专利名称：一种核酸检测方法
技术领域：
本发明属于生物技术应用领域，具体涉及核酸检测方法。
背景技术：
1.核酸检测的意义细菌、病毒及其他病原微生物均具有独特的核酸序列，这些特定序列的检测在食品安全、疾病诊断、环境监测等领域起着至关重要的作用。1.1食品安全食品和水与空气 一样是人类生活的必需品，是人类生命的能源。然而，在食品生产、加工、储存、运输和销售的各个环节中，微生物的大量繁殖会引起食品腐败变质，导致食源性感染或食物中毒。随着近年来环境污染的不断加剧，病原微生物对人类所造成的威胁越来越大，尤其是近年来世界各国相继发生的重大食品安全事件，给食品安全敲响了警钟。作为微生物分类和鉴定的重要依据之一，传统的形态学和生理生化方法操作繁琐，需要时间较长，其准备和收尾工作繁重，且需要大量专业技术人员参与。核酸检测技术可特异性识别病原体中的保守核酸序列，已被用于检测大肠杆菌、痢疾杆菌等食物中常见的病原体。1.2疾病诊断分子生物学研究表明基因中核酸序列的微小变化可能导致诸如癌症、心脑血管疾病、遗传性疾病等一系列疾病，致病基因的改变通常发生在病变的早期，因此有可能根据核酸的改变来早期诊断疾病。此外，由于被细菌或病毒感染者携带有细菌或病毒的基因，通过分析个体中细菌或病毒特异的核酸，可诊断传染性疾病，如肺结核、艾滋病等。而这些疾病的检测，对于传染疾病的控制与预防具有重大意义。1.3环境监测随着我国社会经济的发展，环境问题日益突出。环境污染问题不仅影响我国人民的生存环境和生存质量，危害人民的身体健康，同时也制约着我国经济的发展。因此，加强环境保护工作显得越来越重要。环境监测是环境保护工作的基础，环境监测数据是环境管理与决策的基本依据。可以说，离开了环境监测工作的支持，整个环保工作都将陷入被动的局面。核酸检测可准确检测环境中的有害生物，如水样中的霍乱弧菌，空气中的产气荚膜杆菌以及海洋中的已知病菌和有害生物(如某些藻类)等。这对于预防和控制赤潮、水质污染、大气污染等重大环境问题具有重要意义。2.核酸检测的方法发展简易、快速、低成本、可重复利用的核酸检测方法对于以上应用具有重要意义，也是目前核酸检测的发展方向的主要趋势。目前常用的核酸检测方法主要包括电泳法，紫外分光光度法以及荧光法。前两者主要用于终点检测，而荧光法用于实时检测，较前两者对仪器的要求和成本要高。而电泳法操作较繁琐，耗时也长，因而主要用于实验室；紫外分光光度虽然操作简单，耗时也短，但对样品纯度要求较高，易受杂质干扰。因而世界各地都在积极研发简易、快速而低廉的核酸检测方法，其中试纸法不仅完全满足上述要求，而且灵敏度高，特异性好，最近几年倍受专家学者关注；但其中一个突出的问题就是其制备还依赖于昂贵而精密的仪器加工，并且一般只能一次性使用，因而对于一般家庭卫生保健以及长期跟踪，还需要进一步改进和提高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够实现简易、快速、低成本、并且可重复利用的核酸检测方法。为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案。I)确定检测所需的特异性核酸目标片段，然后制备捕获溶液、检测溶液以及对照溶液，所述捕获溶液含有与特异性核酸目标片段的一端互补的捕获探针，捕获探针上连接有显色颗粒，检测溶液含有与特异性核酸目标片段的另一端互补的检测探针，对照溶液中含有与捕获探针互补的对照探针，检测探针以及对照探针上连接有用于与试纸结合的分子;2)将捕获溶液、检测溶液和对照溶液分别注入三支加样笔的笔杆中，所述加样笔还包括笔头，笔头的前端开设有溶液流出孔，溶液流出孔内设置有可以转动的球珠，笔头的后端与笔杆相连通，注入捕获溶液、检测溶液或对照溶液后，用密封油将笔杆密封；3)依次持三支加样笔在试纸上书写线条，由捕获溶液构成的线条A位于试纸的下端，由对照溶液构成的线条C位于试纸的上端，由检测溶液构成的线条B位于线条A与线条C之间；
4)待构成线条的溶液干燥后，将试纸的下端浸润于待测样品中，保持线条A位于待测样品的上方，待线条C显色并稳定后取出试纸，观察线条B的显色情况。所述加样笔还包括用于连接笔头与笔杆的连接装置。所述书写是指将笔头前端接触试纸，然后驱动笔头在试纸上移动，使笔头前端的球珠转动，带动笔杆内的捕获溶液、检测溶液或对照溶液流出，流出的捕获溶液、检测溶液或对照溶液涂敷于试纸上。所述球珠的直径为lOOnm-lcm。所述加样笔的加样量范围为10-1000nL/cm。所述显色颗粒包括天然显色颗粒或激发显色颗粒。本发明所述核酸检测方法利用加样笔在试纸上书写微量的溶液形成捕获线、检测线和对照线，具有加样仪器结构简单，携带方便，操作容易，成本低廉，可重复使用等特点，与传统加样器相比成本降低了一万多倍，同时微量加样的准确性、可靠性极佳，且容易控制，降低了核酸检测的成本，提高了检测速度，简化了检测过程。
图1为本发明所述加样笔的结构示意图；图2为本发明所述试纸上书写的线条示意图；图3为本发明实施例核酸序列检测结果；图4为本发明所述加样笔加样量随书写速度的变化；图5为本发明所述加样笔加样量随前端球珠大小的变化；
图6为本发明所述加样笔加样量随笔杆内填充物(捕获溶液、检测溶液或对照溶液)高度的变化；图中:I笔头，2笔杆，3球珠，4连接装置，5填充物，6密封油；19吸附垫，20硝酸纤维素膜，21对照线，22检测线，23捕获线。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。本发明所述核酸检测方法，包括以下步骤:1)确定检测所需的特异性核酸目标片段，然后制备捕获溶液、检测溶液以及对照溶液，所述捕获溶液含有与特异性核酸目标片段的一端互补的捕获探针，捕获探针上连接有显色颗粒，所述显色颗粒包括天然显色颗粒(如金或四氧化三铁纳米颗粒)或激发显色颗粒(如稀土纳米颗粒等)，检测溶液含有与特异性核酸目标片段的另一端互补的检测探针，对照溶液中含有与捕获探针互补的对照探针，检测探针以及对照探针上连接有用于与试纸结合的分子；2)将捕获溶液、检测溶液和对照溶液分别注入对应三支加样笔的笔杆2中，所述加样笔还包括笔头1，笔头I的前端开设有溶液流出孔，溶液流出孔内设置有可以转动的球珠3，笔头I的后端与笔杆2相连通，注入捕获溶液、检测溶液或对照溶液后，用密封油6 (矿物油)将笔杆2密封，所述加样笔还包括用于连接笔头I与笔杆2的连接装置4，参见图1 ;3)依次持三支加样笔在试纸上书写线条，由捕获溶液构成的线条A位于试纸的下端，由对照溶液构成的线条C位于试纸的上端，由检测溶液构成的线条B位于线条A与线条C之间，所述书写是指将笔头I前端接触试纸，然后驱动笔头I在试纸上移动，使笔头I前端的球珠3转动，带动笔杆2内的捕获溶液、检测溶液或对照溶液流出，流出的捕获溶液、检测溶液或对照溶液涂敷于试纸上，可以实现微量加样；4)待构成线条的溶液干燥后，将试纸的下端浸润于待测样品中，保持线条A位于待测样品的上方，待线条C显色并稳定后取出试纸，观察线条B的显色情况。所述球珠3的直径为100nm-lcm。所述加样笔的加样量范围为10_1000nL/cm。通过调整书写速度(图4)、球珠直径(图5)或笔杆内溶液高度(图6)改变加样笔的加样量，书写速度是指笔头前端在基底上移动的速度，书写速度可以通过驱动机构进行控制，同时，可以在笔杆后端连接填充物补充机构，使笔杆内填充物保持稳定的高度。实施例生物加样笔的结构如图1所示，由6部分组成，笔头I主要提供球珠3的支持点，笔杆2用于储存填充物，球珠3在基底(试纸)上摩擦转动时提供足够的剪切力，带动填充物5流出，连接装置4用于连接笔杆2和笔头1，密封油6防止填充物挥发。当生物加样笔在基底上书写时(类似于圆珠笔或中性笔的书写过程)，笔头I前端的球珠3转动，带动填充物5流出。本发明在进行快速、特异核酸检测时使用生物加样笔A、生物加样笔B和生物加样笔C，检测过程，具体介绍如下: 步骤1:生物加样笔的制备I)根据待测样品，确定检测所需的特异性核酸目标片段，进一步根据该目标片段设计检测所需的捕获探针，检测探针以及对照探针。捕获探针的3’端烷巯基化，巯基用于结合纳米金颗粒，捕获探针与目标片段的5’端互补，从而可以捕获目标片段；检测探针与目标片段的3’端互补，检测探针5’端的生物素用于与链霉亲和素结合；对照探针与捕获探针互补，对照探针3’端的生物素用于与链霉亲和素结合。2)将捕获探针(0.0lnmol-1mmol)和纳米金水溶液(0.01pmol-20nmol)混合,捕获探针与纳米金结合，构成捕获溶液。检测探针和对照探针分别和链霉亲和素(目的是使检测探针和对照探针和硝酸纤维素膜结合)水溶液混合，分别构成检测溶液和对照溶液(10μ M-lmM)。3)将捕获溶液注入生物加样笔A的笔杆中，将检测溶液注入生物加样笔B的笔杆中，将对照溶液注入生物加样笔C的笔杆中，笔杆末端分别用矿物油封住以防止蒸发，从而制成捕获笔(生物加样笔A)，检测笔(生物加样笔B)和对照笔(生物加样笔C)。步骤2:生物加样笔的使用I)将硝酸纤维素膜20剪成合适大小，与吸附垫19以及支持垫组装成空白试纸条。硝酸纤维素膜贴于支持垫一端，吸附垫贴于支持垫另一端，并压住硝酸纤维素膜约2mm。硝酸纤维素膜主要用于固定检测探针和对照探针，吸附垫提供足够的毛细力，维持待测样品的流动，支持垫主要提供试纸条一定的力学性能。2)使用时，用生物加样笔A、B和C分别在空白试纸条上依次画三条线，即构成捕获线23，检测线22和对照线21(图2)，将试纸条浸润于待测样品中，注意不要没过捕获线；15分钟之后观察试纸条显色结果。3)检测线和对照线均显色，表明结果为阳性；检测线未显色，对照线显色，表明结果为阴性；对照线未显色，结果不可靠，需重复上述步骤。例I检测I型艾滋病病毒(HIV-1)特异性核苷酸序列步骤1:生物加样笔的制备。I)根据相关资料确定HIV-15’长末端重复序列(LTR)为待检测的目标片段，设计如表I所示的三条核酸探针以及目标片段和对照片段。捕获探针的3’端烷巯基化，巯基用于纳米金颗粒结合，捕获探针与目标片段5’端互补，从而可以捕获目标核酸片段；检测探针与目标片段3’端互补，其5’端的生物素用于与链霉亲和素结合；对照探针与捕获探针互补，其3’端的生物素用于与链霉亲和素结合。表I核酸序列
权利要求
1.一种核酸检测方法，其特征在于，包括以下步骤 1)确定检测所需的特异性核酸目标片段，然后制备捕获溶液、检测溶液以及对照溶液，所述捕获溶液含有与特异性核酸目标片段的一端互补的捕获探针，捕获探针上连接有显色颗粒，检测溶液含有与特异性核酸目标片段的另一端互补的检测探针，对照溶液中含有与捕获探针互补的对照探针，检测探针以及对照探针上连接有用于与试纸结合的分子； 2)将捕获溶液、检测溶液和对照溶液分别注入三支加样笔的笔杆(2)中，所述加样笔还包括笔头(1)，笔头(I)的前端开设有溶液流出孔，溶液流出孔内设置有可以转动的球珠(3)，笔头(I)的后端与笔杆(2)相连通，注入捕获溶液、检测溶液或对照溶液后，用密封油(6)将笔杆(2)密封; 3)依次持三支加样笔在试纸上书写线条，由捕获溶液构成的线条A位于试纸的下端，由对照溶液构成的线条C位于试纸的上端，由检测溶液构成的线条B位于线条A与线条C之间； 4)待构成线条的溶液干燥后，将试纸的下端浸润于待测样品中，保持线条A位于待测样品的上方，待线条C显色并稳定后取出试纸，观察线条B的显色情况。
2.根据权利要求I所述一种核酸检测方法，其特征在于所述加样笔还包括用于连接笔头(I)与笔杆(2)的连接装置(4)。
3.根据权利要求I所述一种核酸检测方法，其特征在于所述书写是指将笔头(I)前端接触试纸，然后驱动笔头(I)在试纸上移动，使笔头(I)前端的球珠(3)转动，带动笔杆(2)内的捕获溶液、检测溶液或对照溶液流出，流出的捕获溶液、检测溶液或对照溶液涂敷于试纸上。
4.根据权利要求I所述一种核酸检测方法，其特征在于所述球珠(3)的直径为IOOnm-Icm0
5.根据权利要求I所述一种核酸检测方法，其特征在于所述加样笔的加样量范围为IO-IOOOnL/cm。
6.根据权利要求I所述一种核酸检测方法，其特征在于所述显色颗粒包括天然显色颗粒或激发显色颗粒。
全文摘要
本发明提供一种核酸检测方法，将捕获溶液、检测溶液和对照溶液分别注入三支加样笔的笔杆中，依次持三支加样笔在试纸上书写三条相互间隔的线条，将试纸的下端浸润于待测样品中，保持线条A位于待测样品的上方，待线条C显色并稳定后取出试纸，观察线条B的显色情况，本发明所述核酸检测方法利用加样笔在试纸上书写微量的溶液形成捕获线、检测线和对照线，具有加样仪器结构简单，携带方便，操作容易，成本低廉，可重复使用等特点，与传统加样器相比成本降低了一万多倍，同时微量加样的准确性、可靠性极佳，且容易控制，降低了核酸检测的成本，提高了检测速度，简化了检测过程。
文档编号C12Q1/68GK103255208SQ20131007779
公开日2013年8月21日 申请日期2013年3月12日 优先权日2013年3月12日
发明者王琳, 韩玉龙, 胡杰, 徐峰, 卢天健 申请人:西安交通大学