶切和测序鉴定，鉴定正确的即为ESAT6c5-19T。
11.目的基因六次串联重组质粒的构建 回收ESAT6c5-19T用Bgl II和Hind III双酶切后产生的ESAT6c5_19T片段，与经BamHI和Hind III双酶切后产生的ESAT6c5片段相连，转化后同样进行酶切和测序鉴定，鉴定正确的即为ESAT6c6-19T。
12.重组表达质粒的构建 用 Nco I 和 Sal I 双酶切 ESAT6cl-19T，ESAT6c2_19T，ESAT6c3_19T，ESAT6c4_19T，ESAT6c5-19T, ESAT6c6_19T 和表达载体 pET25b。分别回收 ESAT6cl，ESAT6c2, ESAT6c3,ESAT6c4, ESAT6c5, ESAT6c6目的片段和pET25b质粒片段。连接后转化大肠杆菌Rosetta-gami (DE3)菌株，37°C倒置过夜培养。挑取单菌落于氨苄和卡那双抗LB培养基中(氨苄终浓度100ug/ml，卡那终浓度50ug/ml)，37°C震荡培养过夜，提取重组表达质粒。
13.重组表达质粒的鉴定 以所提取重组表达质粒为模板，用pET25b的测序引物做PCR鉴定；同时做Nco I和Sal I双酶切鉴定。将鉴定的阳性克隆分别命名为ESAT6cl-pET25b，ESAT6c2_pET25b，ESAT6c3-pET25b, ESAT6c4_pET25b，ESAT6c5_pET25b 和 ESAT6c6_pET25b。
14.基因工程菌的诱导表达与鉴定 将含有 ESAT6cl-pET25b， ESAT6c2_pET25b， ESAT6c3_pET25b， ESAT6c4_pET25b，ESAT6c5-pET25b 和 ESAT6c6_pET25b 的 Rosetta-gami (DE3) 37°C震荡培养过夜，再按 1% 的接种量转接与氨苄和卡那双抗LB培养基中，待OD值为0.60.8时，加入IPTG诱导表达。
取诱导表达后的菌体Iml,离心后按比例加入Loading buffer和PBS后，重悬菌体，至沸水中煮510min，12000rpm离心5min后取IOul进行SDS-PAGE电泳，同时以pET25b-Rosetta-gami (DE3)作为对照。12%分离胶，100V恒压，电泳2h,电泳结束后，脱色至条带清晰。根据电泳结果将有明显的表达带的菌株分别命名为ESAT6cl-pET25b-ROSetta-gami(DE3), ESAT6c2-pET25b-Rosetta_gami(DE3), ESAT6c3-pET25b-Rosetta_gami(DE3),ESAT6c4-pET25b-Rosetta_gami(DE3), ESAT6c5-pET25b-Rosetta_gami(DE3)和 ESAT6c6_pET25b-Rosetta-gami(DE3)。
15.基因工程菌诱导条件的优化 应用 0.2，0.4，0.6，0.6，0.8，1.0，1.2mM 浓度的 IPTG 进行诱导，并在 2h，4h，6h，8h，及过夜条件下分别取样进行SDS-PAGE电泳。同时将过夜诱导菌进行超声破碎，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳。
从而确定IPTG浓度和诱导时间以及是上清表达或包涵体。
16.重组蛋白的纯化 诱导菌收集后破碎，用0.22um滤膜过滤后，采用GE公司的AKTA plus蛋白纯化系统和HisTrap HP 预装柱亲和纯化 ESAT6cl，ESAT6c2, ESAT6c3, ESAT6c4, ESAT6c5 和 ESAT6c6 重组蛋白。SDS-PAGE检测结果表明目的条带单一，无杂带。
实施例2基于结核分枝杆菌ESAT6串联重组融合蛋白的人结核杆菌检测试剂盒(化学发光法) 包装规格
9人份/盒(48T) 21人份/盒(96T) 预期用途
本试剂盒采用化学发光双抗体夹心法定量测定人血液样本中T淋巴细胞在结核杆菌特异抗原多肽刺激后分泌的人干扰素-Y (Interferon- y，IFN- Y )的含量。结核杆菌感染主要引起的是细胞介导的免疫应答。作为免疫应答的一部分，T淋巴细胞接受结核杆菌特异抗原多肽刺激成为活化的效应T淋巴细胞，分泌细胞因子IFN- Y。通过检测样本中IFN- Y的含量可以推测体内是否存在对结核杆菌反应的效应T淋巴细胞，从而对结核杆菌感染进行辅助诊断。
检验原理
本试剂盒是利用结核杆菌感染者血液样本中存在结核杆菌特异的活化T淋巴细胞，这些T淋巴细胞在受到结核杆菌特异抗原多肽刺激后分泌IFN-Y设计而成的。
将新鲜血液 样本、结核杆菌特异抗原多肽A/结核杆菌特异抗原多肽B或阳性对照试剂一起加入细胞培养板进行培养。当血液样本中存在针对结核杆菌的效应T淋巴细胞时，培养液中加入的结核杆菌特异抗原多肽A和B将刺激这些效应T淋巴细胞分泌IFN-Y。
将抗IFN-Y抗体包被微孔反应板，制成固相抗体，加入培养液上清，同时加入辣根过氧化物酶标记的抗IFN-Y抗体。如培养液上清中含有IFN-Y时，就与包被抗IFN-Y抗体、酶标记抗IFN-Y抗体结合形成复合物，加入底物液而发光，测定相对光信号(RLU)。通过数据处理分析，即可判定培养液上清中IFN-Y的含量，以此推测体内是否存在对结核杆菌反应的效应T淋巴细胞，从而对结核杆菌感染进行辅助诊断。
主要组成成份
1.人干扰素-Y检测试剂盒(化学发光法)__48人份_96人份_标准品_人干扰素 _ Y 含量为 O (A)、50 (B)、125(C)、312.5 (P)、800 (E).2000 (F) pg/ml，6 瓶_ (0.5±0.l)ml/瓶(0.5±0.l)ml/瓶包被孔包被有抗人干扰素-Y抗体的聚苯乙烯微孔—48孔96孔30倍酶浓缩液I辣根过氧化物酶标记的抗人干扰素-Y抗体，I管|(100±15)μ1 |(200±15)μ1 _洗液I含有 Tween-20 的 Tris 缓冲液，I 瓶| (20.0±0.5)ml | (20.0±0.5)ml酶稀释液Mbsa 的 Tris 缓冲液，I 瓶"03.0±0.5)ml _(6.0±0.5)ml样本稀释液 Casein 的 PBS 缓冲液，I 瓶~^5.0±0.5)ml — (10.0±0.5)ml底物 A￥1 诺溶液，I 瓶~03.0±0.5)ml 一(6.0±0.5)ml底物B丨过氧化脲溶液，I瓶丨(3.0±0.5)ml |(6.0±0.5)ml 2.结核杆菌ESAT6串联重组融合抗原:0.160 mg/ml, 10 ml/支，5支，共计1.6 mg/支,总量8 mg ο
样本要求
1.使用无菌注射器抽取待测样本外周静脉血2ml，加入含肝素抗凝采血管；或使用5ml含肝素抗凝真空采血管直接采集待测样本外周静脉血2ml。
2.样本采集后可放置室温2-3小时，切勿置于冷冻或冷藏室。
3.请勿使用严重溶血、脂血、黄疸的培养液上清。
试剂的准备
1.所有的试剂应在使用前放于室温(18°C 25°C )平衡至少30分钟。
2.准备洗液，将30倍洗液用去离子水稀释(1:30)，配制成洗液工作液。
3.准备酶工作液，将30倍酶浓缩液离心取上清，用酶稀释液稀释(1:30)，配制成酶工作液。
4.冻干标准品每瓶加0.5 ml去离子水复溶。
5.在使用前，以1:1的比例混合底物A和底物B。
检验操作
1.细胞培养:肝素抗凝血样本采集后3小时内加入刺激物，每份样本设阴性对照一孔；阳性对照一孔(植物血凝素PHA)，工作浓度160 Pg/ml、终浓度为20 Pg/ml ;检测孔A(ESAT6串联重组融合抗原)，工作浓度160 Pg/ml、终浓度 为20 Pg/ml。
于24孔细胞培养板中，具体加样方式如下，此步骤为无菌操作: 阴性对照孔:300 μ 无血清培养基+100 μ 无血清培养基+400 μ 肝素抗凝血样本； 阳性对照孔:300 μ 无血清培养基+100 μ PHA (160 Pg/ml)+400 μ 肝素抗凝血样本； 检测孔A:300 μ 无血清培养基+100 μ ESAT6串联重组融合抗原(160 μδ/πι1 )+400μι肝素抗凝血样本； 当加完所有的样品之后，盖上板盖，轻轻震荡充分混匀，放入37° C、5% CO2培养箱培养18-24小时。
2.收集培养液上清:把24孔细胞培养板从培养箱取出，吸取培养物于1.5 ml离心管，3000r/min,离心5分钟，分离培养液上清。
3.检测培养液上清: ⑴取出人干扰素-Y检测试剂盒(化学发光法)，准备好包被微孔板的数量和位置，未用的微孔板密闭，放入到2°C 8°C冰箱中。
⑵标准品每孔加入100 μ I ;样本孔每孔先加样本稀释液80 μ I，然后再加入20μ I培养液上清(待测样本做5倍稀释)，轻轻振荡混匀。每孔中再加入酶工作液50 μ ，封盖反应板，放置37°C恒温水浴箱温育2小时。
⑶洗板:将反应板取出，用稀释好的洗液工作液洗板5次，每次浸泡I分钟,最后一次将板拍干。
⑷加底物:每孔中加入100 μ I已经配制好的Α、B底物混合液，振荡10秒。
(5)检测:在加入底物10分钟内用化学发光仪检测发光值RLU。
(6)数据处理分析:对发光值RLU进行双对数或其它方法处理分析，制备IFN- Y浓度-RLU标准曲线，换算待测样本中IFN-Y的含量。
检验结果判定
1.正常参考值: 阴性对照孔:实测值< 50 pg/ml ;培养液上清< 250 pg/ml ;肝素抗凝血样本< 500pg/mlο
阳性对照孔:实测值> 100 pg/ml ;培养液上清> 500 pg/ml ;肝素抗凝血样本>1000 pg/mlο
2.结果判断: 在阴性对照孔、阳性对照孔检测正常的前提下，检测孔A所测样本浓度> 2倍阴性对照孔浓度，则判定为阳性结果。
3.若待测样本RLU值高于2000 pg/ml标准品RLU值，建议样本做适当稀释后重新检测，其浓度=测量浓度X稀释倍数。
检验结果的解释
1.在阴性对照孔、阳性对照孔检测正常的前提下，检测孔的测定结果才是可靠的； 2.如需要，临界值附近的样本应进行复孔加样，第二次测定确认。
3.阳性结果提示测试样本中含有针对结核杆菌特异的效应T淋巴细胞。对于检测为阳性的受检者，应结合临床症状及其他指标综合判定。
4.阴性结果提示测试样本中不含有针对结核杆菌特异的效应T淋巴细胞。对于检测结果为阴性的样本不意味着样本中不含有IFN-Y。
5.RLU值会随着时间的改变而改变，检验结果应以本次试验标准品所对应的RLU值所反算的浓度为准。
实施例3基于结核分枝杆菌ESAT6串联重组融合蛋白的人结核杆菌TCELL-SP0T检测试剂盒实验方案: 包被: 1.用35%的乙醇15ul/孔湿润96孔膜板的膜底30秒钟； 2.用200ul无菌的去离子水洗板5次,Imin/次； 3.稍稍控干孔内残留水分，每孔加入IOOulIFN-Y单克隆捕获抗体(用PBS稀释为15ug/ml)，4°C 冰箱过夜； 4.弃去包被液，PBS洗板2次，Imin/次，拍干； 5.每孔加入200ul含有2%酪蛋白及1%海藻糖的PBS封闭，室温孵育2小时； 6.弃去封闭液,用1640培养液润洗一次,待用。
分离计数淋巴细胞: 1.标本采集:抽取待检人员外周血4_5ml，加入含肝素钠的抗凝采血管，上下颠倒数次混匀；室温放置小于6小时，勿冷冻或冷藏；2.按1:1的比例取混匀的3ml抗凝外周血缓缓加入到3ml淋巴细胞分层液的无菌离心管中，形成明显界面，室温下2500rpm离心20min。可见外周血单个核细胞(PBMC)存在于云雾状层中； 3.用无菌滴管或移液器吸取淋巴细胞云雾层至无菌的装有少量1640的离心管中； 4.加入37°C预热的1640培养液至8ml，用滴管轻轻吹打混匀后，于室温2000rpm水平离心IOmin ； 5.弃去上清液，加入37°C预热的1640培养液至6ml，重悬沉淀细胞，于室温1500rpm水平离心8min ； 6.弃去上清液，加入37°C预热的无血清培养基0.25ml，用滴管轻轻吹打混匀细胞； 7.取IOul细胞悬液加入血球计数板，显微镜下计数，计数每ml悬液细胞数量。用37°C预热的无血清培养基稀释细胞悬液至2.5*106个/ml ； 免疫斑点检测 1.在上述包被的96孔滤膜板中加入下列试剂:(I)50ul无血清培养基至每个阴性对照孔；(2) 50ul植物血凝素PHA至每个阳性对照孔；(3) 50ul结核分枝杆菌重组融合蛋白ESAT6/ESAT6至每个检测孔； 2.每孔加入IOOul含有2.5*106个/ml的PBMC细胞悬液； 3.将96孔滤膜板放入润湿的37°C，5%C02培养箱，恒温恒湿培养18 — 20小时； 4.将96孔滤膜板取出，弃培养上清，加入200ul预冷的冰水裂解细胞IOmin(-200C 5min后4°C 5min)，用I氺PBST洗板5次，Imin/次，最后一次洗板后拍干； 5.加生物素标记的IFN-Y检测抗体IOOul/孔(PBS稀释为lug/ml)，37°C孵育I小时，甩板，用200ul的PBST洗板5次，Imin/次，最后一次洗板后拍干； 6.加碱性磷酸酶标记的链亲和素100ul，37°C孵育30min，弃去液体，用200ul的PBST洗板5次,Imin/次,最后一次洗板后拍干； 7.每孔加入IOOulBCIP/NBT底物液，室温避光显色7-15min至斑点生长至合适大小； 8.板底出现蓝紫色斑点，用蒸馏水洗板三次终止反应，将板放入37°C烘箱烘干； 9.使用酶联斑点分析仪进行计数分析着色的斑点，或使用显微镜或放大镜进行计数，每个点代表一个分泌Y干扰素的T淋巴细胞。
一、以实施例2实验方案做临床样本检测，同时采用已批准上市且目前临床普遍认为质量较好的产品:北京万泰生物药业股份有限公司试剂，名称为:结核分枝杆菌相关Y -干扰素检测试剂盒(体外释放酶联免疫法)作为对照试剂(批准文号为:国食药监械(准)字 2012 第 3400557 号)。每种重组蛋白 ESAT6cl, ESAT6c2, ESAT6c3, ESAT6c4, ESAT6c5 和ESAT6c6各做30例样本。
1.以ESAT6cl为例，数据如表I:
权利要求
1.一种编码结核分枝杆菌ESAT6基因的密码子优化基因序列，其特征在于:其单拷贝核昔酸序列如SEQ ID N0.1所示，2次拷贝串联核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，3次拷贝串联核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，4次拷贝串联核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，5次拷贝串联核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示，6次拷贝串联核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示，ESAT6基因串联次数包括但不限于1-6次。
2.结核分枝杆菌ESAT6串联重组融合蛋白，其特征在于:它由权利要求1所述的密码子优化基因序列编码，其单拷贝氨基酸序列如SEQ ID N0.7所示，2次拷贝氨基酸序列如SEQ ID N0.8所示，3次拷贝氨基酸序列如SEQ ID N0.9所示，4次拷贝氨基酸序列如SEQID N0.10所示，5次拷贝氨基酸序列如SEQ ID N0.11所示，6次拷贝氨基酸序列如SEQ IDN0.12所示，ESAT6蛋白串联次数包括但不限于1_6次。
3.结核分枝杆菌ESAT6串联重组融合蛋白的表达载体，其特征在于:它是将权利要求1所述的密码子优化基因序列分别插入到质粒pET-25b上，得到重组质粒ESAT6cl-pET25b、ESAT6c2-pET25b、ESAT6c3-pET25b、ESAT6c4-pET25b、ESAT6c5-pET25b 或 ESAT6c6_pET25b，载体包括但不限于pET25b。
4.一种表达结核分枝杆菌ESAT6串联重组融合蛋白的工程菌株，其特征在于:它含有权利要求3所述的表达载体,其宿主菌为大肠杆菌iBscherichia coif)。
5.一种基于权利要求2所述的结核分枝杆菌ESAT6串联重组融合蛋白建立的体外检测结核杆菌感染的化学发光法试剂盒，其特征在于:利用权利要求2所述的结核分枝杆菌ESAT6串联重组融合蛋白，刺激受检者的外周血释放Y-干扰素，并通过化学发光的方法测定Y-干扰素的变化，诊断是否感染结核分枝杆菌。
6.一种基于权利要求2所述的结核分枝杆菌ESAT6串联重组融合蛋白建立的体外检测结核杆菌感染的TCELL-SPOT试剂盒，其特征在于:利用权利要求2所述的结核分枝杆菌ESAT6串联重组融合蛋白，刺激受检者的外周血T淋巴细胞，并通过ELISPOT的方法测定斑点形成的多少，诊断是否感染结核分枝杆菌。
7.根据权利要求2所述的结核分枝杆菌ESAT6串联重组融合蛋白在制备单抗、多抗、检测试剂盒及蛋白 芯片中的应用。
全文摘要
本发明公布一种结核分枝杆菌ESAT6串联重组融合蛋白及其应用。本发明提供了一种结核分枝杆菌ESAT6密码子优化方法、串联重组融合方法及融合蛋白制备方法，还提供了该重组融合蛋白在全血IFN-γ结核诊断试剂盒及TCELL-SPOT结核感染诊断试剂盒的制作和应用方法，具有特异性强、灵敏度高等优点，很好的满足了结核(TB)感染临床诊断的需要。
文档编号C12N1/21GK103146715SQ20131007667
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月11日 优先权日2012年7月20日
发明者杨艳坤, 白仲虎, 刘晓磊, 李昕, 朱国珍, 林兴兵, 曹成, 付建军 申请人:郑州博赛生物技术股份有限公司