一种人类多肽在制备提高调节性t细胞数量的免疫调节剂中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及人类多肽，具体是一种人类多肽在制备提高调节性T细胞数量的免疫 调节剂中的应用。
【背景技术】
[0002] 0 _淀粉样变多肽（0-amyloidpeptide，A|3 )分子量约4kDa，由|3淀粉样前体 蛋白（0-amyloidprecursorprotein,APP)水解而来，由细胞分泌，在细胞基质沉淀聚积 后具有很强的神经毒性作用。A0经0-和Y-分泌酶的蛋白水解作用而产生的含有39~ 43个氨基酸的多肽。它可由多种细胞产生，循环于血液、脑脊液和脑间质液中，大多与伴侣 蛋白分子结合，少数以游离状态存在。人体内A0最常见的亚型是AegjPAeH2。在人 脑脊液和血中，分别比Af3i_42的含量水平高10倍和1.5倍。A0的沉积不仅与神经 元的退行性病变有关，是阿尔兹海默病人脑内老年斑周边神经元变性的主要特征。
[0003] A0的神经毒性作用在阿尔茨海默病的病程进展中发挥着主要作用。将A0注入 大鼠或猴的大脑皮质中，发现注射部位发生组织坏死，周围神经元缺失及神经角质增生，并 与剂量有明显的相关性。A0对神经系统的毒性作用是使血管壁淀粉样变直接导致血管硬 化，弹性变差，甚至容易破裂或形成血栓，还诱使神经细胞过早凋亡。动物实验显示，A0对 神经元的作用与其状态有关。溶解状态的A0在短时间内可促使神经突生长，提高神经元 的存活率，而沉积状态的A0对神经元呈现相反的作用，引起与阿尔茨海默病相似的病理 变化，即神经突退缩和神经元变性，最显著地改变发生在衰老的哺乳类动物大脑。
[0004] Ae对血管形态及血管功能也具有一定的影响。首先沉积在血管外层基膜，减少了 小动脉平滑肌细胞与基膜的黏附，血管中层被其取代，平滑肌细胞发生变性。研宄发现A0 沉积在毛细血管基膜，并呈板状突入神经毡。Ae促使血管周围纤维沉积，导致了淀粉样血 管病。
[0005] 目前大多数研宄都将Ae定位成阿尔兹海默病的特征性多肽，关于其正常生理功 能及机制研宄甚少。尽管有研宄显示，缺少A0不会导致任何生理功能的丧失，但不少研宄 也证明Ae具有几个潜在的功能，包括活化某些激酶、防止氧化应激、调节胆固醇运输、充 当转录因子及促发炎症。
[0006] 在细胞水平研宄A0的病理生理学特性过程中，我们意外发现A0具有一定免疫 调节功能，能有效诱导Treg细胞形成，进而调节免疫因子分泌。目前治疗自身免疫性疾病 主要以免疫抑制剂、细胞因子、特异性抗原抗体等为主，利用人类多肽来诱导Treg细胞介 导免疫抑制，从而改善自身免疫性疾病的相关研宄较少。值得关注的是，国内外目前还未见 有关A0能诱导Treg细胞并具免疫调节作用的报道。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是将人类多肽（A0)应用于制备免疫调节剂，用于提高体内调节性 T细胞相对数量，以供自身免疫疾病、组织器官移植、GVHR或炎症疾病使用。
[0008] 实现本发明目的的技术方案是：
[0009] -种人类多肽在制备提高调节性T细胞数量的免疫调节剂中的应用，将全长只有 40个氨基酸，序列为DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV的人类多肽制成浓度 为l-1000nmol/L的溶液，用于诱导人外周血单核细胞（Peripheralbloodmononuclear cell，PBMC)转化为⑶4+⑶25+F〇Xp3+调节性T细胞，干预自身免疫性疾病，可应用于防治 自身免疫性I型糖尿病。
[0010] 经实验表明，上述的人类多肽体外预处理人外周血单核细胞（Peripheralblood mononuclearcell，PBMC)，显著增加了⑶4+Q)25+Foxp3+调节性T细胞的构成比，能诱导 ⑶4+⑶25+Foxp3+调节性T细胞，具有增强⑶4+⑶25+Foxp3+调节性T细胞抑制效应的作 用，可以制成作为增强CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞抑制效应的免疫调节剂，以干预自身 免疫性疾病。
[0011] 本发明所述的人类多肽为全长肽由美国康乃狄格州纽黑文市耶鲁大学凯 克生物技术中心（KeckBiotechnologyCenter,YaleUniversity,NewHaven,CT)提供。使 用时需配制成新鲜的ae溶液。
[0012] 所述A0溶液的配制，包括如下步骤：
[0013] I. 1人类多肽（A0 )的氨基酸序列：
[0014]DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV〇
[0015] 1.2A0合成与纯化
[0016] 全长肽A|3 由位于美国耶鲁大学凯克生物技术中心（KeckBiotechnology Center,YaleUniversity,NewHaven,CT)提供，该中心应用t_boc化学合成A0，应用反相 高压液相层析纯化，纯度超过99. 95%。
[0017] 1.3A0溶液配制
[0018] 用1:1的三氟乙酸（TFA)和六氟异丙醇（HFIP)混合溶液预先处理冻干肽A0。将 溶解的A0转移到一个新试管中，经过温和的氮气流动5~10分钟，使TFA/HFIP蒸发消失。 冻干肽溶解在〇. 5%的醋酸溶液中制备成50ymol/L的储备溶液。在使用之前，用培养基 稀释储备溶液，制备新鲜的A0溶液。
[0019] 本发明的积极意义是：首次发现了氨基酸序列为DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDV GSNKGAIIGLMVGGVV的人类多肽，于体外预处理人外周血单核细胞（Peripheralblood mononuclearcell，PBMC)后，显著增加了人CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的数量；可有 效改善免疫病理反应，防治自身免疫性疾病，且无副作用，在自身免疫病、组织器官移植以 及炎症病理等方面，具有广阔的应用前景。
【具体实施方式】
[0020] 下面通过实施例对本
【发明内容】
作进一步的说明。
[0021] 实施例I:A0溶液的制备
[0022] (1)人 0 淀粉样蛋白HtlOiumanbetaamyloidprotein，A|3 )的氨基酸序列为：
[0023]DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV〇
[0024] (2)A0化学合成与纯化：
[0025] 全长肽A|3 由美国耶鲁大学凯克生物技术中心（KeckBiotechnology Center，YaleUniversity，NewHaven，CT)应用t_boc化学合成A0，经反相高压液相层析 纯化，纯度超过99. 95%。
[0026] (3)A0 的溶解
[0027] 用1:1的三氟乙酸（TFA)和六氟异丙醇（HFIP)混合溶液预先处理冻干肽A0。将 溶解的A0转移到一个新试管中，经过温和的氮气流动5~10分钟，使HFIP/TFA蒸发消失。 冻干肽溶解在〇. 5%的醋酸溶液中制备成50ymol/L的储备溶液。在使用之前，用培养基 稀释储备溶液，制备新鲜的A0溶液。
[0028] 实施例2 :A0对人外周血单核细胞的影响
[0029] 2. 1外周血单核细胞原代培养
[0030] 采取健康献血者外周血300毫升，肝素钠抗凝后经密度梯度法，分离外周血单核 细胞（peripheralbloodmononuclearcel1，PBMC)。红细胞裂解和 3 次洗绦后，PBMC计数 达5XIO6细胞/毫升。在96孔板上的PBMC(IOOyl)中，分别加入1，5,10, 50,100, 500,或 lOOOnmol/LA0新鲜配制溶液，阴性对照不加A0，在0)2培养箱分别培养24,48,或72小 时。然后用PHA(lyg/ml)和LPS(2yg/ml)刺激淋巴细胞计数。最后使用奥林帕斯相差显 微镜CKX41-32PH观察细胞的密度、形态、生长情况。
[0031] 实验结果显示：浓度为1~lOOOnmol/L的A0溶液，作用24~72小时后，人 PBMC形态规则，比较亮，未见明显损伤、死亡或者细胞碎片。培养24小时后细胞铺满度超过 70%。与对照组相比，未见明显不同。
[0032] 2. 2上述实验证实：使用浓度范围为1~lOOOnmol/L的A0溶液，作用24~72小 时后，未见A0对人PBMC的生长产生毒性。
[0033] 实施例3:A0诱导人PBMC转化为⑶4+⑶25+Foxp3+调节性T细胞
[0034] 3. 1 分离人PBMC
[0035] 从自身免疫性疾病患者采取分别采取外周血300毫升，经肝素钠抗凝，使用密度 梯度法，分离PBMC。经红细胞裂解和3次洗涤后，PBMC计数达5XIO6细胞/毫升。
[0036] 3.2A0 孵育PBMC
[0037] 在37°C条件下，应用A0溶液（lOnmol/L)孵育24小时，对照组除了不加A0外， 其余相同。
[0038] 3. 3流式细胞仪检测CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞
[0039] 经处理后的人PBMC，在37°C条件下用T细胞表面抗体⑶4和⑶25反应30分钟， 然后用PBS缓冲液冲洗。接着，按50:1加入BDFoxp3缓冲液，固定10分钟。为增加细胞 膜通透性，固定后的PBMC用BDPerm缓冲液30分钟，洗涤2次。在37°C条件下用细胞内 染色剂Foxp3染色30分钟，洗涤3次。最后，将染色后的PBMC重新悬浮在2 %FBS缓冲液 中，进行流式细胞仪（BectonDickinsonFACScan)检测。小鼠免疫球蛋白G同型抗体用作 背景信号参照，结果根据⑶4+⑶25+F〇Xp3+调节性T细胞相对量（⑶4+⑶25+F〇Xp3+调节性 T细胞在CD4+T细胞中的所占百分率）来计算。
[0040] 3. 4实验结果如表1所示
[0041] 表1. 0 -淀粉样变多肽（A0 )诱导人PBMC转化为⑶4+⑶25+Foxp3+调节性T细 胞
[0042]
【主权项】
1. 一种人类多肽在制备提高调节性T细胞数量的免疫调节剂中的应用，其特征在于 :将 全长只有 40 个氨基酸，序列为 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV 的人类 多肽制成浓度为l-1000nm〇l/L的溶液，用于诱导人PBMC转化为⑶4+⑶25+Foxp3+调 节性T细胞。
【专利摘要】本发明公开了一种人类多肽在制备提高调节性T细胞数量的免疫调节剂中的应用，将全长只有40个氨基酸，序列为DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV的人类多肽制成浓度为1-1000nmol/L的溶液，用于诱导人PBMC转化为CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞。该多肽体外预处理人外周血单核细胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC）后，显著增加了人CD4+CD25+Foxp3+调节性Ｔ细胞的数量，在自身免疫病、组织器官移植以及炎症病理等方面，具有广阔的应用前景。
【IPC分类】A61K38-17, A61P37-02
【公开号】CN104800833
【申请号】CN201510248691
【发明人】赵海潞, 张晓溪, 张秋瑾, 赫兰, 隋昳, 廖沁园
【申请人】桂林医学院
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年5月15日