变体iaspp多肽及筛选测定的制作方法

专利名称：：变体iaspp多肽及筛选测定的制作方法变体IASPP多肽及筛选测定本发明涉及鉴定抑制p53与p53抑制多肽间相互作用的试剂的筛选测定并且包括对抑制p53活性而言没有活性的p53抑制多肽变体。肿瘤抑制基因编码行使抑制细胞生长或分裂的功能的蛋白，因此对维持正常细胞的增殖、生长和分化至关重要。肿瘤抑制基因中的突变导致异常的细胞周期进展，由此导致在例如DNA受到破坏时阻滞细胞周期的正常细胞周期检查点被忽视，且受损的细胞不受控制地分裂。正如可提出证据加以证明的那样，目前最深入研究的肿瘤抑制基因是p53。p53基因编码作为转录因子起作用并且是细胞分裂循环的关键调节物的蛋白。其是作为表现出对SV40大T抗原具有结合亲和性的蛋白而被发现的。p53基因编码长度为393个氨基酸、分子量为53kDa的多肽。对作为p53特异性调节物的ASPP家族蛋白的鉴定揭示了调节p53凋亡功能的一种新的机理、参见WO02/12325)。尽管ASPP1和ASPP2刺激p53的凋亡功能2,但相关的iASPP却抑制p53依赖的凋亡3。ASPP家族成员对p53的调节在从蠕虫到人都是进化上保守的23，且已在目前尚未公开的PCT申请PCT/GB04/003492中进行了/>开，在此通过参考的方式将其并入。此外，通过观察到在大比例的受4企肿瘤中当iASPP上升时ASPP1和ASPP2的表达通常会降低反映出ASPP家族涉及肿瘤发展23-5。还观察到在ASPP2表达和B细胞淋巴瘤的临床结果之间的逆相关6。ASPP1和ASPP2是p53激活物而iASPP是p53抑制物的机理基础目前尚不清楚。所有的ASPP家族成员都通过其C末端与p53结合。此外，在ASPP家族成员中同源性最高的区域位于其C末端内部并带有该蛋白家族的特征序列；锚蛋白(Ankryin)重复序列、SH3结构域和含有富含脯氨酸区域的蛋白(ASPP)。ASPP1和ASPP2属于独特类型的含有SH3结构域的蛋白，其中在ASPP1和ASPP2的SH3结构域中的一个关4建性脯氨酸接触残基从Tyr变成了Leu。基于对p53的DNA结合结构域与ASPP2的SH3结构域的共晶体结构分析，表明这样的变化使得ASPP2对p53的DNA结合结构域具有更高的结合亲和性。此外，p53含有具有5个PXXP基序的富含脯氨酸序列，已知该序列为p53诱导凋亡所必需但非细胞周期阻滞所必需7-9。所述p53的富含脯氨酸区域是靶基因，例如PIG3，而非p21wafl或mdm2的p53依赖型反式激活所必需的7'1Q。类似地，ASPP1和ASPP2选择性增强p53反式激活促凋亡基因，例如Bax和PIG3而非p21wafl或mdm2的能力2。此外，特异在人类中发现的最常见的p53多态性位于p53的富含脯氨酸区域中的密码子72上。在人类中，天然存在的氨基酸要么是脯氨酸(Pro)要么是精氨酸(Arg)。然而，大多数脊推动物在对应残基上具有脯氨酸"。在过去10年中已进行了大量细致的研究来研究密码子72位的p53多态变体(p53Pro72和p53Arg72)的表达与癌症易感性之间的联系。然而，由于对p53Pro72和p53Arg72在体内如何行使功能缺乏了解，其结果是令人失望的12"7。令人感兴趣的是，位于p53的残基72的脯氨酸是PXXP基序的一部分，而已知该基序对于接触含有SH3结构域的蛋白的Tyr残基是关键的。在我们目前尚未公开的待审申请PCT/GB04/004341中，我们公开了，其中，筛选调节iASPP与p53间相互作用的试剂的方法，以及iASPP与ASPPl/2偏爱结合p53多态变体p53Pro72，通过参考的方式将申请PCT/GB04/004341并入。在iASPP和ASPP2的SH3结构域中保守的Tyr和Leu分别决定了它们对于p53的富含脯氨酸区域和DNA结合结构域的不同的结合偏好。p53的富含脯氨酸区域是ASPP家族成员调节p53介导的凋亡所必需的。重要的是，ASPP家族成员，特别是iASPP，对p53Pro72的结合与活性调节要比对p53Arg72的结合与活性调节更有效。内源性iASPP水平控制密码子72多态p53的活性，且iASPP的过表达在p53Pro72纯合的肿瘤中发生的频率要比在p53Arg72纯合的肿瘤中高。因此，从iASPP的负调节中逃脱是p53Arg72比p53Pro72更有效地激活凋亡的才几制之一。我们描述了允许鉴定抑制含有iASPP的SH3结构域的iASPP多肽与p53的富含脯氨酸结构域之间相互作用的试剂的其它筛选方法。我们还描述了变体iASPP多肽，其与p53,尤其是p53Pro72的结合降低。根据本发明的一方面，提供如图8中的核酸序列所代表的分离的核酸分子，或在严紧杂交条件下与图8所示核酸分子杂交的核酸分子，其中所述核酸在编码如图9中氨基酸序列所代表的814位上的酪氨酸氨基酸残基的核苷酸密码子处被修饰。在本发明的优选实施方案中，所述核酸分子含有图8所示的核酸序列。优选地，所述核酸分子由图8所示的核酸序列组成。当两个互补的核酸分子具有将它们相互结合的一定量的氢键时，发生核酸分子的杂交。杂交的严紧程度可根据所述核酸周围的环境条件、杂交方法的性质、以及所使用核酸分子的组成和长度改变。关于获得特定严紧程度所必需的杂交条件的计算在Sambrooketal.，MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆实验手册)(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor，NY，2001);以及Tijssen,LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology—HybridizationwithNucleicAcidProbesPartI,Chapter2(生物化学与分子生物学实验室技术一核酸探针的杂交，第一部分，第2章)(Elsevier,NewYork,1993)中已有论述。Tm是在该温度下核酸分子的给定链的50%与其互补链杂交的温度。以下是示例性而非限制性的成组杂交条件极高严紧性(允许具有至少90%—致性的序列杂交)杂交5xSSC，在65。C下，16小时洗涤两次2xSSC,在室温(RT)下，每次15分钟洗涤两次0.5xSSC,在65。C下，每次20分钟高严紧性(允许具有至少80%—致性的序列杂交)杂交5x-6xSSC,在65。C-70。C下，16-20小时洗涤两次2xSSC,在RT,每次5-20分钟洗涤两次lxSSC,在55。C-70。C下，每次30分钟低严紧性(允许具有至少50%—致性的序列杂交)杂交6xSSC，在室温至55。C下，16-20小时洗涤至少两2x-3xSSC，在RT-55。C下，每次20-30分钟次在本发明的优选实施方案中，所述核酸分子是表达载体的一部分，该表达载体优选适用于真核基因表达的表达载体。通常，所述适用包括，以示例而非限制性的方式，提供介导细胞/组织特异性表达的转录控制序列(启动子序列)。这些启动子序列可以是细胞/组织特异的、可诱导的或组成型的。"启动子"是本领域公知的术语，且为了清楚表述，包括仅作为示例提供，而非限制性的以下特征。增强子元件是经常在基因转录起始位点的5'方向发现的顺式作用核酸序列(增强子也可以在基因序列的3，方向发现或者甚至位于内含子序列中)。增强子的功能是增加与所述增强子相连的基因的转录速度。增强子活性响应与增强子元件特异结合的反式作用转录因子(多肽)。转录因子的结合/活性(请参见EukaryoticTranscriptionFactors(真才亥沣争录因子)，由DavidSLatchman所著，AcademicPressLtd,SanDiego)响应多种生理/环境线索，这些线索包括，作为示例而非限制性的，中间代谢物(例如葡萄糖，脂类)，环境效应物(例如光，热)。启动子元件还包括起选择转录起始位点作用的所谓TATA盒以及RNA聚合酶起始选择序列。这些序列还结合多肽，该多肽起协助RNA聚合酶选择转录起始的作用以及其它作用。适用还包括提供协助在真核细胞或原核宿主中保持所述载体的选择性标记和自主复制序列。自主保持的载体被称为游离型载体。之所以游离型载体是所希望的是因为这些分子能够包括大DNA片段(30-50kbDNA)。这类游离型载体在WO98/07876中有述。协助载体编码基因表达的适用包括提供转录终止/聚腺苷酸化序列。这还包括提供内部核糖体进入位点(IRES),该内部核糖体进入位点的作用为最大化以双顺反子或多顺反子表达盒排列的载体编码基因的表达。表达控制序列还包括所谓的基因座控制区(LCR)。当作为转基因构建体进行测定时，这些是赋予所连接基因位置独立性、拷贝数依赖性表达的调节元件。LCR包括将转基因从毗邻异染色质的沉默效应中隔离的调节元件，Grosveldetal"Cell(1987),51:975-985。关于一般的表达载体构建和重组DNA技术有着大量的出版文献。请参见Sambrooketal(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆实验手册)ColdSpringHarbourLaboratory,ColdSpringHarbour,NY及其中的参考文献；Marston,F(1987)DNACloningTechniques:APracticalApproachVolIII(DNA克隆技术实验方法第III巻)IRLPress,OxfordUK;以及DNACloning(DNA克隆)FMAusubeletal,CurrentProtocolsinMolecularBiology(分子生物学当代方法)，JohnWiley&Sons,Inc.(1994)。使用病毒或"病毒载体，，作为治疗剂是本领域公知的。此外，有多种病毒被通常用作传递外源基因的载体。通常采用的载体包括重组{资饰的包膜或非包膜DNA或RNA病毒，优选来自杆状病毒科(baculoviridiae)、孩t小病毒-牛(parvoviridiae)、孩么小核斗唐核酸病毒一牛(picornoviridiae)、疱渗病毒科(herpesveridiae),痘病毒科(poxviridae)、腺病毒科(adenoviridiae)或微小核糖核酸病毒科(picornnaviridiae)。还可以使用利用每一母体载体的有利元件的嵌合载体(参见，例如Feng,etal.(1997)NatureBiotechnology15:866-870)。这类病毒载体可以是野生型的或者可以通过重组DNA技术进行修饰以成为复制缺陷的、条件复制的或具有复制能力的。优选的载体得自腺病毒、腺相关病毒和逆转录病毒的基因組。在本发明的最优选实施中，所述载体得自人腺病毒基因组。特别优选的载体得自人腺病毒血清型2或5。可以通过对Ela和/或Elb编码区中的修饰或删除来减弱这些载体的复制能力(达到被称为"复制缺陷"的程度)。对病毒基因组的其它修饰以达到特定的表达特征或允许重复给药或降低免疫反应是优选的。或者，所述病毒载体可以是条件复制的或具有复制能力的。条件复制型病毒载体被用来在特定细胞类型中达到选择性表达，且同时避免不利的广语感染。条件复制型载体的实例见于Pennisi，E.(1996)Science274:342-343;Russell,andS丄(1994)Eur.J.ofCancer30A(8):1165-1171的描述。其它选择性复制载体的实例包括这样的载体，其中所述病毒复制所必需的基因处于仅在特定细胞类型或细胞状态下具有活性的启动子的控制之下，使得在缺乏这类基因表达时，所述病毒不能复制。这类载体的实例可参见Henderson等人的，授权日为1997年12月16日的美国专利第5,698,443号以及Henderson等人的，授权日为1999年2月16日的美国专利第5,871,726号，通过参考的方式将其全部教导并入本文。此外，可对病毒基因组进行修饰以包括仅在某些条件下完成复制或表达的可诱导启动子。可诱导启动子的实例在科学文献中是公知的(参见，例如,YoshidaandHamada(1997)Biochem.Biophys.Res.Comm.230:426-430;Iida,etal.(1996)J.Virol.70(9):6054-6059;Hwang,etal.(1997)J.Virol71(9):7128-7131;Lee，etal.(1997)Mol.Cell.Biol.17(9):5097陽5105;以及Dreher,etal.(1997)J.Biol.Chem272(46);29364-29371)。还可将病毒设计成选择性复制的病毒。特别优选的选择性复制病毒在WO00/22137和WO00/22136中有述。现已证明复制减弱的病毒也可用于基因治疗。例如，在Elb55K基因中含有特定缺失的腺病毒d11520已被使用且在人类中具有治疗效果(BarkerandBerk(1987)Virology156:107)。这类载体还在McCormick(授权日为1997年10月14日的美国专利第5,677,178号)以及McCormick的授权日为1998年12月8日的美国专利第5,846,945号中有述。本发明还可以与这类载体的给药联合使用从而最小化对此类载体预先存在的或诱导的体液免疫反应。在某些情况下可能颇有价值的是利用或设计载体从而实现在特定细胞类型中引入外源转基因。某些载体对某些组织类型表现出天然的向性。例如，已经证明得自疱渗病毒科属的载体偏爱感染神经元细胞。重组修饰的疱渗病毒科载体的实例已在授权日为1994年7月12曰的美国专利第5,328,688号中公开。还可以通过对病毒包膜蛋白的修饰，使得在得自具有特征性广泛感染性的病毒的载体中实现细胞类型特异性或细胞类型靶向性。例如，已经使用腺病毒载体实现了细胞靶向，通过选择性修饰病毒基因组的knob和fibre编码序列/人而实现与独特细胞表面受体具有特异性相互作用的经修饰的knob和fibre结构域的表达。这些修饰的实例见于Wickham，etal(1997)J.Virol71(ll):8221-8229(将RGD肽包括到腺病毒fiber蛋白中)；Arnberg，etal.(1997)Virology227:239-244(对腺病毒fiber基因进行修饰从而实现对眼和生殖道的向性)；HarrisandLemoine(1996)TIG12(10):400-405;Stevenson,etal.(1997)J.Virol.71(6):4782誦4790;Michael,etal,(1995)GeneTherapy2:660-668(将胃泌素释放肽片段包括到腺病毒fiber蛋白中)；以及Ohno,etal.(1997)NatureBiotechnology15:763-767(将蛋白A-IgG结合结构域包括到辛德毕斯病毒(Sindbisvims)中)。还通过将抗体或抗体片段与包膜蛋白结合实现了细胞特异性靶向的其它方法(参见，例如Michael,etal.(1993)J.Biol,Chem268:6866-6869,Watkins,etal.(1997)GeneTherapy4:1004-1012;Douglas,etal.(1996)NatureBiotechnology14:1574-1578)。或者，可将特定部分结合到病毒表面以实现靶向(参见，例如Nilson，etal.(1996)GeneTherapy3:280-286(将EGF结合于逆转录病毒蛋白))。此外，病毒编码的治疗性转基因还可以处于允许转基因在特定细胞类型中偏好表达的组织特异性启动子区域的控制之下。根据本发明的其它方面，还提供含有氨基酸序列的分离的变体多肽，其中所述多肽通过缺失或取代至少图8所代表氨基酸序列的814位上的酪氨酸氨基酸残基而被修饰。变体多肽可通过任意组合的一个或多个取代，添加，缺失，截短在氨基酸序列上不同。在优选修饰中是那些通过保守氨基酸取代从参考多肽变化而来的。这样的取代是那些由具有类似性质的另一氨基酸取代给定的氨基酸。以下是被认为是保守取代(类似)的氨基酸的非限14制性名单a)丙氨酸，丝氨酸和苏氨酸；b)谷氨酸和天冬氨酸；c)天冬酰胺和谷氨酰胺；d)精氨酸和赖氨酸；e)异亮氨酸，亮氨酸，曱硫氨酸和缬氨酸以及f)苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸。此外，本发明的特征还在于具有与在此公开的多肽序列，或其片段及功能等同多肽具有至少75%—致性的变体多肽序列。在一个实施方案中，所述多肽与本文所述氨基酸序列具有至少85%的一致性，更优选为至少90%的一致性，甚至更优选为至少95%的一致性，更优选为至少97%的一致性，且最优选为99%的一致性。在本发明的优选实施方案中，所述酪氨酸氨基酸残基被亮氨酸氨基酸残基取代。优选地，所述变体多肽仅在814位酪氨酸氨基酸残基处被修饰。优选地，所述变体多肽是由酪氨酸取代亮氨酸。根据本发明的其它方面，提供本发明的经修饰核酸或经修饰多肽作为药物的用途。根据本发明的其它方面，提供含有本发明的经修饰核酸或经修饰多肽的药物组合物。当给药时，本发明的核酸/多肽以药物可接受的制剂进行给药。这样的制剂可以常规地含有药物可接受浓度的盐、緩冲剂、防腐剂、兼容载体、补充性免疫增效剂例如佐剂和细胞因子，以及，任选地，其它治疗剂，例如化学治疗剂。本发明的核酸/多肽可以任何常规方式，包括注射或随时间的逐步输注来进行给药。所述给药可以是，例如，口服、静脉、腹膜内、肌肉、腔内、皮下或透皮的。以有效量给予本发明的组合物。"有效量，，是能够单独，或与其它药剂一起，产生所希望反应的组合物的量。在治疗特定疾病，例如癌症的情况下，所希望的反应是抑制所述疾病的进展。这可以包括仅仅暂时延緩疾病的进展，但更优选的是，其包括永久性阻止疾病的进展。这可通过常规的方法进行监测。这样的量，当然，依赖于待治疗的特定疾病状态、所述疾病状态的严重程度、个体患者的参数，包括年龄、身体健康条件、个头和体重，治疗的持续时间、同时治疗的种类(如果有的话)、给药的具体途径以及在健康从业者所了解的知识和专业技能范围之内的类似因素。这些因素是本领域普通技术人员所公知的，且只需常规实验手段即可处理。一般情况下，优选使用单独组分或其组合的最大剂量，即，根据可靠医学判断的最高安全剂量。然而，本领域普通技术人员应该理解，出于医疗原因、生理原因或实际上任何其它原因，患者都有可能坚持较低的剂量或可耐受的剂量。用于前述方法中的药物组合物优选是无菌的并含有以适于对患者给药的单位重量或体积计量的用于产生所希望反应的有效量的核酸/多肽。可以，例如，通过确定肿瘤的进展、疾病症状的减轻、凋亡的调节等等来测定所述反应。可根据不同的参数，特别是根据所使用的给药模式和患者的状态来选择给予患者的核酸的剂量。其它因素包括所希望的治疗阶段。在初始给药时患者所产生的反应不充分的情况下，可采用较高的剂量直到患者能够耐受的程度(或通过不同的、更加局部化的递送途径达到效果上的更高剂量)。一般地，通常根据标准程序组方和给予lng-0.1mg之间的核酸。给予组合物的其它方法对本领域普通技术人员而言也是公知的，其中药剂剂量、注射时间表、注射位置、给药方式(例如，肿瘤内)等等都与前述不同。向除人类以外的哺乳动物给予组合物(例如，出于检测目的或兽医治疗目的)在与上述基本相同的条件下进行。患者，在本文中，是哺乳动物，优选为人类，且包括非人类的灵长类动物、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫或啮齿类动物。当给药时，以药物可接受的量和药物可接受的组合物来施用本发明的药物制剂。术语"药物可接受的"是指非毒性的材料，其不会干扰活性成分的生物活性作用。这类制剂可常规地含有盐、緩冲剂、防腐剂、兼容载体、以及，任选地，其它治疗剂。当用于药物时，所述盐应该是药物可接受的，但非药物可接受的盐可方便地用于制备其药物可接受的盐且并未被排除在本发明的范围之外。这样的药理和药物可接受的盐包括但不限于从以下酸盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、柠檬酸、曱酸、丙二酸、琥珀酸等等制备的那些。同样，药物可接受的盐能够作为碱金属或碱土金属盐制备，例如钠、钟或4丐盐。如果希望，组合物可以与药物可接受载体组合。在本文中，术语"药物可接受载体"是指适于给予人类的一种或多种相容的固体或液体填充剂、稀释剂或包嚢物质。术语"载体"是指天然或合成的，活性成分能够与其组合从而协助施用的有机或无机成分。药物组合物的组分还能够与本发明的分子共混合，以及以不存在会大量损害所希望药物效力的相互作用的方式彼此混合。所述药物组合物可含有适合的緩冲剂，包括以盐形式存在的乙酸；以盐形式存在的柠檬酸；以盐形式存在的硼酸和以盐形式存在的磷酸。所述药物组合物还可含有，任选地，适合的防腐剂，例如苯扎氯铵；氯丁醇；对羟基苯曱酸酯类(parabens)以及疏柳汞。所述药物组合物可方便地以单位剂量形式呈现，且可通过任何制药领域的公知方法进行制备。全部方法都包括将活性剂与组成一种或多种附加成分的载体相关联的步骤。通常，可将所述活性化合物与液体载体、精细分离的固体载体，或这二者均匀、充分地締合，然后，如果需要的话，将产品成型来制备所述组合物。适合口服给药的组合物可以分离的单位，例如各自含有预定量的活性化合物的胶嚢、片剂、锭剂呈现。其它组合物包括存在于水性液体或非水性液体中的悬液，例如糖浆，酏剂或乳剂。适合肠胃外给药的组合物方便地包括核酸的无菌水性或非水性制剂，其优选地与受者的血液等渗。可根据已知的方法，使用适当的分散剂或润湿剂和助悬剂来配制这样的制剂。无菌注射制剂还可以是存在于非毒性肠胃外可接受稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液，例如，存在于1,3-丁二醇中的溶液。可使用的可接受载体和溶剂是水、林格氏溶液以及等渗氯化钠溶液。此外，无菌的固定油常规地被用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酸酯或甘油二酸酯。此外，诸如油酸的脂肪酸可纟皮用于注射制剂中。适合于口服、皮下、静脉、肌内等给药的载体配方可在Remington'sPharmaceuticalSciences(雷明顿制药-牛学)，MackPublishingCo.,Easton,PA中找到。在本发明的其它优选实施方案中，所述组合物还包括至少一种其它的治疗剂。优选地，所述试剂是化学治疗剂。优选地，所述试剂选自顺铂、卡铂、环磷酰胺、美法仑、卡莫司汀(carmusline)、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、巯嘌呤、柔红霉素、阿霉素、表柔比星、长春碱、长春新碱、放射菌素D、丝裂霉素C、紫杉酚、L-天冬酰胺酶、G-CSF、依托泊戒、秋水仙碱、derferoxaminemesylate和喜树碱。根据本发明的一方面，提供鉴定抑制p53抑制多肽与p53多肽相互作用的拮抗剂的筛选测定，所述方法包括步骤i)形成含有图9中氨基酸序列所代表的多肽或变体氨基酸序列所代表的多肽的制剂，其中所述多肽含有包括814位的酪氨酸氨基酸残基的氨基酸序列和p53多肽或其变体，其中所述p53多肽含有图10a所代表的氨基酸序列的氨基酸残基62-91;ii)加入至少一种待4企测的候选试剂；以及iii)确定所述拮抗剂对所述多肽片段与所述p53多肽相互作用的影响或无影响。在本发明的优选方法中，所述p53抑制多肽含有图9所代表的氨基酸序列的一部分，其中所述部分含有814位的酪氨酸氨基酸残基。在本发明的其它优选方法中，所述p53多肽含有图10a所代表的氨基酸序列的一部分，其中所述部分含有图10a所代表的氨基酸序列的氨基酸残基62-91。在本发明的优选方法中，所述p53多肽在图10a所代表的氨基酸序列的第72位上含有精氨酸氨基酸残基。在本发明的其它优选方法中，所述试剂是多肽。在本发明的优选方法中，所述多肽是抗体或其活性结合部分。优选地，所述抗体或结合部分是单克隆抗体。优选地，所述抗体干扰所述p53抑制多肽在814位酪氨酸和p53的氨基酸残基62-91位上与p53结合。在本发明的优选方法中，所述抗体片段是单链抗体可变区片段或结构域抗体片段。还有可能构建单可变区，即所谓的单链抗体可变区片段(scFv，s)。如果存在有针对特异单克隆抗体的杂交瘤，则通过RTPCR从由所述杂交瘤提取的mRNA中分离scFv，s是在本领域技术人员的知识范围之内的。或者，可采用噬菌体展示筛选技术来鉴定表达scFv，s的克隆。或者，所述片段是"结构域抗体片段"。结构域抗体是抗体的最小结合部分(约13kDa)。这类技术的实例已公开于美国专利第6,248,516号，美国专利第6,291,158号，美国专利第6,127,197号以及欧洲专利EP0368684号，在此以参考的方式将其全文并入。在本发明的其它优选实施方案中，所述抗体是人源化的或嵌合抗体。嵌合抗体是通过重组方法制备的以包含抗体的可变区以及人类抗体的不可变或恒定区。人源化抗体是通过重组方法制备的以组合抗体架区。嵌合抗体是重组抗体，其中全部小鼠或大鼠抗体的V区都与人类抗体的C区组合。人源化抗体都是重组杂种抗体，其融合了来自啮齿动物抗体V区的互补决定区域与来自人类抗体V区的骨架区。也使用来自人类抗体的C区。互补决定区(CDRs)是位于抗体重链N末端和轻链N末端之中的区域，V区的大多数变化被限制在该区域。这些区域在抗体分子的表面形成环。这些环在抗体和抗原之间提供结合表面。来自非人类动物的抗体能够激起针对外源抗体以及将其从循环中清除的免疫反应。当注射给人类个体时，嵌合的和人源化的抗体都具有降低的抗原性，因为在重组杂种抗体内的啮齿动物(即，外源)抗体的量有所降低，而人类抗体区域则不会引起免疫反应。这导致较弱的免疫反应以及抗体清除的降低。很清楚，当在人类疾病治疗中使用治疗性抗体时，这是所希望的。人源化抗体被设计成具有较少的"外源，，抗体区域，并且因此被认为比嵌合抗体的免疫原性更弱。在本发明的其它优选方法中，所述试剂是肽，优选为经修饰的肽。本领域技术人员应该明白，对调节iASPP与p53相互作用的肽的氨基酸序列进行修饰可以增强所述肽对于其靶序列的结合和/或稳定性。此外，对所述肽的修饰还增加所述肽的体内稳定性，由此降低诱导凋亡所必需的肽的有效量。这将会有利地降低可能在体内产生的不希望的副作用。修饰包括，示例性而非限制性的，乙酰化和酰胺化。在本发明的优选方法中，所述肽是乙酰化的。优选地，所述乙酰化是在所述肽的氨基末端进行的。在本发明的其它优选方法中，所述肽是酰胺化的。优选地，所述酰胺化是在所述肽的羧基末端进行的。在本发明的其它优选方法中，所述肽同时^t乙酰化和酰胺化^^饰。或者，或优选地，所述修饰包括在制备重组或合成形式的肽的过程中使用经修饰的氨基酸。本领域技术人员应该理解，经修饰氨基酸包括，示例性而非限制性的，4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、N、乙酰赖氨酸、N、曱基赖氨酸、N6，N、二曱基赖氨酸、N气N气N、三曱基赖氨酸、环己基丙氨酸、D-氨基酸、鸟氨酸。其它修饰包括具有C2、C3或C4烃基R基团的氨基酸任选地被选自卣素(例如，F，Br,1)、羟基或CrCt烷氧基的l、2或3个取代基取代。或者，例如可以通过环化对肽进行修饰。环化是本领域已知的(参见，ScottetalChemBiol(2001)8:801-815;Gdle函netalJ.PeptideRes(2001),57:277-291;DuttaetalJ.PeptideRes(2000)，8:398-412;NgokaandGrossJAmerSocMassSpec(1999),10:360-363)。在本发明的优选方法中，本发明的肽经环化修饰。在本发明的其它优选方法中，所述试剂是适体。核酸具有线性序列结构和部分由所述线性序列以及这些分子所存在的环境所决定的三维结构。常规的治疗分子是小分子，例如肽、多肽或抗体，其结合靶分子以产生激动或拮抗的效果。明显核酸分子也些核酸分子通常被称为适体。适体是小的，通常是稳定的核酸分子，其含有对应于靶分子的结合结构域。鉴定适体的筛选方法在美国专利第5,270,163号中有描述，以参考的方式将其全文并入。适体通常是寡核苷酸，其可以是单链寡脱氧核苷酸、寡核糖核苷酸或经修饰的寡脱氧核苷酸或寡核糖核苷酸。术语"修饰的"包括具有共价修饰的碱基和/或糖的核香酸。例如，经修饰的核苷酸包括具有其糖部分共价连接于低分子量有机基团而非3'位置羟基基团也不是5'位置磷酸基团的核苷酸。因此，经修饰的核普酸还可包括2'取代的糖，例如2，-0-曱基-;2，-0-烃基-;2，-0-烯丙基-;2'-S-烃基-;2'-S-烯丙基-;2，-氟-;2，-卤代或2;叠氮核糖，碳环糖类似物a-异头糖；差向异构糖例如阿拉伯糖，木糖或来苏糖，吡喃糖，呋喃糖，以及景天庚酮糖。经修饰的核苦酸是本领域已知的且包括，示例性而非限制性的，烷基化的噤呤和/或嘧啶；酰化的嘌呤和/或嘧啶；或其它杂环。这些类型的嘧啶和嘌呤是本领域已知的且包括，假异胞嘧啶；N4,N4-桥亚乙基胞嘧啶；8-羟基-N6-曱基腺嘌呤；4-乙酰胞嘧啶；5-(羧基羟基曱基)尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；5-溴尿嘧啶；5-羧基曱基氨基曱基-2-硫尿嘧啶；5-羧曱基氨基曱基尿嘧啶；二氢尿嘧啶；肌苷；N6-异戊基腺嘌呤；1-曱基腺噤呤；l-曱基假尿嘧啶；l-曱基鸟噪呤；2，2-二曱基鸟噤呤；2-曱基腺噤呤；2-曱基鸟嘌呤；2-曱基胞嘧啶；5-曱基胞嘧啶；N6-曱基腺嘌呤；7-曱基鸟嘌呤；5-曱基氨基曱基尿嘧啶；5-曱氧基氨基曱基2-疏尿嘧啶；j8-D-mannosylqueosine;5-曱氧羰基曱基尿嘧啶；5-曱氧基尿嘧啶；2-曱基硫-N6-异戊烯基腺嘌呤；尿嘧啶-5-氧乙酸曱基酯；假尿嘧啶；2-硫胞嘧咬；5-曱基-2-硫尿嘧啶；2-硫尿嘧啶；4-硫尿嘧啶；5-曱基尿嘧啶；N-尿嘧啶-5-氧乙酸曱基酯；尿嘧啶-5-氧乙酸；queosine;2-硫胞嘧啶；5-丙基尿嘧咬；5-丙基胞嘧啶；5-乙基尿嘧咬；5-乙基胞嘧啶；5-丁基尿嘧啶；5-戊基尿嘧啶；5-戊基胞嘧啶以及2,6-二氨基嘌呤；曱基假尿嘧啶；l-曱基鸟噪呤；1-曱基胞嘧啶。本发明的适体是使用常规的磷酸二酯连接的核苷酸并使用本领域已知的标准固相或液相合成技术进行合成的。核苷酸之间的连接可使用其它连接分子。例如，连接基团通过-O-或-S-与毗邻的核苷酸连接，所述连接基团为通式P(O)S，(硫代酯)；P(S)S,(二硫代酯)；P(0)NR'2;P(O)R';P(0)OR6;CO;或CONR'2，其中R为H(或盐)或烃基(1-12C)且R6为烃基(1-9C)。通过本发明所公开的测定容易地检测适体与靶多肽的结合。在本发明的优选方法中，所述方法还包括测定所述试剂对于另一种不同的p53多肽变体的活性的步骤，优选地，所述p53变体是通过替代图10b所代表的核酸序列的密码子72所编码的氨基酸残基进行修饰的。在本发明的优选方法中，所述p53变体在密码子72上有变化，其中所述密码子编码精氨酸或脯氨酸氨基酸残基。根据本发明的其它方面，提供图8中核酸序列所代表的核酸分子，或在严紧杂交条件下与图8所代表的核酸分子杂交的核酸分子，其中所述核酸分子编码包括图8所示氨基酸序列的814位酪氨酸氨基酸残基的肽片段。在本发明的优选实施方案中，所述肽片段的长度为至少8个氨基酸残基。在本发明的其它优选实施方案中，所述肽片段的长度为9个氨基酸残基至18个氨基酸残基。在本发明的其它优选实施方案中，所述肽片段的长度为18个氨基酸残基至32个氨基酸残基。根据本发明的其它方面，提供由本发明核酸编码的肽片段。根据本发明的其它方面，提供含有本发明核酸或肽的免疫原性组合物。优选地，所述组合物还含有佐剂或载体。佐剂是通过调节免疫细胞活性来增强针对抗原的特异性免疫反应的物质或方法。佐剂的实例包括，仅作为示例性的，弗氏佐剂、胞壁酰二肽、脂质体。用以下方式解释术语载体。载体是免疫原性分子，当其结合于第二分子时，能够增强针对后者的免疫反应。一些抗原本质上是不具有免疫原性的(即，凭其本身能力并不具有免疫原性)，但当与外源蛋白分子，例如匙孔血蓝蛋白或破伤风类毒素结合时能够产生抗体反应。这样的抗原含有B细胞表位但没有T细胞表位。这类偶联物的蛋白部分("载体，，蛋白)提供T细胞表位，其能够刺激辅助T细胞，然后依次刺激抗原特异性的B细胞分化为浆细胞并产生针对该抗原的抗体。辅助T细胞还能够刺激其它免疫细胞，例如细胞毒性T细胞，且载体在产生细胞介导免疫以及抗体中能够起到类似作用。根据本发明的其它方面，提供制备产生单克隆抗体的杂交瘤细胞系的方法，包括步骤i)使用本发明的核酸、肽或免疫原性组合物免疫免疫活性哺乳动物；ii)将被免疫的免疫活性哺乳动物的淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞；iii)根据对(i)中免疫原的结合活性筛选由步骤(ii)的杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体；iv)培养所述杂交瘤细胞以增殖和/或分泌所述单克隆抗体；以及v)从所述培养上清液中回收所述单克隆抗体。优选地，所述免疫活性哺乳动物是啮齿动物，例如小鼠、大鼠或仓鼠。根据本发明的其它方面，提供通过本发明方法获得的杂交瘤细胞系。根据本发明的其它方面，提供由本发明的杂交瘤细胞系获得的抗体。根据本发明的其它方面，提供对会从凋亡刺激中获益的动物进行治疗的方法，包括给予本发明的核酸分子或多肽或组合物。根据本发明的其它方面，提供免疫动物的方法，包括给予本发明的核酸或肽或免疫原性组合物。在本发明的优选方法中，所述动物是人。在本发明的其它优选方法中，所述治疗或免疫是癌症治疗或抗癌疫苗接种。优选地，所述癌症是乳腺癌。在本说明书的描述和权利要求中，"包含，，和"含有，，以及这些词的变化形式，例如"包含(comprising)"和"包含(comprises)"都是指"包括但不限于"，而非旨在(也没有)排除其它部分、添加剂、组分、整数或步骤。在本说明书的描述和权利要求中，除非上下文另外要求，否则的话单数形式包括复数形式。具体地，当使用不定冠词时，除非上下文另外要求，否则的话说明书应被理解为指复数以及单数。联系本发明特定方面、实施方案或实施例描述的特征、整数、特性、化合物、化学部分或基团都应该被理解为适用于本文中任何其它方面、实施方案或实施例，除非与它们不相匹配。现在仅示例性地并参考以下附图对本发明的实施方案进行说明。图1说明ASPP2的SH3结构域和iASPP的SH3结构域与p53的富含脯氨酸区域的相互作用具有明显不同的结合亲和性。A显示ASPP1和ASPP2中关于iASPP的Y/L取代以及选定SH3结构域的比对。右图的系统树说明了SH3结构域在这组蛋白中的序列同源性。接触富含脯氨酸区域序列的残基用星号和圆点标出。圆点指示接触位点附近的保守疏水性残基，而星号指示对多聚脯氨酸相互作用起重要作用的那些残基。ASPP家族蛋白的SH3结构域中的关键Y/L残基用方框示出。B显示p53的M243与ASPP2的L1113以及iASPP的Y814之间相互作用的计算机模型。使用体外翻译的[35S]曱硫氨酸标记的ASPP2、iASPP、p53Pro72以及p53Apro，测定了ASPP2和iASPP结合p53Pro72以及结合p53Apro的能力(C)。体外翻译裂解物的等分试样被标记为输入。得自免疫沉淀的信号^皮标记为IP。用箭头标出ASPP2、iASPP、p53Pro72以及p53Apro的表达水平。使用磷屏成像仪(MolecularImagerFX，Biorad)对图1B的信号进行定量。如实'验方法所述计算与ASPP2或iASPP形成复合体的p53Pro72和p53Apro的百分比(D，左图)。为了比较ASPP2和iASPP对p53的富含脯氨酸区域的结合特异性，与ASPP2或iASPP形成复合体的p53Pro72的量被设定为100%(D,右图)。通过用从p53Apro图中得到的信号除以得自p53Pro72的信号获得与ASPP2或iASPP形成复合体的p53Apro的量(D，左图)。图2说明iASPP的SH3结构域中的Y814调节其对于p53的富含脯氨酸区域的结合特异性。体外免疫沉淀表明iASPP的残基814的突变降低了其与p53形成复合物的能力，而在相同条件下，这一突变不影响iASPP结合p53Apro的效率(A)。图3说明p53的富含脯氨酸区域序列是ASPP家族蛋白及其突变体调节p53的反式激活(A和B)和凋亡(C和D)功能所必需的。在Saos-2细胞中，比较了ASPP家族蛋白及其突变体对p53和p53Apro的反式激活(A和B)和凋亡功能(C和D)的影响。用于所述分析的表达质粒已标出且其蛋白表达水平在免疫印迹中显示。箭头表示单个蛋白的迁移。图4说明显示iASPP的Y814和ASPP2的L1113在与p53的脯氨酸(A)和精氨酸(B)接触时的重要性的计算机模型。在体外(C)和体内(D)ASPP蛋白对p53Pro72比对p53Arg72都具有更高的结合亲和性。在体外翻译p53Pro72、p53Arg72、ASPP1、ASPP2和iASPP并使用[358]曱石克氨酸对其进行标记。用V5表位标记ASPP1、ASPP2和iASPP且用抗V5的抗体将其免疫沉淀(IP:V5)。如实-睑方法所述计算与ASPP1、ASPP2和iASPP形成复合体的p53Pro72或p53Arg72的百分比。在以相似水平表达p53Pro72和p53Arg72的结肠直肠细胞系RKO中测定单个ASPP蛋白与内源性p53Pro72选择性形成复合物的能力(D)。用依托泊戒(10jiiM)处理8小时的RKO细胞被标记为(+)。用于免疫沉淀内源性ASPP1、ASPP2和iASPP的抗体分别是兔多克隆抗体1.88、DX77和iASPP.18,且分别使用小鼠单克隆抗体LX54.2、DX54.10和LX049才全测由所述抗体免疫沉淀的ASPP1、ASPP2和iASPP蛋白的量。通过抗体DO.l检测p53Pro72和p53Arg72。在图4E中分析了ASPP2/L1113Y和iASPP/Y814与p53Pro72和p53Arg72形成复合物的能力。如图1以及实验方法所述计算与p53的两种p53多态变体形成复合物的ASPP2、iASPP及其突变体的百分比。图5说明ASPP家族蛋白选择性地调节p53Pro72的反式激活(A和C)和凋亡功能(B，D和E)。如所标明的，在存在或不存在ASPP1、ASPP2、iASPP或其突变体的情况下用p53Pro72或p53Arg72转染Saos-2细胞。柱状图代表至少三次独立实-险的平均值。p53Pro72、p53Arg72、ASPP1、ASPP2、iASPP及其突变体的表达水平在下方的图中显示。图6说明内源性的iASPP表达水平指示p53Arg72和p53Pro72的活性。Western印迹显示ASPP家族成员在H1299和Saos-2细胞中的表达水平(A)。在H1299细胞中，ASPP1和ASPP2的表达将p53Pro72的凋亡功能提高至与p53Arg72类似的水平(B)。在H1299和Saos-2细胞中，iASPP的RNAi对p53Pro72反式激活Bax启动子的能力的增强作用比对p53Arg72更强(C)。在H1299细胞中，iASPP的RNAi还增强了p53Pro72的凋亡功能，但对p53Arg72的增强较小。在相同条件下，在Saos-2细胞中使用iASPP的RNAi观察到小得多的效果(D)。图6D的左图显示iASPP的RNAi降低内源性iASPP表达的能力。用表达iASPP的RNAi的pSuper质粒与细胞表面标记H2K—起转染H1299细胞使得能够从未转染细胞(H2K-细胞)中分离转染细胞(H2K+细胞)。图7说明(A)显示在不同种类肿瘤样本中，与其对应的正常样本相比，iASPP过表达的频率的柱状图。其百分比得自表2。(B)图示显示了ASPP2和iASPP差异调节p53密码子72多态变体的凋亡功能；图8为人iASPP的核酸序列；图9为人iASPP的氨基酸序列；图10为人p53的氨基酸序列；以及表1和表2说明iASPP在表达野生型或突变体p53的人类乳腺肿瘤样本(DCIS，1-2-3级)中的mRNA表达。向上的箭头代表与其对应的正常样本相比iASPPmRNA过表达。表2显示在具有野生型p53或突变体p53的肿瘤样本中，p53Pro72纯合的(PP)或p53Arg72纯合的(RR)过表达iASPP的肿瘤样本的百分比。"n"代表每个类别中的样本数。实验方法细胞和抗体在补充有10%FCS的DMEM中培养细胞。DO-l是小鼠抗-p53抗体。V5表位被小鼠单克隆抗体V5识别。CD20Leu是特异于细胞表面标志物CD20的FITC偶联的单克隆抗体(BectonDickinson)。针对ASPP1和ASPP2的小鼠和兔抗体之前已进行过描述(兔抗ASPP1抗体pAbASPPl.88，兔抗ASPP2抗体pAbDX77兔抗iASPP抗体pAbiASPP.18,小鼠单克隆抗ASPPl抗体LXOll，小鼠单克隆抗ASPP2抗体DX54.10,小鼠单克隆抗iASPP抗体miASPP49.3)2，28，29。质粒用V5表位标记ASPPl、ASPP2、ASPP2L1113Y、iASPP和iASPPY814L表达质粒。对于p53的瞬时表达，使用的是pCB6质粒，而用于体外结合测定的p53Arg72和p53Pro72则被克隆到pSP65载体中。p53△pro被克隆到pcDNA3载体中。反式激活测定在转染前24小时将Saos-2或H1299细胞(5x105)平板接种于6cm培养皿中。所有反式激活测定都含有1/xg报道质粒。如所指明的使用50ng的p53Pro72或p53Arg72、4/ig的ASPP1或ASPP2、500ng的iASPP表达质粒。在图5C中，如所指明的还使用3]tig含有iASPPRNAi的pSuper质粒共转染细胞。转染后16-24小时将细胞在报道裂解緩冲液(ReporterLysisBuffer)中裂解并使用荧光素酶测定试剂盒(Promega,WI，USA)进行分析。通过用转染质粒的活性除以单独载体的活性确定特定报道物的活性倍数。流式细胞术在转染前24-48小时将细胞(106)平板接种于10cm培养皿中。全部细胞都使用作为转染标记的2jugCD20表达载体进行转染。如所指明的，转染包括1/xg的人p53Pro72或p53Arg72,2gg的p53口pro，10/ig的ASPP1、ASPP2或ASPP2L1113Y，1/ig的iASPP或iASPPY814L以及8/ig含有iASPP的RNAi的pSuper质粒。转染后36小时，如前所述收集附着与漂浮的细胞并进行分析15。蛋白质生物化学对于Western印迹，将细胞裂解于诺纳德P-40(NP40)裂解緩冲液或荧光素酶报道物裂解緩沖液(Promega)中。将15-50/xg的蛋白提取物上样到SDS-PAGE凝胶上。对于免疫沉淀，将细胞裂解于NP40裂解緩冲液中并使用蛋白G珠子在4。C进行1小时的预清除。测定蛋白浓度，然后将l-2mg所述提取物与预结合于蛋白G珠子的抗体在4。C下孵育4小时或过夜。将珠子在NP40裂解緩冲液中洗涤两次并在NET緩冲液中洗涤两次。将IP珠子与5X样本緩冲液混合并上样至SDS-聚丙烯酰胺凝胶。将凝胶转移(湿的)至Protran硝酸纤维素膜，将所得印迹首先与初级抗体孵育，然后与适合的第二HRP偶联抗体(Dako)孵育。在使用ECL底物溶液后将所述印迹暴露于Hyperfilm(AmershamLifeScience)。使用对衍生自在IP中使用的不同物种的这些蛋白具有特异性的抗体来测定内源性ASPP1、ASPP2、iASPP、p53Pro72和p53Arg72的表达。体外翻译和免疫沉淀使用TNTT7和TNTsp6快速偶联转录-翻译系统(Promega)对p53Pro72、P53Arg72、p53Apro、ASPP1、ASPP2、ASPP2L1113Y、iASPP以及iASPPY814L进行体外翻译并使用["S]曱硫氨酸进行标记。将含有所标出蛋白的裂解液在30。C孵育1小时。将固定于蛋白G-琼脂糖珠子上的抗V5抗体加入结合反应混合物中并在转盘上在4。C孵育16小时。然后用PBS洗涤珠子。将结合的蛋白释放于SDS凝胶样本緩沖液中并通过SDS-10。/。聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。通过放射自显影显示结果。iASPP的siRNA的构建和转染如前所述将衍生自iASPP的寡核苷酸(19bp)连接到pSuper表达质粒中3G。通过测序验证含有正确的iASPP的19bp寡核苷酸的质粒。用于本研究中的iASPP的有义和反义寡核苷酸的序列如下(小写字母表示来自于pSuper的载体序列；大写字母表示RNAi的靶序列)iASPP的有义(S)和反义(A)寡核苷酸5'gatccccTGTCAACTCCCCCGACAGCttcaagagaGCTGTCGGGGGAGTTGACAtttttggaaa3'A:AGTTGACAggg3'对于转染，将1x106的H1299或Saos2细胞平板接种到10cm培养皿中。使用2.5/xgpMACSH-2KK与pSuper—起或与pSuper-si-RNAiASPP—起(10/ig)转染细胞。转染后48小时，根据制造商的说明，使用MACS系统(MiltenyiBiotec)分离表达pMACSH-2KK质粒的细胞。这产生了两种细胞群表达HJKK(转染)的细胞以及不表达H_2KK(非转染细胞)的细胞。使用RIPA緩冲液在水上裂解这两种细胞群30分钟，然后在4°C20OOOg离心30分钟。肿瘤和对应的正常对照的实时RT-PCR乳腺癌都是没有特别类型的导管癌。在测定之前通过组织学证实存在有足量部分的肿瘤组织。如前所述进行密码子72的单核苷酸多态性31。如文中所述，通过单链构象多态(SSCP)和测序分析p53中的突变。使用TaqManPCR测定ASPP家族成员的表达。引物序列如下iASPP正向caggcggtgaaggagatgaacg反向aaatccacgatagagtagttggcgc探针[FAM]-cccgagccagcccaacgagg-[TAMRA]实施例1ASPP2和iASPP对p53的富含脯氨酸区域和DNA结合结构域具有不同的结合偏好对ASPP家族成员的SH3结构域与来自其它蛋白的那些SH3的比对表明，对ASPP1和ASPP2而言，在残基1075和1113位上分别存在着Leu替换了高度保守的Tyr的情况。有意思的是，在iASPP中对应的残基是Tyr(Y814)(图1A)。ASPP2中的Leu(1113)能够容纳在p53的DNA结合区中发现的Met(243)的侧链。相反，iASPP含有经典SH3结构域序列，其中Tyr有可能引起与p53-Met的抵触(图1B)。因此，我们使用体外翻译的p53Pro72、含有p53富含脯氨酸区域(残基62-91)7内部缺失的p53Apro、ASPP2和iASPP检测了p53的富含脯氨酸区域是否可能是ASPP家族成员的第二结合位点。还比较了ASPP2和iASPP对p53的富含脯氨酸区域的结合亲和性。支持我们的理论，与ASPP2和iASPP形成复合物的p53Pro72和p53Apro的量存在很大差异(图1C)。为了评估p53富含脯氨酸区域在介导p53与ASPP2和iASPP相互作用中的必要性，将p53Pro72/ASPP2和p53Pro72/iASPP的百分比强制i殳定为100%。如图1D所示，ASPP2和iASPP均与p53Pro72和p53Apro相互作用。然而，缺失残基62-91(p53Apro)将对iASPP的结合降低至26%。相反，p53Apro对ASPP2的结合能力却保持在约70%。这些结果表明ASPP家族成员既结合p53的富含脯氨酸区域也结合DNA结合结构域。除此之外，iASPP对p53的富含脯氨酸区域具有较高的结合亲和性，而ASPP2则更倾向于p53的DNA结合结构域。实施例2iASPP的SH3结构域中的Y814决定了其对p53的富含脯氨酸区域的结合特异性为了研究在ASPP2(L1113)和iASPP(Y814)的SH3结构域中发现的氨基酸序列差异是否是iASPP与ASPP2对p53的富含脯氨酸区域结合特异性的决定性因素之一，我们使用寡核苷酸定向诱变向iASPP和ASPP2中引入了氨基酸互换。iASPP的Y814净皮换成了Leu而ASPP2的Leul113则被换成了Tyr,并且还在体外测定中比较了ASPP2和iASPP与ASPP2/L1113Y和iASPP/Y814L结合p53和p53△pro的效率。有意思的是，尽管免疫沉淀了稍微更多的iASPP/Y814L,但与iASPP/Y814L形成复合物的p53的量低于与iASPP形成复合物的p53的量。在相同条件下，使用iASPP和iASPP/Y814L共免疫沉淀了类似量的p53Apro(图2A)。iASPP结合p53口pro的效率并未受到这一突变的影响(图2A,下图)。相反，ASPP2的SH3结构域中在残基1113位上Tyr对Leu的取代未影响其与p53Pro72的结合(图2B)。在对蛋白输入进行标准化之后，可以清楚地看到，与iASPP/Y814L形成复合物的p53Pro72的量非常类似于p53Apro的量(图2C)。与ASPP2相比，使用ASPP2/L1113Y观察到了p53结合的升高，尽管升高程度在所进行的不同实验中有所变化。与ASPP2和ASPP2/L1113Y形成复合物的p53Pro72与p53口pro的百分比的差异分别为4%和8%(图2C)。总而言之，这些结果表明iASPP的Y814对于其结合p53的富含脯氨酸区域的能力是至关重要的。ASPP2/L1113Y对于p53Pro72而非p53Apro的结合能力的有限程度的升高与ASPP2的Tyrl113更偏爱其SH3结构域与p53的富含脯氨酸区域之间相互作用的假说相一致。实施例3p53的富含脯氨酸区域是ASPP蛋白家族调节p53的凋亡功能所必需的使用p53Pro72和p53Apro对p53富含脯氨酸区域与ASPP家族蛋白之间相互作用的生物学后果进行检测。与我们之前的观察相一致，ASPP1或ASPP2的表达刺激了p53Pro72对人类Bax启动子而非mdm2启动子的反式激活活性。然而，即使表达了类似量的ASPP1和ASPP2,对p53Apro也没有观察到刺激效果(图3A和3B)。类似的，ASPP家族蛋白的表达也不影响p53Apro的凋亡功能，尽管ASPP1和ASPP2的共表达刺激p53Pro72的凋亡功能且在相同条件下iASPP抑制p53Pro72的凋亡功能(图3C)。这些发现说明p53的富含脯氨酸区域是ASPP家族蛋白调节p53反式激活和凋亡功能所必需的。为了进一步证实在iASPP依赖的p53Pro72凋亡功能抑制中结合p53的富含脯氨酸区域的重要性，我们采用了流式细胞术来检测iASPP/Y814L抑制p53依赖的凋亡的能力。与得自结合测定的结果相一致，iASPP/Y814L几乎完全丧失了其抑制由p53Pro72诱导的凋亡的能力(图3D)。iASPP/Y814L不能够抑制p53Pro72诱导的凋亡不是缘于缺乏蛋白表达。重要的是，iASPP、ASPP2、iASPP/Y814L和ASPP2/L1113Y对p53Apro的凋亡功能没有影响(图3D)。这些结果证明，iASPP通过其与p53的富含脯氨酸区域的结合显著抑制p53的凋亡功能，且iASPP的Y814在控制iASPP的这一活性中起关4建作用。除此之外，与p53的DNA结合结构域的结合并不足以使ASPP1和ASPP2增强p53的凋亡功能。p53的富含脯氨酸区域是ASPP1和ASPP2刺激p53反式激活和凋亡功能所必需的。ASPP2/L1113Y的降低的促凋亡功能也说明在ASPP2的促凋亡功能和其结合p53富含脯氨酸区域的能力之间存在着负相关。这可能是调节ASPP家族蛋白的促凋亡和抗凋亡性质的机理性决定因素之一。实施例4ASPP家族成员的SH3结构域，特别是iASPP的SH3结构域，能够在体外和体内选择性结合p53Pro72p53的富含脯氨酸区域跨越残基62-917。有意思的是，在72位的脯氨酸残基是存在于p53中的PXXP基序的一部分，意味着Pro72是p53中接触iASPP的关键氨基酸之一。进行了根据现有的ASPP2/p53共晶结构(PDB编码1YCS)的基于计算机的三维结构建模研究。开始时根据ASPP2进行iASPP建模，并根据1YCS的复合物结构与p53对接。在最小化之后，对iASPP-p53复合物进行了研究从而4笨索p53DNA结合区域与ASPP2的结合界面和p53DNA结合区域与iASPP的结合界面之间的区别。为了研究p53的富含脯氨酸区域中的哪部分结合ASPP家族，进行了序列和结构研究。鉴定了在密码子72位含有精氨酸和脯氨酸的区域。对此聚脯氨酸螺旋进行了建模并根据Grb2-SOS复合物(1AZE)的结构与ASPP2和iASPP对接。结构研究表明，正如根据其它SH3-聚脯氨酸复合物的分析所期望的那样，iASPP的Y814是与脯氨酸接触的重要残基。当这一残基被突变为Leu时，正如在ASPP2中的情况那样，就会产生大的缺口并且丧失疏水/芳香性接触(图4A)。除此之外，当位于密码子72的脯氨酸被改变为精氨酸时，会对p53和iASPP之间的相互作用产生重大影响。由于ASPP2的1113位的Leu的侧链较小，对p53/ASPP2相互作用的影响要'J、一些(图4B)。这些结果表明，ASPP家族成员，特别是iASPP,对常见的p53多态变体p53Pro72和p53Arg72具有不同的结合亲和性。为了正式检测这一假说，我们使用体外翻译的p53Arg72、p53Pro72、ASPP1、ASPP2和iASPP。如图4C所示，ASPP1和ASPP2与p53Pro72締合的效率比与p53Arg72締合的效率更高，但最显著的差异是在iASPP/p53Pro72和iASPP/p53Arg72之间观察到的，很清楚地iASPP偏好结合p53Pro72。进一步在RKO细胞，一种表达野生型p53且p53Pro72/p53Arg72杂合的结肠直肠细胞系中研究了p53Pro72和ASPP家族成员之间的偏好结合。如图4D所示，与iASPP共免疫沉淀的p53Pro72的量清楚且可重复地高于p53Arg72的量，尽管p53Pro72和p53Arg72在RKO细胞中表达的量类似。还观察到ASPP2对p53Pro72的选择性结合。还观察到类似才莫式的ASPP1对p53Pro72的选择性，但程度要弱很多。因为iASPP的Y814有可能接触p53的残基72位上的脯氨酸，所以也检测了iASPP/Y814L和ASPP2/L1113Y结合p53Pro72和p53Arg72的能力。与之前的发现相一致，iASPP/Y814L结合p53Pro72的能力有清楚的下降，但结合p53Arg72的能力没有降低(图4E)。有意思的是，ASPP2/L1113Y对p53Pro72的结合要略好于ASPP2。在相同条件下，ASPP2和ASPP2/L1113Y都以类似的效率结合p53Arg72。这些结果与这样的发现相一致，即ASPP家族蛋白结合p53的富含脯氨酸的区域，以及iASPP对p53Pro72的富含脯氨酸区域的结合亲和性要比ASPP2高。我们的数据还证明，ASPP家族蛋白，特别是iASPP,在体外和体内选择性地与常见的p53多态变体相互作用。iASPP(Y814)和ASPP2(Ll113)的SH3结构域中的关键性单个残基对于介导ASPP家族蛋白与p53的两个多态变体p53Pro72和p53Arg72之间的选择性相互作用具有重要作用。实施例5ASPP家族成员选择性调节p53Pro72的活性确立了ASPP家族成员，尤其是iASPP,选择性地与两个p53密码子72的多态变体相互作用，我们然后研究了这两种p53多态变体是否受到ASPP家族蛋白的差异功能调节。在Saos-2细胞中，当单独表达时，p53Pro72对于Bax启动子和PIG3启动子的反式激活活性类似于或高于p53Arg72(图5A)。此外，ASPP1和ASPP2提高p53Pro72反式激活活性的能力也大大高于对p53Arg72的能力。类似地，共表达ASPP1和ASPP2也有效地刺激p53Pro72的凋亡功能。然而，在相同条件下，ASPP1和ASPP2对p53Arg72的凋亡功能却只有最小的影响(图5B)。此外，iASPP对p53Pro72的反式激活和凋亡功能的影响也远远高于对p53Arg72的影响(图5C和5D)。与体内结合结果相一致，iASPP/Y814和ASPP2/L1113Y的表达对p53Arg72的凋亡功能没有影响，尽管iASPP/Y814L的表达未能抑制由p53Pro72诱导的凋亡，而ASPP2/L1113Y的表达对p53Pro72具有降低的共激活作用(图5E)。综上，这些结果清楚地说明，ASPP家族蛋白选择性调节多态p53变体p53Pro72和p53Arg72的反式激活和凋亡功能。实施例6iASPP的水平指示p53多态变体的活性首先通过检测ASPP1、ASPP2和iASPP在H1299和Saos-2细胞中的表达水平来测试内源性ASPP家族蛋白在体内调节两种多态p53变体活性的能力。尽管在两种细胞系中ASPP1和ASPP2的水平是类似的，但H1299细胞比Saos-2细胞多表达3-5倍的iASPP(图6A)。有意思的是，在H1299细胞中，p53Arg72诱导凋亡的活性比p53Pro72更强。在Saos-2细胞中，其中iASPP的表达水平仅为在H1299细胞中观察到的水平的1/5,p53Arg72诱导凋亡的活性并不比p53Pro72更强(图6B)。与此相一致，ASPP1和ASPP2的外源性表达将p53Pro72的活性提高到与在H1299细胞中使用p53Arg72所观察到的水平相类似的水平(图6B,右图)，这说明内源性iASPP的抑制活性能够被ASPP1或ASPP2的过表达抵消。这些结果清楚地表明两种p53多态变体的凋亡功能受到细胞情况的影响，并暗示细胞中的iASPP表达水平影响多态性p53变体的凋亡功能。iASPP对p53Pro72比对p53Arg72更有效地结合意味着p53Arg72对iASPP的抑制作用较不敏感，这是部分解释在H1299细胞中p53Arg72的凋亡诱导活性相对更强的机理。使用RNA干扰来降低内源性iASPP的表达来进一步测试iASPP影响p53Pro72和p53Arg72活性的能力。在Saos-2细胞中，iASPPRNAi分别刺激了p53Arg72和p53Pro72对Bax启动子的反式激活活性1倍和2倍(图6C)。在H1299细胞中，iASPP的RNAi增强了p53Arg72和p53Pro72对Bax启动子的反式激活功能7倍和33倍。类似地，iASPP的RNAi在H1299细胞中比在Saos-2细胞中对p53凋亡功能的影响更强。通过RNAi降低的内源性iASPP表达显著增强了H1299细胞中p53Pro72的凋亡功能(图6D)。与iASPP在H1299细胞中的表达水平高于在Saos-2细胞中的表达水平的发现相一致，由iASPPRNAi诱导的p53Pro72凋亡功能的增加程度在Saos-2细胞中也远小于在H1299中的程度。这些结果证明，ASPP家族成员，尤其是iASPP，是两种p53多态变体的凋亡功能的关键决定物。实施例7iASPP过表达在p53Pro72纯合的肺瘤中的频率显著更高为了进一步研究我们的发现的生物学与潜在的临床重要性，我们使用TaqMan(实时)RT-PCR检测了iASPP在p53Arg72(>1=62)纯合的或p53Pro72(11=16)纯合的对应的正常和人类乳腺癌中的表达水平(表1)。详细的分析表明，在野生型p53的情况下，iASPP过表达的频率在p53Pro72纯合体中要显著高于在p53Arg72纯合体中(表2)。尽管iASPP在90%(14/15)的p53Pro72纯合的肿瘤中过表达，但仅有32%(15/47)的p53Arg72纯合的肿瘤过表达iASPPmRNA(表1、表2和图7A)。p53Pro72纯合的和p53Arg72纯合的肿瘤中iASPP过表达的频率的差异是统计显著的(pO.Ol)。这些结果暗示iASPP的过表达可能是使p53Pro72的肿瘤抑制功能在这些肿瘤中失效的机理之一。iASPP的过表达可能为p53Pro72纯合的肿瘤在肿瘤发生过程中提供选择性生长优势。同样地，能够特异性破坏p53Pro72与iASPP之间相互作用的分子可能允许在这些肿瘤中重新激活p53的凋亡功能。在此我们显示富含脯氨酸区域是ASPP家族成员对p53的第二结合位点。这一初始观察引导我们描绘出ASPP家族成员调节p53的凋亡功能的新机制。我们提供了p53的富含脯氨酸区域对iASPP的结合比对ASPP1(数据未显示)和ASPP2的结合更有效的证据。这一发现提供了iASPP抑制而ASPP1和ASPP2刺激p53凋亡功能的机理基础的分子解释。iASPP/Y814L不能结合p53的富含脯氨酸区域以及抑制p53的凋亡功能首次证明了iASPP主要通过其选择性结合p53的富含脯氨酸区域的能力来抑制p53的凋亡功能。相反，之前的研究表明许多蛋白能够通过其与p53的富含脯氨酸区域相互作用的能力来刺激p53的活性。结合富含脯氨酸区域以及增强p53的乙酰化是p300刺激p53的反式激活功能的机理之一18。共抑制物mSin3a蛋白与p53富含脯氨酸区域的结合也能够增加p53的稳定性和反式抑制功能19，这是与p53的凋亡功能紧密关联的p53的性质之一加。此外，IkbA能够结合p53的富含脯氨酸区域并增强p53介导的凋亡。IkbA的这一相互作用需要在Ser46对p53进行磷酸化21。我们尚不清楚p53的富含脯氨酸区域涉及活化p53全部凋亡功能的确切机理。然而，本研究的结果暗示结合p53的富含脯氨酸区域且防止其它活化物例如p300、Sin3A和IkbA结合p53的相同区域有可能是iASPP抑制p53凋亡功能的机理之一。在缺乏p53富含脯氨酸区域与ASPP家族成员之间的任何共晶结构信息的情况下，iASPP结合p53的富含脯氨酸区域是否能够改变p53的蛋白构象并改变p53结合DNA、ASPP1、ASPP2和其它p53相互作用伙伴的能力仍不清楚。尽管如此，本文中的发现还是提供了引人注目的可能性，即结合iASPP并消除其抗凋亡功能是p53的富含脯氨酸区域为其完全凋亡功能所必需的原因之一。为了提供对这些问题的详细分子解释，需要对含有富含脯氨酸区域序列的p53的进一步结构研究。ASPP1和ASPP2不能够刺激缺失富含脯氨酸区域的p53突变体，p53Apro，以及p53Arg72的凋亡功能说明对iASPP抑制活性的抵消是ASPP1和ASPP2刺激p53凋亡功能的主要机理之一(图7B)。对ASPP家族成员对两个p53结合位点，即富含脯氨酸区域和DNA结合结构能够特异性破坏在此报道的发现还揭示了对调节p53多态变体p53Pro72、p53Arg72的凋亡功能的^/L制的新认识。ASPP家族蛋白对p53的调节是进化保守的，且ASPP家族中最保守的成员以及存在于线虫(C.e/ega""3中的唯一ASPP家族成员就是iASPP。因此，值得注意的是iASPP对p53Pro72比对p53Arg72具有更高的结合亲和性。p53在密码子72上的多态性仅存在于人类中且p53Arg72是人类特异的。除此之外，编码p53Pro72的等位基因的频率在不同种族人群中有差别。p53Pro72纯合个体的数量与绊度密切相关，并且在居住于赤道附近的黑人人群中要高的多，说明p53Pro72是在具有高水平紫外光的环境中被选择的22'23。对这种选择的分子解释可能是ASPP家族蛋白，尤其是iASPP，选择性地调节p53Pro72的凋亡功能。在对各种逆境信号作出反应中，有两条途径涉及到调节p53Pro72或p53Arg72的凋亡功能。之前已经显示p53Arg72偏好性地定位于线粒体中24。在本文中，我们鉴定了另一条途径，通过这条途径p53Arg72比p53Pro72诱导凋亡的活性更强，并因此在人类中进化。p53Arg72对由iASPP引起的抑制的不壽文感意味着在人类肿瘤发生中使p53Arg72凋亡功能失效的最有效方式是通过基因内突变。与这一假说和之前的公开相一致，在检测的乳腺肿瘤组中，在p53Arg72纯合子中表达突变体p53的肿瘤的百分比要远远高于在p53Pro72中的百分比(分别为42%和6%)25。作为更有效的p73的抑制物，在肿瘤中突变p53Arg72也具有选择优势26。相反，除了在p53本身中的突变，还能够通过降低ASPP1、ASPP2的表达或iASPP的过表达使p53Pro72失效。因此，ASPP家族蛋白提供了对p53Pro72的另一种水平的调节。其结果是，在响应诱导p53凋亡功能的信号时，在正常细胞中p53Pro72比p53Arg72更不容易突变。这有可能就是为什么p53Pro72纯合子携带者的百分比在持续暴露于高剂量p53诱导剂例如UV辐射的环境中进化的种族群体中最高的原因。尽管如此，p53Pro72的纯合性并不一定意。未着在其它类型的癌症中防止p53突变，因为ASPP家族蛋白的表达水平在不同组织中的变化非常大(数据未显示)27。只有当考虑了ASPP家族成员的表达水平时，才能够对多态p53变体的表达与癌症易感性的关联性做出清楚的结论。本说明书中的结果表明了根据其p53多态性和ASPP表达模式的治疗癌症的改良策略的可能性。参考文献1.Slee,E.A.,O'Connor,D.J.&Lu，X.Todieornottodie:howdoesp53decide(生存还是毁灭p53如何决定？)Oncogene23,2809-18(2004).2.Samuels-Lev,Y.etal.ASPPproteinsspecificallystimulatetheapoptoticfunctionofp53(ASPP蛋白特异性刺激p53的凋亡功能).MolCell8，781-94(2001).3.Bergamaschi,D.etal.iASPPoncoproteinisakeyinhibitorofp53conservedfromwormtohuman(iASPP癌蛋白是从蠕虫到人中保守的p53的关键性抑制物).NatGenet33,162-7(2003).4.Liu，Z丄，Zhang,Y.，Zhang,X.B.&Yang，X.AbnormalmRNAexpressionofASPPmembersinleukemiacelllines(在白血病细月包系中ASPP成员的异常mRNA表达).Leukemia18,880(2004).5.Zhang,X.,Wang,M.，Zhou,C,Chen,S.&Wang,J.TheexpressionofiASPPinacuteleukemias(在急性白血病中iASPP的表达).LeukRes29,179-83(2005).6.Lossos,I.S.,Natkunam,Y.,Levy,R.&Lopez,CD.Apoptosisstimulatingproteinofp53(ASPP2)expressiondiffersindiffuselargeB-cellandfollicularcenterlymphoma:correlationwithclinicaloutcome(在弥散的大B细胞和滤泡中心型淋巴瘤中p53的凋亡刺激蛋白(ASPP2)表达有所不同与临床结果的相关性研究).LeukLymphoma43,2309-17(2002).7.Walker,K.K.&Levine，A.J.Identificationofthenovelp53functionaldomainwhichisnecessaryforefficientgrowthsuppression(对有效生长抑制所必需的新的p53功能结构域的鉴定).Proc.Natl.Acad.Sci.USA93，15335-15340(1996).8.Zhu，J.，Jiang,J.，Zhou,W.，Zhu，K.&Chen,X.Differentialregulationofcellulartargetgenesbyp53devoidofthePXXPmotifswithimpairedapoptoticactivity(通过具有受损凋亡活性的缺乏PXXP基序的p53对细胞靶基因进行区别调控).Oncogene18,2149-2155(1999).9.Baptiste,N.，Friedlander,P.,Chen,X.&Prives,C.Theproline-richdomainofp53isrequiredforcooperationwithanti-neolasticagentstopromoteapoptosisoftumourcells(p53的富含月甫氛酸结才勾i或是与促进肿瘤细胞凋亡的抗肿瘤剂共同作用所必需的).Oncogene21,9-21(2002).10.Venot,C.etal.Therequirementforthep53proline-richfunctionaldomainformediationofapoptosisiscorrelatedwithspecificPIG3genetmnsactivationandwithtranscriptionalrepression(p53冨含月肃氨酸的功能结构域为凋亡介导所必需与特异性的PIG3基因反式激活和转录抑制相关联).EMBO17,4668-4679(1998).11.D'ErchiaA,M.,Pesole,G.,Tullo,A.,Saccone,C.&Sbisa,E.Guineapigp53mRNA:identificationofnewelementsincodinganduntranslatedregionsandtheirfunctionalandevolutionaryimplications(豚鼠p53mRNA:在编码和非翻译区中对新元件的鉴定及其功能和进化的含义).Genomics58,50-64(1999).12.Noma,C,Miyoshi,Y.，Taguchi,T.,Tamaki,Y.&Noguchi,S.Associationofp53geneticpolymorphism(Arg72Pro)withestrogenreceptorpositivebreastcancer.riskinJapanesewomen(在日本妇女中p53遗传多态性(Arg72Pro)与雌激素受体阳性乳腺癌风险的关联).CancerLett210,197-203(2004).13.Granja,F.etal.Prolinehomozygosityincodon72ofp53isafactorofsusceptibilityforthyroidcancer(p53的密》马子72的月甫氨酸纯合性是曱状腺癌易感性的因素之一).CancerLett210，151-7(2004).14.Agorastos,T.etal.P53codon72polymorphismandcorrelationwithovarianandendometrialcancerinGreekwomen(希腊妇女中P53密码子72多态性以及与卵巢癌和子宫内膜癌的相关性).EurJCancerPrev13,277-80(2004).15.deOliveira,W.R.etal.Associationofp53argininepolymorphismwithskincancer(p53精氨酸多态性与皮肤癌的相关性).IntJDermatol43,489-93(2004).16.Matakidou,A.,Eisen,T.&Houlston,R.S.TP53polymorphismsandlungcancerrisk:asystematicreviewandmeta-a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.根据权利要求40或41所述的方法，其中所述动物是人。43.根据权利要求40-42中任一权利要求所述的方法，其中所述治疗或免疫是癌症治疗或抗癌疫苗接种。44.根据权利要求43所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌。全文摘要本发明公开了鉴定抑制p53与p53抑制多肽间相互作用的试剂的筛选测定并且包括对抑制p53活性而言没有活性的p53抑制多肽变体。文档编号C07K14/47GK101228184SQ200680023921公开日2008年7月23日申请日期2006年7月13日优先权日2005年7月14日发明者欣卢申请人:路德维希癌症研究院