专利名称：具有抗焦虑作用的肽及其筛选方法
具有抗焦虑作用的肽及其筛选方法
技术分类
本发明涉及具有抗焦虑作用的多肽；采用该多肽治疗焦虑的方法； 篩选激活或抑制该多肽的受体的、与焦虑调节有关的化合物或其盐或它 们的水合物的方法和这种篩选用的试剂盒。
背景技术：
脑肠管激素、趋化因子、神经肽或神经递质等生理活性物质通过存 在于细胞膜上的特异受体发挥作用。在这些受体中，具有7次贯穿细胞 膜的结构、并在细胞内和G蛋白三聚物偶联的受体，被特别分类为G 蛋白偶联受体(GPCR) 。 GPCR在与特异配体结合时，通过向细胞内传 递信号，激活或抑制细胞，从而在各器官的功能表达中起到重要作用。 因此，激活GPCR的激动剂或者抑制GPCR的拮抗剂已作为药品使用。 在这些被分类为GPCR的受体中，已知特异配体未鉴定的情况很多，被 称作孤儿GPCR。孤儿GPCR隐含着作为新型治疗药的靶点的可能性， 正在进行它们的配体鉴定和功能激活或抑制的物质的研究。像这样将鉴 定的配体或物质施予生体，阐明受体和其配体的功能，在药品开发方面 是极为重要的。
由于近年来基因序列信息的丰富，基于已知蛋白质或肽的序列，可 以导出其同源性或规律性，预测未知的肽或蛋白质，也可作为GPCR的 新配体的鉴定方法。属于胰岛素/松弛素家族的松弛素是由黄体或胎盘产 生的分泌肽，具有与妊娠维持和分娩相关的作用，这在以前已被知晓。 基于编码松弛素的DNA碱基序列，编码从基因序列数据库中新鉴定的 DNA的蛋白质，是被命名为松弛素-3 (或称为INSL7 )的多肽(国际公 开第01/068862号小册子)。成熟型或活化型的松弛素-3为一种多肽， 其包括由松弛素-3的前原蛋白(preproprotein)切断的B链和A链，其 中该B链和该A链通过二硫键结合。有报道指出，随着免疫细胞系的 THP-1细胞内环腺苷酸(cAMP)的上升，爭>弛素-3可以激活细胞(国 际公开第01/81562号小册子，Bathgate等人，J. Biol. Chem., 277, p.1148-1157, 2002)。此后表明，松弛素-3连同松弛素-2是结合于作为GPCR的LGR7的配体之一，同时表明松弛素-3引起的cAMP上升与 LGR7有关(Sudo等人，J.Biol.Chem., 278， p.7855-7862, 2003 ) 。 LGR7 在脑和末梢组织中表达，截至目前表明与生殖器官的发育或妊娠 生产 有关，但是与精神状况的关联方面尚不明确。
最近，有报道指出，生体内的配体为未鉴定的GPCR，被命名为 SALPR (GPCR135)的受体、或被称为GPR100 (hGPCRll、 GPCR142 ) 的受体的配体为松弛素-3( Takeda等人，FEBS Letter, 520, p.97-101, 2002; Liu等人，J. Biol. Chem., 278， p.50754-50764, 2003; Liu等人，J. Biol. Chem., 278, p.50765-50770, 2003;国际公开第2004/082598号小册 子)。此外有报道指出，松弛素-3引起的cAMP的降低与SALPR( Liu等 人，J. Biol. Chem., 278, p.50754-50764, 2003 )或GPRIOO( Liu等人，J. Biol. Chem., 278, p.50765-50770, 2003 )有关。进一步地，国际公开第00/24891 号小册子、国际公开第01/48189号小册子、国际公开第02/31111号小 册子和国际公开第02/610877号小册子中也有这些受体的相关记载。已 知SALPR位于脑中(Matsumoto等人，Gene, 248, p.183-189, 2000 ),特 别地，有报道指出，位于下丘脑的室旁核和视上核(国际公开第 2004/082598号小册子，Liu等人，J. Biol. Chem., 278, p.50754-50764, 2003 )。进一步地，有报道采用与SALPR选择性结合的松弛素-3和INSL5 的嵌合肽，通过显示肽的脑内结合区域研究了 SALPR的表达(Su加n等 人，Neuroendocrinology, 180, p.298-307, 2004)，但是关于SALPR的功 能还不清楚。另一方面，有报道指出，GPRIOO为全身性表达的受体(Lm 等人，J. Biol. Chem., 278, p.50765-50770, 2003; Boels等人,Br丄 Pharamacol., 140, p.932-938, 2003 ),但是关于GPRIOO的功能也不清楚。
另一方面，有报道指出，松弛素-3存在于脑内的特定区域(Liu等 人，J. Biol. Chem., 278, p.50754-50764, 2003 ),松弛素隱3作为脑内肽， 被认为可能对中枢神经系统发挥某些功能，但是，截至目前尚不知道松 弛素-3能否调节焦虑和抑郁等精神状态。
发明内容
本发明的目的在于提供具有抗焦虑作用的多肽；含有该多肽的治疗 剂；采用该多肽治疗焦虑的方法；筛选与焦虑调节有关的、激活或抑制 该多肽的受体的化合物或其盐或它们的水合物的方法；以及这种筛选用
的试剂盒。
本发明者通过对大鼠或小鼠脑室内施予松弛素-3，采用评价焦虑引
起作用和抗焦虑作用的实验系统观察施予后上述大鼠或上述小鼠的行 为，发现松弛素-3具有抗焦虑作用。基于这些发现，完成了本发明。 即，根据本发明，可以提供
(1) 抗焦虑剂，其含有松弛素-3、其盐或它们的水合物。
(2) 上述(1 )所述的抗焦虑剂，其中松弛素-3为人松弛素-3。
(3) 上述(1)所述的抗焦虑剂，其中松弛素-3为一种多肽，该多 肽由可从松弛素-3前原蛋白的功能等价修饰多肽得到的A链和B链构 成，或由可从松弛素-3前原蛋白的同源多肽得到的A链和B链构成，其 中，A链和B链的半胱氨酸残基通过二硫键结合。
(4 )具有抗焦虑作用的化合物或其盐或它们的水合物的筛选方 法，该方法包括如下步骤
(A) 使受试物与松弛素-3受体、含有松弛素-3受体的细胞或 该细胞的膜级分接触的步骤，
(B) 测定松弛素-3受体介导的细胞刺激活性的步骤。
(4')具有抗焦虑作用的化合物或其盐或它们的水合物的筛选方 法，该方法包括如下步骤
(A) 使受试物与松弛素-3受体、含有松弛素-3受体的细胞或
该细胞的膜级分接触的步骤，
(B) 测定松弛素-3受体介导的细胞刺激活性的步骤，和
(C) 当松弛素-3受体、例如抑生长素-血管生成素样肽受体 (somatostatin and angiogenin - like peptide receptor, SALPR)介导的细
胞刺激活性显示抑制腺苷酸环化酶活性时，判定该受试物为具有抑制焦 虑作用的作用的化合物的步骤。
(5) 抑制或促进焦虑作用的化合物、其盐或它们的水合物的筛选 方法，该方法包括以下步骤
(A)使受试物和松弛素-3、其盐或它们的水合物与松弛素-3 受体、含有松弛素-3受体的细胞或该细胞的膜级分接触的步骤。
(6) 上述(5)所述的筛选方法，其中松弛素-3为人松弛素-3。
(7) 上述(5)所述的筛选方法，其中松弛素-3为一种多肽，该多 肽由可从松弛素-3前原蛋白的功能等价修饰多肽得到的A链和B链构
成，或由可从松弛素-3前原蛋白的同源多肽得到的A链和B链构成，其 中，A链和B链的半胱氨酸残基通过二硫键结合。
(8) 上述(5) ~ (7)中任一项所述的抑制或促进焦虑作用的化 合物、其盐或它们的水合物的筛选方法，其进一步包含下述步骤
(B)测定松弛素-3受体介导的细胞刺激活性的步骤。 (8')上述(5) ~ (7)中任一项所述的抑制焦虑的化合物、其盐 或它们的水合物的筛选方法，其进一步包含下述步骤
(B) 测定松弛素-3受体介导的细胞刺激活性的步骤；
(C) 当松弛素-3受体、例如SALPR介导的细胞刺激活性显示 出抑制腺苷酸环化酶活性时，判定该受试物为具有抑制焦虑作用的作用 的化合物的步骤。
(9) 上述(4)、 (4，)、 (5)、 (6)、 (7)、 (8)和(8') 中任一项所述的筛选方法，其中，松弛素-3受体为SALPR或其部分多 肽。
(10) 上述(9)所述的筛选方法，其中，SALPR为包含SEQ ID N0:4
所示氨基酸序列的多肽。
(11) 具有抗焦虑作用的化合物、其盐或它们的水合物的筛选用试 剂盒，该试剂盒包含松弛素-3受体、含有松弛素-3受体的细胞或该细胞 的膜级分。
(12) 上述(11)所述的筛选用试剂盒，其还含有松弛素-3、其盐
或它们的水合物。
(13) 上述(12)所述的筛选用试剂盒，其中松弛素-3为人松弛素-3。
(14) 上述(12)所述的筛选用试剂盒，其中松弛素-3为一种多肽， 该多肽由可从松弛素-3前原蛋白的功能等价修饰多肽得到的A链和B 链构成，或由可从松弛素-3前原蛋白的同源多肽得到的A链和B链构 成，其中，A链和B链的半胱氨酸残基通过二硫键结合。
(15) 上述(12) - (l4)中任一项所述的筛选用试剂盒，其中松 他素-3 一皮才示寸己。
(16) 上述U1) ~ ( l5)中任一项所述的筛选用试剂盒，其中， 松弛素-3受体为SALPR或其部分多肽。
(17) 上述(16)所述的筛选用试剂盒，其中，SALPR为包含SEQ
ID NO:4所示氨基酸序列的多肽。
(18) 抑制或促进焦虑作用的化合物、其盐或它们的水合物的篩选 方法，该方法包括将作用于松弛素-3受体的化合物施予人或人以外的生 物、并测定施予后的焦虑作用的步骤。
(19) 上述(18)所述的筛选方法，其中测定焦虑作用的步骤包括 defensive burying test或高架十字迷宫实马全。
uo)上述(is)或(l9)所述的篩选方法，其中作用于松弛素-3 受体的化合物是根据上述(4) 、 (4，)、 (5)、 (6)、 (7)、 (8)、 (8，) 、 (9)和(10)中任一项所述的方法得到的化合物。
图1表示pBabeCL(SALPR)IH的构建图。
图2A表示CRE4VIP/pBluescriptlISK(+)的构建图。
图2B表示pBabeCLX的构建图。
图2C表示pBabeCLcre4vPd丽的构建图。
图3表示，通过在表达SALPR的SE302细胞中添加毛喉素而增加 了转录活性的松弛素-3,其特异的用量依存的抑制。黑方块表示添加了 松弛素-3的情况。白方块表示添加了胰岛素的情况。横轴的数字表示添 加的各配体的最终浓度(nmol/L)。纵轴表示，以添加了 lpmol/L毛喉 素的细胞上清液的石威性磷酸酶活性为100、以未添加毛喉素的细胞上清 液的活性为0时，所计算出的各活性的比例。各点表示平均值(N-3) 和标准偏差。
图4表示，采用Defensive burying试验在大鼠脑室内单次施予松弛 素-3所产生的抗焦虑作用。白方块表示对照(溶剂)施予组、斜线表示 ;^弛素-3的0.05 nmol施予组、黑方块表示木〉弛素-3的1 nmol施予组。 纵轴表示，各组中每只动物用铺垫覆盖电极的时间(秒)的平均值和标 准误差。图中*的含义是，人松弛素-3施予组与对照(溶剂)施予组相 比存在显著差异(Dunnett型多重比较检验，p<0.05 )。
图5表示，在采用小鼠进行的高架十字迷宫实验(5分钟)中，进
入开放臂和闭合臂的总次数。
图6表示，在采用小鼠进行的高架十字迷宫实验(5分钟)中，在
开放臂中滞留时间的比例。图中*的含义是，人松弛素-3施予组与对照
(溶剂)施予组相比，存在显著差异(t检验，p<0.05)。
图7表示，在采用大鼠进行的高架十字迷宫实验(5分钟)中，进
入开放臂和闭合臂的总次数。
图8表示，在采用大鼠进行的高架十字迷宫实验(5分钟)中，在 开放臂中滞留时间的比例。图中*的含义是，人松弛素-3施予组与对照 (溶剂)施予组相比，存在显著差异(Dunnett型多重比较检验，p<0.05 )。
具体实施例方式
本发明的"松弛素-3"是被命名为松弛素-3 (也称为INSL7)的多 肽，指成熟型或活化型的松弛素-3。
具体地，本发明的"松弛素-3"是一种多肽，该多肽具有具有从 SEQIDNO:2的N末端开始第26位(Arg) ~第52位(T卬)残基的氨
基酸序列的多肽、与该多肽在功能上等价的修饰多肽、或该多肽的同源 多肽(以下也筒称"B链")；和具有从SEQIDNO:2的N末端开始第 119位(Asp) ~第142位(Cys)残基的氨基酸序列的多肽、与该多肽 在功能上等价的修饰多肽、或该多肽的同源多肽(以下也简称"A链")， 其中B链和A链的半胱氨酸残基通过二硫键进行结合。B链和A链的半
胱氨酸残基优选通过二硫键进行分子间和分子内结合。
更具体地，本发明的松弛素-3为一种多肽，该多肽含有具有从SEQ IDNO:2的N末端开始第26位(Arg) ~第52位(Trp )残基的氨基酸 序列的多肽(人B链)、和具有从SEQ ID NO:2的N末端开始第II9 位(Asp) ~第l"位(Cys)残基的氨基酸序列的多肽(人A链)，其 中两多肽通过二硫键结合，B链和A链的半胱氨酸残基在分子间和分子 内形成二硫键。该二硫键优选为，从SEQ ID NO:2的N末端开始第35 位的B链半胱氨酸与从SEQ ID NO:2的N末端开始第129位的A链半 胱氨酸结合；从SEQ ID NO:2的N末端开始第47位的B链半胱氨酸与 从SEQ ID NO:2的N末端开始第142位的A链半胱氨酸结合；以及从 SEQIDNO:2的N末端开始第128位的A链半胱氨酸与从SEQ ID NO:2 的N末端开始第133位的A链半胱氨酸结合。
本发明地松弛素-3的例子如下。数字表示形成二好"建的半胱氨酸残 基，相同数字的半胱氨酸残基通过二硫^t结合。 [人松弛素-3]
B链RAAPYGVRLCGREFIRAVIFTGGGSRW ( SEQ ID NO:5 )
1 2 A链DVLAGLSSSCCKWGCSKSEISSLG (SEQIDNO:6)
313 2
B链和A链的氨基酸序列包含在本发明松弛素-3的前原蛋白的氨基 酸序列中。本发明的松弛素的前原蛋白可以为具有SEQ ID NO:2所示氨 基酸序列的多肽(人前原蛋白)(GenBank登录号NM_080864)、或 与该多肽在功能上等价的修饰多肽、或该多肽的同源多肽(这些在下文 也简称为"前原蛋白")。本发明的松弛素-3还包括一种多肽，该多肽 包含由上述前原蛋白切得的B链和A链，其中B链和A链的半胱氨酸
残基通过二硫键结合。
本发明的松弛素-3、 B链、A链和前原蛋白可以是源自人或人以外
的生物[例如非人哺乳动物(如小鼠、大鼠、仓鼠、猪、犬等)、鸟类、 爬虫类、两栖类、鱼类、昆虫类等]的天然来源多肽，也可以是重组多肽、 合成多肽。本发明的松弛素-3中包含本发明的松弛素-3的盐，进一步 地，本发明的松弛素-3或其盐，包含无糖链和有糖链两种情况。关于盐， 可以参照下述对盐的描述。此外，本发明的松弛素-3、 B链、A链和前 原蛋白还包括受到如N末端环状谷氨酰胺化、C末端酰胺化等分泌蛋白 处理的多肽。
上述的"功能等价修饰多肽"为一种多肽，该多肽具有具有从SEQ ID NO:2的N末端开始第26位(Arg) ~第52位(Trp )残基的氨基酸 序列的多肽(人B链)、具有从SEQ ID NO:2的N末端开始第119位 (Asp) ~第142位(Cys)残基的氨基酸序列的多肽(人A链)、或具 有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽(人前原蛋白)，其中，缺失、 置换、插入和/或添加了 1个或多个(优选1个或几个)氨基酸，而且B 链和A链的半胱氨酸残基通过二硫键结合，并且其表现出与松弛素-3基 本相同的活性[例如，松弛素-3受体结合能力和通过结合产生的各种细 胞刺激活性(如细胞内Ca"游离、腺苷酸环化酶的活化、细胞内cAMP 生成、细胞内cGMP生成、肌醇磷脂生成、细胞膜电位变化、细胞膜附 近pH变化、细胞内蛋白质的磷酸化、c-fos和c-jun的诱导/活化、花生 四烯酸游离)、焦虑作用的调节]。功能等价的修饰多肽可以为上述生物
来源的多肽、重组多肽、合成多肽中的任一种，只要其满足上述条件。
所述缺失、置换和/或插入可发生在氨基酸序列的任何位点，但可发 生在下述多肽的氨基酸序列的半胱氨酸残基以外的氨基酸残基，其中所
述多肽为具有从SEQ ID NO:2的N末端开始第26个(Arg) ~第52 个(Trp)残基的氨基酸序列的多肽(人B链)、具有从SEQ ID NO:2 的N末端开始第119个(Asp) ~第142个(Cys)残基的氨基酸序列的 多肽(人A链)、或具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽(人前原 蛋白)。
本说明书中的"置换"优选指用其它化学等价(chemically homologous )氨基酸残基对一个或多个氨基酸残基的保守置换 (conservative substitution),且基本上不改变肽活性。例如，将某个疏 水性残基用其他疏水性残基置换，将某个极性残基用带同种电荷的其他 极性残基置换。每种氨基酸的能够进行这种置换的、功能类似的氨基酸 在该技术领域中都是公知的。更具体地，作为非极性(疏水性)氨基酸， 例如有丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、笨丙氨 酸、蛋氨酸等。作为极性(中性)氨基酸，例如有甘氨酸、丝氨酸、苏 氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等。作为带正电荷的(碱 性)氨基酸，例如有精氨酸、组氨酸、赖氨酸等。此外，作为带负电荷 的(酸性)氨基酸，例如天冬氨酸、谷氨酸等。
上述缺失、置换、插入和/或添加的氨基酸残基数例如为1-30个、 优选1 20个、更优选1 10个，进一步优选1 5个，特别优选为1~ 2个。
上述的"同源多肽"指一种多肽，该多肽所具有的氨基酸序列与下 述多肽的氨基酸序列具有70%或以上、优选80%或以上、更优选85% 或以上、进一步优选90%或以上、更进一步优选95%或以上、特别优 选98%或以上、最优选99%或以上的同源性，上述多肽为具有从SEQ ID NO:2的N末端开始第26个(Arg ) ~第52个(Trp )的氨基酸序列 的多肽(人B链)、具有从SEQIDNO:2的N末端开始第119个(Asp) 第142个(Cys )的氨基酸序列的多肽(人A链)、或具有SEQ ID NO:2 所示氨基酸序列的多肽(人前原蛋白)；其中B链和A链的半胱氨酸残 基通过二硫键结合，且其表现出与本发明的松弛素-3基本相同的活性 (例如，松弛素-3受体结合能力和通过该结合产生的各种细胞刺激活性、焦虑作用的调节)。对同源多肽没有特别限定，可以为上述生物来 源的多肽、重组多肽、合成多肽中的任一种，只要其表现出上述活性。
在本说明书中，"同源性，，(有时称"同一性")的数值可以是采 用本领域公知的同源性检索程序算出的数值，例如，在全美生物技术信
息中心(NCBI)的同源性算法BLAST ( Basic local alignment search tool) http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/中，可以通过采用预设(初期设定) 的参数算出。
上述的功能等价的修饰多肽或同源多肽的B链、A链、松弛素-3和 前原蛋白的优选例子包括公知的小鼠型、大鼠型或猪型的B链、A链、 松弛素-3或其前原蛋白(国际公开第01/81562号小册子)；和松弛素-1、松弛素-2或胰岛素样肽3 (INSL-3)的前原蛋白或B链(国际公开 第2006/026355号小册子)。
"由可从松弛素-3前原蛋白的功能等价修饰多肽得到的A链和B 链构成、或由可从松弛素-3前原蛋白的同源多肽得到的A链和B链构成 的多肽，其中，A链和B链的半胱氨酸残基通过二硫键结合"中所述的 多肽，优选为表现出与本发明的松弛素-3基本相同的活性(例如，松弛 素-3受体结合能力和通过该结合产生的各种细胞刺激活性、焦虑作用的 调节)的下述多肽(1 )和(2):
(1) 一种多肽，其由下述多肽构成具有SEQ ID NO:5所示氨基 酸序列的多肽(人B链)或SEQ ID NO:5氨基酸序列中有1个或多个(优 选l个或几个，更优选l、 2、 3或4个，进一步优选1或2个，特别优 选1个)氨基酸缺失、置换、插入和/或添加的修饰人B链、和具有SEQ IDNO:6所示氨基酸序列的多肽(人A链)或SEQ IDNO:6所示氨基酸 序列中有1个或多个(优选1个或几个，更优选1、 2、 3或4个，进一 步优选1或2个，特别优选1个)氨基酸缺失、置换、插入和/或添加的 修饰人A链，其中，从SEQIDNO:5的N末端开始第10位的B链半胱 氨酸与从SEQIDNO:6的N末端开始第11位的A链半胱氨酸结合，从 SEQ ID NO:5的N末端开始第22位的B链半胱氨酸与从SEQ ID NO:6 的N末端开始第24位的A链半胱氨酸结合，从SEQ ID NO:6的N末端 始第10位的A链半胱氨酸与从SEQ ID NO:6的N末端始第15位的A
链半胱氨酸结合；和
(2) —种多肽，其由下述多肽构成具有SEQ ID NO:5所示氨基
酸序列的多肽(人B链)或具有与人B链氨基酸序列具有70%或以上 (优选80%或以上、更优选85%或以上、进一步优选90%或以上、更 进一步优选95%或以上、特别优选98%或以上、最优选99%或以上) 同源性的氨基酸序列的同源人B链、和具有SEQ IDN0:6所示氨基酸序 列的多肽(人A链)或具有与人A链氨基酸序列具有70%或以上(优 选80%或以上、更优选85%或以上、进一步优选90%或以上、更进一 步优选95%或以上、特别优选98%或以上、最优选99%或以上)同源 性的氨基酸序列的同源人A链，其中，从SEQ IDNO:5的N末端开始 第IO位的B链半胱氨酸与从SEQ ID NO:6的N末端始第11位的A链 半胱氨酸结合，从SEQ ID NO:5的N末端开始第22位的B链半胱氨酸 与从SEQ ID NO:6的N末端开始第24位的A链半胱氨酸结合，从SEQ ID NO:6的N末端开始第IO位的A链半胱氨酸与从SEQ ID NO:6的N 末端开始第15位的A链半胱氨酸结合。
此外，作为"由可从松弛素-3前原蛋白的功能等价修饰多肽得到的 A链和B链构成、或由可从松弛素-3前原蛋白的同源多肽得到的A链和 B链构成的多肽，其中，A链和B链的半胱氨酸残基通过二硫键结合" 中所述的多肽的例子包括国际公开第2006/026355号小册子和Changlu Liu等人，Mol Pharmacol. 67(1):231-40(2005)中公开的松弛素-3的嵌合 肽。
所述松弛素-3的嵌合肽的优选例子包括表现出与本发明的松弛素-3 基本相同的活性(例如，松弛素-3受体结合能力、和由该结合产生的各 种细胞刺激活性、焦虑作用的调节)的下述多肽(3) ~ (10):
(3)—种多肽，其由下述多肽构成具有SEQ ID NO:5所示氨基 酸序列的多肽(人B链)或在SEQ ID NO:5所示氨基酸序列中有1个或 多个(优选1个或几个，更优选1、 2、 3或4个，进一步优选1或2个， 特别优选1个)氨基酸缺失、置换、插入和/或添加的修饰人B链、和 具有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的多肽(人松弛素-1 A链)或在SEQ IDNO:7所示氨基酸序列中有1个或多个(优选1个或几个，更优选1、 2、 3或4个，进一步优选1或2个，特别优选1个)氨基酸缺失、置换、 插入和/或添加的修饰人松弛素-1 A^l,其中，从SEQ ID NO:5的N末 端开始第10位的B链半胱氨酸与从SEQ ID NO:7的N末端开始第11 位的A链半胱氨酸结合，从SEQIDNO:5的N末端开始第22位的B链
半胱氨酸与从SEQ ID NO:7的N末端开始第24位的A链半胱氨酸结 合，从SEQ ID NO:7的N末端开始第10位的A链半胱氨酸与从SEQ ID NO:7的N末端开始第15位的A链半胱氨酸结合；
(4) 一种多肽，其由下述多肽构成具有SEQ ID NO:5所示氨基 酸序列的多肽(人B链)或具有与人B链氨基酸序列具有70%或以上
(优选80%或以上、更优选85%或以上、进一步优选90%或以上、更 进一步优选95%或以上、特别优选98%或以上、最优选99%或以上) 同源性的氨基酸序列的同源人B链、和具有SEQ ID NO:7所示氨基酸序 列的多肽(人松弛素-l A链)或具有与人松弛素-1 A链氨基酸序列具有 70%或以上(优选80%或以上、更优选85%或以上、进一步优选90% 或以上、更进一步优选95%或以上、特别优选98%或以上、最优选99 %或以上)同源性的氨基酸序列的同源人松弛素-1 A链，其中，从SEQ ID NO:5的N末端开始第10位的B链半胱氨酸与从SEQ ID NO:7的N 末端开始第11位的A链半胱氨酸结合；从SEQIDNO:5的N末端开始 第22位的B链半胱氨酸与从SEQ ID NO:7的N末端开始第24位的A 链半胱氨酸结合；从SEQIDNO:7的N末端开始第10位的A链半胱氨 酸与从SEQ IDNO:7的N末端开始第15位的A链半胱氨酸结合；
(5) —种多肽，其由下述多肽构成具有SEQ ID NO:5所示氨基 酸序列的多肽(人B链)或SEQ ID NO:5的氨基酸序列中有1个或多个
(优选l个或几个，更优选l、 2、 3或4个，进一步优选1或2个，特 别优选1个)氨基酸缺失、置换、插入和/或添加的修饰人B链、和具 有SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的多肽(人松弛素-2 A链)或SEQ ID NO:8的氨基酸序列中有1个或多个(优选1个或几个，更优选l、 2、 3 或4个，进一步优选1或2个，特别优选1个)氨基酸缺失、置换、插 入和/或添加的修饰人松弛素-2 A链，其中，从SEQ ID NO:5的N末端 开始第10位的B链半胱氨酸与从SEQIDNO:8的N末端开始第ll位的 A链半胱氨酸结合；从SEQ ID NO:5的N末端开始第22位的B链半胱 氨酸与从SEQIDNO:8的N末端开始第24位的A《泉半胱氨酸结合；从 SEQ ID NO:8的N末端开始第10位的A链半胱氨酸与从SEQ ID NO:8 的N末端开始第15位的A链半胱氨酸结合；
(6) —种多肽，其由下述多肽构成具有SEQ ID NO:5所述氨基 酸序列的多肽(人B链)或具有与人B链氨基酸序列具有70%或以上
(优选80%或以上、更优选85%或以上、进一步优选90%或以上、更 进一步优选95%或以上、特别优选98%或以上、最优选99%或以上) 同源性的氨基酸序列的同源人B链、和具有SEQ IDNO:8所示氨基酸序 列的多肽(人松弛素-2A链)或具有与人松弛素-2A链氨基酸序列具有 70%或以上(优选80%或以上、更优选85%或以上、进一步优选90% 或以上、更进一步优选95%或以上、特别优选98%或以上、最优选99 %或以上)同源性的氨基酸序列的同源人松弛素-2 A链，其中，从SEQ ID NO:5的N末端开始第10位的B链半胱氨酸与从SEQ ID NO:8的N 末端开始第11位的A链半胱氨酸结合；从SEQIDNO:5的N末端开始 第22位的B链半胱氨酸与从SEQ ID NO:8的N末端开始第24位的A 链半胱氨酸结合；从SEQIDNO:8的N末端开始第10位的A链半胱氨 酸与从SEQIDNO:8的N末端开始第15位的A链半胱氨酸结合；
(7) —种多肽，其由下述多肽构成具有SEQ ID NO:5所示氨基 酸序列的多肽(人B链)或SEQ ID NO:5的氨基酸序列中有1个或多个
(优选l个或几个，更优选l、 2、 3或4个，进一步优选1或2个，特 别优选1个)氨基酸缺失、置换、插入和/或添加的修饰人B链、和具 有SEQ IDNO:9所示氨基酸序列的多肽(人胰岛素样肽3的修饰A《连) 或SEQIDNO:9的氨基酸序列中有1个或多个(优选1个或几个，更优 选l、 2、 3或4个，进一步优选1或2个，特别优选1个)氨基酸缺失、 置换、插入和/或添加的修饰人胰岛素样肽3的A链，其中，从SEQID NO:5的N末端开始第10位的B链半胱氨酸与从SEQ ID NO:9的N末 端开始第9位的A链半胱氨酸结合；从SEQ ID NO:5的N末端开始第 22位的B链半胱氨酸与从SEQ ID NO:9的N末端开始第22位的A链半 胱氨酸结合；从SEQ ID NO:9的N末端开始第8位的A链半胱氨酸与 从SEQ ID NO:9的N末端开始第13位的A链半胱氨酸结合；
(8) —种多肽，其由下述多肽构成具有SEQ ID NO:5所述氨基 酸序列的多肽(人B链)或具有与人B链的氨基酸序列具有70%或以 上(优选80%或以上、更优选85%或以上、进一步优选90%或以上、 更进一步优选95%或以上、特别优选98%或以上、最优选"％或以上) 同源性的氨基酸序列的同源人B链、和具有SEQ ID NO:9所示氨基酸序 列的多肽(人胰岛素样肽3的修饰A链)或具有与人胰岛素样肽3的修 饰A链的氨基酸序列具有70%或以上(优选80%或以上、更优选85%或以上、进一步优选90%或以上、更进一步优选95%或以上、特别优 选98%或以上、最优选99%或以上)同源性的氨基酸序列的同源人胰 岛素样肽3的A链，其中，从SEQIDNO:5的N末端开始第IO位的B 链半胱氨酸与从SEQ ID NO:9的N末端开始第9位的A链半胱氨酸结 合；从SEQ IDNO:5的N末端开始第22位的B《连半胱氨酸与从SEQ ID NO:9的N末端开始第22位的A链半胱氨酸结合；从SEQ ID NO:9的N 末端开始第8位的A链半胱氨酸与从SEQ ID NO:9的N末端开始第13 位的A链半胱氨酸结合；
(9) 一种多肽，其由下述多肽构成具有SEQ ID NO:5所示氨基 酸序列的多肽(人B链)或SEQIDNO:5的氨基酸序列中有1个或多个
(优选l个或几个，更优选l、 2、 3或4个，进一步优选1或2个，特 别优选1个)氨基酸缺失、置换、插入和/或添加的修饰人B链、和具 有SEQ ID NO: 10所示氨基酸序列的多肽(人胰岛素样肽6的修饰A链) 或SEQ ID NO:10的氨基酸序列中有1个或多个(优选1个或几个，更 优选l、 2、 3或4个，进一步优选1或2个，特别优选l个)氨基酸缺 失、置换、插入和/或添加的修饰人胰岛素样肽6的A链，其中，从SEQ IDNO:5的N末端开始第10位的B链半胱氨酸与从SEQ ID NO:10的N 末端开始第7位的A链半胱氨酸结合；从SEQ ID NO:5的N末端开始 第22位的B链半胱氨酸与从SEQ ID NO:10的N末端开始第20位的A 链半胱氨酸结合；从SEQ ID NO: 10的N末端开始第6位的A链半胱氨 酸与从SEQIDNO:10的N末端开始第11位的A《连半胱氨酸结合；和
(10) —种多肽，其由下述多肽构成具有SEQIDNO:5所示氨基 酸序列的多肽(人B链)或具有与人B链氨基酸序列具有70%或以上
(优选80%或以上、更优选85%或以上、进一步优选90%或以上、更 进一步优选95%或以上、特别优选98%或以上、最优选99%或以上) 同源性的氨基酸序列的同源人B链、和具有SEQ ID NO:10所示氨基酸 序列的多肽(人胰岛素样肽6的修饰A链)或具有与人胰岛素样肽6的 修饰A链氨基酸序列具有70 %或以上(优选80 %或以上、更优选85 % 或以上、进一步优选90%或以上、更进一步优选95%或以上、特别优 选98%或以上、最优选99%或以上)同源性的氨基酸序列的同源人胰 岛素样肽6的A链，其中，从SEQIDNO:5的N末端开始第10位的B 链半胱氨酸与从SEQ IDNO:10的N末端开始第7位的A链半胱氨酸结
合；从SEQ ID NO:5的N末端开始第22位的B链半胱氨酸与从SEQ ID NO:IO的N末端开始第20位的A链半胱氨酸结合；从SEQ ID NO:IO 的N末端开始第6位的A链半胱氨酸与从SEQ IDNO:IO的N末端始第 ll位的A链半胱氨酸结合。
松弛素-3的嵌合肽的更优选例子包括下述多肽。数字表示通过二硫 键结合的半胱氨酸残基，相同数字的半胱氨酸残基通过二硫键互相结 合。这些嵌合肽对于SALPR( GPCR135 ) 、 GPRIOO ( GPCR142 )和LGR7 的配体活性已经得到证实(国际/>开第2006/026355号小册子和Changlu Liu等人，Mol Pharmacol. 67(1):231画40(2005))。
B链RAAPYGVRLGGREFIRAVIFTCGGSRW ( SEQ ID NO:5 )
1 2 A链RPYVALFEKCCLIGCTKRSLAKYC ( SEQ ID NO:7 )
31 3 2 [人B链和人松弛素-2 A^l连的嵌合肽]
B链RAAPYGVRLCGREFIRAVIFTCGGSRW ( SEQ ID NO:5 )
1 2 A链QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC ( SEQ ID NO:8 )
313 2 [人B链和人胰岛素样肽3修饰A链的嵌合肽] B链RAAPYGVRLCGREHRAVIFTCGGS證(SEQ ID N〇:5 )
1 2 A链ATNPARYCCLSGCTQQDLLTLC ( SEQ ID NO:9 )
313 2 [人B链和人胰岛素样肽6修饰A链的嵌合肽] B链RAAPYGVRLCGREFIRAVIFTCGGSRW ( SEQ ID NO:5 )
1 2 A链GYSEKCCLTGCTKEELSIAC ( SEQ ID NO: 10 )
313 2 此外，本发明中采用的松弛素-3,只要其具有与松弛素-3基本相同 的活性，则B链和A链的分子内或分子间可以通过二硫键或其他的结合 形式进行结合。这种肽的例子在国际公开第2004/11:3381号小册子、Halls
等人，J. Pharmacol. Exp. Ther., 313, p.677-687, 2005; Rosengren等人，J. Biol. Chem., 281, p.5845-5851, 2006; Bathgate等人，Biochemistry, 45, p.1043-1053, 2006等中有记载。
本发明的松弛素-3、 B链、A链或前原蛋白可以通过各种公知的方 法得到，如基因工程法、合成法等。具体地，在基因工程法的情况下， 可以将编码松弛素-3、 B链、A链或前原蛋白的多核苷酸导入适当的宿 主细胞，将得到的转化体在可以表达的条件下培养，然后通过表达蛋白 质分离和纯化中常用的方法从培养物中分离和纯化所要的多肽。此外， 在合成法的情况下，可以采用液相法、固相法等常法合成，通常利用自 动合成仪进行。化学修饰化合物的合成可以按常法进行。
编码松弛素-3的多核苷酸
编码本发明的松弛素-3、 B链、A链或前原蛋白的多核苷酸(以下 也筒称"编码本发明的松弛素-3的多核苷酸")，只要其是编码本发明 的松弛素-3、 B链、A链或前原蛋白的多核苷酸，则没有特别限定。在 本说明书中"多核苷酸，，包括DNA和RNA两种含义。
编码本发明的松弛素-3的多核苷酸的例子包括具有从SEQ ID NO:l的5'末端开始第76位(c) ~第156位(g)的碱基序列的多核苷 酸(编码人B链的多核苷酸)；具有从SEQ ID NO:l的5，末端开始第 355位(g) ~第426位(c)的碱基序列的多核苷酸(编码人A链的多 核苷酸)；具有在严格条件下可与具有SEQIDNO:l所示碱基序列(编 码人前原蛋白的多核苷酸)的多核苷酸杂交的碱基序列、并编码具有与 本发明的松弛素-3、 B链、A链或前原蛋白基本相同的活性的多肽的多
核苷酸。
本说明书中的"在严格条件下杂交的多核苷酸"的具体例子包括 当根据FASTA、 BLAST、 Smith-Waterman(Meth. Enzym., 164, 765, 1988) 等同源性检索软件，在采用预设参数计算同源性时，与具有从SEQ ID NO:l的5'末端开始第76位(c) ~第156位(g)的碱基序列的多核苷 酸、具有从SEQ ID NO:l的5'末端开始第355位(g) ~第426位(c ) 的碱基序列的多核苷酸、SEQIDNO:l所示碱基序列具有至少70%或以 上、优选80%或以上、更优选85%或以上、进一步优选90%或以上、 更进一步优选95%或以上、特别优选98%或以上、最优选99%或以上 同源性的多核苦酸。此外，"严格条件下"的杂交可如下进行在本领域技术人员通常使用的杂交緩冲液中，在4(TC 7(TC、优选60~65°C 进行反应，并在盐浓度为15 ~ 300 mmol/L、优选15 ~ 60 mmol的洗涤液 中进行洗涤，以此方法可以进行。温度、盐度可以根据所用探针的长度 适当调节。温度、盐度可以根据所用探针的长度调节为适当。
编码本发明使用的松弛素-3的多核苷酸可以是天然来源的，也可以 是全合成的。进一步地，也可以是利用天然物的一部分合成的。典型地， 编码本发明松弛素-3的多核苷酸可如下得到从市售的文库或cDNA文 库中，通过基因工程领域中惯用的方法，如采用以本发明的松弛素-3、 B链、A链或前原蛋白的部分氨基酸序列信息为基础制成的适当DNA
探针进行筛选的方法等。
编码B链(包含从SEQ ID NO:2的N末端开始第26位(Arg) ~ 第52位(Trp)残基的氨基酸序列的多肽)的多核苷酸的例子包括包 含从SEQ ID NO:l的5，末端开始第76位(c) ~第156位(g)碱基序
列序列的多核苷酸。
编码A链(包含从SEQIDNO:2的N末端开始第119位(Asp) ~ 第142位(Cys)残基的氨基酸序列的多肽)的多核苷酸的例子包括 包含从SEQIDNO:l的5，末端开始第355位(g) ~第426位(c )碱基 序列的多核苷酸。
编码前原蛋白(包含SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽)的多核 苷酸的例子包括包含SEQIDNO:l所示碱基序列的多核苷酸。
质粒
上述转化中使用的质粒，只要其包含编码本发明松弛素-3的多核苷 酸，则没有特别限定。可通过向根据所用宿主细胞适当选择的公知表达 载体中插入该多核苷酸得到。此外，为使分离和纯化的操作易于进行， 根据需要，也可以是能够表达切出本发明的松弛素-3、 B链、A链或前 原蛋白的融合蛋白的质粒。
转化体
上述转化体只要包含编码本发明松弛素-3的多核苷酸，则也没有特 别限定。如可以是将该多核苷酸整合到宿主细胞的染色体中形成的转化 体；或者，可以是以质粒形式包含该多核苷酸的转化体；或者，可以是 不表达本发明松弛素-3的转化体。该转化体可以通过用上述质粒、或上 述多核苷酸本身转化所需宿主细胞而得到。此外，根据其他技术方案，
上述转化体也可以进一步含有可表达作用于B链、A链被切出的切断位
点的蛋白酶的质粒。
上述宿主细胞的例子包括常用的公知微生物，如大肠杆菌(如E. coli JM109 )或酵母(如Saccharomyces cerevisiae W303 );公知的培养 细胞，例如动物细胞(如CHO细胞、HEK-293细胞、COS细胞)或昆 虫细月包(BmN4细月包)。
此外，公知的表达载体的例子包括对于大肠杆菌，有pUC、 pTV、 pGEX、 pKK和pTrcHis;对于酵母，有pEMBLY和pYES2;对于CHO 细胞、HEK-293细胞和COS细胞，有pcDNA3、pMAMneo和pBabePuro; 对于BmN4细胞，有家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的多角体蛋白启 动子的载体(如pBK283 )。
上述目标多肽可以通过在能够表达本发明松弛素-3、 B链、A链或 前原蛋白的条件下培养得到；或者，也可以通过向适当的细胞中注入编 码本发明松弛素-3、 B链、A链或前原蛋白的RNA,在能够表达本发明 松弛素-3、 B链、A链或前原蛋白的条件下培养得到。
本发明的松弛素-3、 B链、A链或前原蛋白可以通过在培养后收集 菌体、细胞或培养液，将分离和纯化的公知的方法任意组合，利用松弛 素-3、 B链、A链或前原蛋白的生化学性质或物理性质等从上述转化体 培养物中取得。例如，可以利用超滤、液相色谱法(如亲和色i普法或高 效液相色谱法(HPLC)等)、透析法等技术。
在分别独立地制备本发明松弛素-3的B链和A ^i时，或者从融合 蛋白切出制备B链或A链时，可以按照常法，分离纯化产生的或切出的 B《连和A链，使这些链之间以二石克键结合。
含有松弛素-3的医药组合物
定义
在本说明书中，"精神状态"例如是指焦虑、紧张、抑郁的状态。 在本说明书中，"焦虑(anxiety)"是指伴有体征(如发汗、心动 过速、呼吸加速、震颤)的感觉(如恐惧、恐怖)所表现的感情状态、 不快的情绪状态。焦虑虽然是正常的感情，但由于重度焦虑会导致焦虑 障碍，所以上述焦虑也包括焦虑障碍。焦虑障碍包括，例如，带有或没 有广场恐怖的惊恐性障碍、没有惊恐性障碍病史的广场恐怖 (Agoraphobia)，特别的恐怖症如特定动物恐怖症、社会恐怖症，包含
强迫性、外伤性紧张障碍和急性紧张障碍的紧张障碍，由醇、药物(如
苯丙胺、咖啡因、大麻、可卡因、致幻剂、吸入剂、Phencychdine)、 镇静剂、催眠药、抗焦虑剂引起的焦虑障碍，伴有焦虑或伴有焦虑和抑 郁的焦虑障碍。焦虑或焦虑障碍包括，经常与其他疾病(如精神疾病、 免疫疾病、代谢疾病、消化管疾病等)和症状相关联、或由其他症状引 起的疾病。焦虑的存在可以伴随或不伴随其他障碍，如抑郁障碍中的抑 郁。
在本说明书中，"抑郁(depression)，，是指，悲观的烦恼、强烈的 悲伤、失望、动摇、精神活动迟緩、注意力下降和自卑的感情状态。根 据抑郁的程度不同，包括食欲不振、体重减少、饮食过量、失眠、睡眠 过度、性冲动、出现正常昼夜节律(如体温、内分泌机能)破坏的状态。
本发明的松弛素-3或编码本发明松弛素-3的多核苷酸可以用作精 神状态治疗、优选焦虑治疗的抗焦虑剂。例如，它们可以用于精神状态 调节、优选焦虑作用调节中由某些异常引起的疾病的治疗；与其他疾病 和症状相关联的、或由其他症状引起的焦虑治疗；由醇、药物等其他物 质引起的焦虑障碍治疗；在检查时或手术前后的焦虑的緩解。此外，它 们也可以作为药物，用于伴有焦虑症状的精神疾病的治疗、由松弛素-3 或编码松弛素-3的多核苷酸异常引起的疾病。
具体地，由于焦虑作用是指不快的情绪状态，并经常伴有与恐怖引 起的状态相似的生理学变化和行为，所以具有抗焦虑作用的松弛素-3具 有稳定人或人以外生物的精神状态的作用。例如可以用于，焦虑症、广 泛性焦虑症、惊恐性障碍、恐怖症、强迫性神经失调、创伤后应激障碍、 创伤后应激障碍的治疗、精神疾病(如抑郁症、抑郁症状、双相性精神 障碍、循环性情感、情感障碍、情绪紊乱、睡眠障碍、精神分裂症)、 免疫疾病(如慢性风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、肾疾病、皮肥厚、 特应性皮炎、支气管哞喘、多发性硬化症、风湿性肺炎(rheumatic pneumonitis)、结节病(sarcoidosis)、克罗恩病、炎症性结肠炎、肝 硬化、慢性肝炎、暴发性肝炎、脑脊髓炎、重症肌无力)、代谢疾病(如 糖尿病、肥胖性糖尿病、葡萄糖耐量障碍、酮病、酸中毒、糖尿病性神 经病变、糖尿病性肾病、糖尿病性^L网膜病变、高脂血症、动脉石更化、 心绞痛、心肌梗塞、肥胖、肥胖症、进食障碍疾患、厌食症)、消化管 疾病(如腹泻、便秘、功能性便秘、过敏性肠综合征)AIDS、癌、恶病
质)和与这类症状相关的或由这类症状引起的焦虑的治疗，由醇、药物
(如苯丙胺、咖啡因、大麻、可卡因、致幻剂、吸入剂、Phencychdine )、 镇静剂、催眠药、抗焦虑药引起的焦虑障碍的治疗。此外，也可以用于 伴有焦虑症状的精神疾病(如抑郁症、抑郁症状、双相性精神障碍、循 环性情感、情感障碍、情绪紊乱、睡眠障碍、精神分裂症)的治疗。
作为上述疾病的治疗药使用时，本发明的松弛素-3或编码本发明杠、 弛素-3的多核苷酸可以形成盐，它们可以进一步形成水合物，这些盐和 水合物也包含于本发明中。作为上述疾病的治疗药使用时，编码本发明 松弛素-3的多核苷酸可以单独使用，或者也可以插入适当载体、或者添 加信号序列或多肽稳定序列等序列后使用。作为上述载体，可以使用腺 病毒载体、反转录病毒载体、仙台病毒载体(日本血凝病毒)、质粒、 噬菌粒、粘粒等^^知的载体。本发明的松弛素-3或编码本发明松弛素-3 的多核苷酸或其盐或它们的水合物可以单独使用，也可以和药学上允i午 的载体配合、作为组合物使用。
这里所用的"盐"只要是与本发明的松弛素-3或编码本发明松弛素 -3的多核苷酸形成的盐，且为药学上能够容许的盐，则没有特别限定。 这种盐的优选例子包括氬卣酸盐(如氬氟酸盐、盐酸盐、氬溴酸盐、 氢硤酸盐)、无机酸盐(如硫酸盐、硝酸盐、高氯酸盐、磷酸盐、碳酸 盐、碳酸氢盐等)、有机羧酸盐(如醋酸盐、三氟醋酸盐、草酸盐、马 来酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐等)、有机磺酸盐(如甲磺酸 盐、三氟甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、曱苯磺酸盐、樟脑磺酸盐等)、 氨基酸盐(如天冬氨酸盐、谷氨酸盐等)、季铵盐、碱金属盐(如钠盐、 钾盐等)、碱土金属盐(如镁盐、钩盐等)。作为该"药学上能够容许 的盐"，更优选三氟醋酸盐、盐酸盐、草酸盐等。
有效成分在载体中的比例可在1 ~90重量％范围变动。此外，该药 剂可以以各种形式、以经口或非经口 (如静脉注射、肌肉注射、皮下结、 药、直肠给药、经皮给药)中的任一给药途径，施予人或人以外的生物。 人以外的生物例如包括非人哺乳动物如牛、猴、猫、小鼠、大鼠、仓鼠、 猪、犬等)、鸟类、爬虫类、两栖类、鱼类、昆虫类。因此，含有本发 明的松弛素-3或编码本发明松弛素-3的多核苷酸的药物组合物，可以根 据给药途径制成适当剂型，具体可制成片剂、胶嚢剂、颗粒剂、散剂和 糖浆剂等口服制剂；或注射剂、静脉滴注剂、脂质体制剂、栓剂等非口
服制剂。这些制剂可采用常用的赋型剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩 解剂、表面活性剂、润滑剂、分散剂、緩冲剂、保存剂、增溶剂、防腐 剂、调味剂、止痛剂、稳定剂等，依常法制备。可以使用的无毒性添加 剂包括乳糖、果糖、葡萄糖、淀粉、明胶、硬脂酸镁、曱基纤维素或其 盐、乙醇、柠檬酸、氯化钠、磷酸钠等。
作为给药形式和必要的给药剂量，取决于本发明的松弛素-3或编码 本发明松弛素-3的多核苷酸的选择、给药对象、给药途径、制剂性质、 患者状态、还有医师的判断。适当的给药量范围为，如患者体重每lkg
约为0.1 500 pg、优选约0.1 ~ 100 pg、更优选1 50昭左右。考虑到 给药途径的效率不同，可以预测必要的给药量会大范围变动。例如，可 以预测与静脉注射给药相比，经口给药需要更高的给药量。这种给药量 的变动，可以采用本领域熟知、标准的、经验上的、最优化的规程进4亍调整。
使用松弛素-3受体的、与精神状态调节相关的化合物的筛选方法 松弛素-3受体
本发明的松弛素-3受体可以为各种受体中的具有与本发明的松弛 素-3结合的活性、表现出各种松弛素-3受体表达细胞的细胞刺激活性 (如细胞内Ca^的游离、腺苷酸环化酶的活化、细胞内cAMP生成、细 胞内cGMP生成、肌醇磷脂生成、细胞膜电位变化、细胞膜附近pH变 化、细胞内蛋白质的磷酸化、c-fos和c-jun的诱导/活化、花生四烯酸游 离等)的受体。松弛素-3受体可以是任何来源的，只要其满足上述条件， 可以为例如表达人或人以外的生物[如非人哺乳动物(如小鼠、大鼠、 仓鼠、猪、犬等)、鸟类、爬虫类、两栖类、鱼类、昆虫类等]的松弛 素-3受体的脏器、组织、细胞等天然来源的物质，也包括按照公知的基 因工程技术、合成技术等人为制备的物质。此外，作为松弛素-3的部分 多肽，只要其可用于后述的筛选方法中，则没有特别限定。例如可以使 用具有与本发明松弛素-3结合的能力的部分多肽、包含相当于细胞膜外
区域的氨基酸序列的部分多肽等。这种情况下，构成部分多肽的氨基酸 数为松弛素-3受体的氨基酸数的90%、 80%、 70%、 60%、 50%、 40 %、 30%、 20%、 10%或5%。
具体地，松弛素-3可以使用已有报道的公知受体，如LGR7( GenBank 登录号NM—021634 ) 、 SALPR ( GenBank登录号NM 016568,也称
GPCR135)或GPR100 ( GenBank登录号AB—083593,也称hGPCRll、 GPCR142)等。
使用SALPR的、与焦虑作用调节相关的化合物的筛选方法
以下在本说明书中，作为本发明的一个优选方案，对采用SALPR 筛选与精神状态调节、例如焦虑作用的调节(抑制或促进焦虑作用)有 关的化合物的方法进行详细说明。即，本发明提供筛选与SALPR或其 部分多肽结合、与焦虑作用的调节(抑制或促进焦虑作用)有关的化合 物的方法。此外，通过使受试物作用于SALPR或其部分多肽、测定细 胞刺激活性，可以判定该受试物是否具有抑制或促进焦虑作用的效果。
SALPR或其部分多肽可以通过各种/>知方法得到。例如可以采用编 码SALPR的多核苦酸(GenBank登录号NM—016568 )根据公知的基因 工程方法制备。此外作为其他的技术方案，可以通过公知的多肽合成法 得到，如可以按照液相法、固相法等常法合成。通常利用自动合成4义。 进一步地，根据其他技术方案，SALPR的部分多肽可以通过由适当的蛋 白水解酶切断SALPR而制备。根据其他技术方案，作为SALPR的部分 多肽，优选制备具有结合活性部位的部分多肽。
编码本发明的SALPR的多肽是指，由SEQ ID NO:4所示氨基酸序 列构成的多肽；与由SEQIDNO:4所示氨基酸序列构成的多肽在功能上 等价的修饰多肽；或者包含与SEQ ID NO:4所示氨基酸序列具有70 %或 以上、优选80%或以上、更优选85%或以上、进一步优选90%或以上、 更进一步优选95%或以上、特别优选98%或以上、最优选99%或以上 同源性的氨基酸序列的多肽，且表现出与SALPR基本相同的活性(例 如与松弛素-3结合的能力和由该结合产生的细胞刺激活性、或焦虑作用 的调节)。
与包含SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽在功能上等价的修饰多 肽是指，在包含SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽中，缺失、置换、 插入和/或添加了 1个或多个(优选1个或几个)氨基酸得到的、且表现 出与SALPR基本相同的活性(例如与松弛素-3结合的能力和由该结合 产生的细胞刺激活性、或焦虑作用的调节)的多肽。
进一步地，也可以使用SALPR的部分多肽，只要其具有与SALPR 基本相同的活性(例如与松弛素-3结合的能力和由该结合产生的细胞刺 激活性、或焦虑作用的调节)。作为SALPR的部分多肽，可以使用具
有下述部位的部分多肽，所述部位是具有与松弛素-3结合的能力的部位。
以下详述使用SALPR的基因工程的方法；但也可以使用其部分多
肽，只要其可用于后述的筛选方法中。 SALPR的制备
将编码SALPR的多核苷酸导入适当的宿主细胞，将得到的转化体 在可以表达的条件下培养，可以不经纯化从该培养物中获得所要的多 肽，也可按照表达蛋白的分离和纯化中常用的方法、从该培养物中分离 和纯化所要的多肽，从而制备出SALPR。上述分离和纯化方法的例子包 括硫酸铵盐析、使用离子交换纤维素的离子交换柱色谱法、使用分子筛 凝胶的分子筛柱色谱法、使用蛋白A结合多糖类的亲和层析柱色谱法、 透析、或冷冻千燥。
编码SALPR的多核苷酸
对于编码本发明的SALPR的多核苷酸没有特别限定，只要其为编 码本发明的SALPR的多核苷酸。
在此所用的术语"多核苦酸"包括DNA和RNA。更具体地，本发 明所用的多核苷酸选自下述多核苷酸(a) ~ (e):
(a) 包含SEQIDNO:3所示碱基序列的多核苷酸；
(b) 编码"由SEQ ID NO:4所示氨基酸序列构成的多肽"的多核
苷酸；
(c )编码"包含SEQ ID NO:4所示氨基酸序列、且表现出与SALPR 基本相同的活性的多肽"的多核苷酸；
(d )编码"包含在SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的1个或多个(优 选1个或几个)位点缺失、置换、插入和/或添加了 1个或多个(优选1 个或几个)氨基酸得到的氨基酸序列，且表现出与上述SALPR基本相 同的活性的多肽"的多核苷酸；和
(e)在严格条件下与包含SEQ ID NO:3所示碱基序列的多核苷酸 杂交、且编码表现出与SALPR基本相同的活性的多肽的多核苷酸。
根据本发明的一个技术方案，编码本发明的SALPR的多核苷酸为 包含SEQIDNO:3所示碱基序列的多核苷酸。SEQIDNO:3所示多核苷 酸编码包含SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的SALPR。
根据本发明的另一个技术方案，本发明所用的多核苷酸为编码下述
多肽的多核苷酸，上述多肽为"包含在SEQIDNO:4所示氨基酸序列的 1个或多个(优选1个或几个)位点缺失、置换、插入和/或添加了 1个 或多个(优选1个或几个)氨基酸的氨基酸序列，且表现出与上述SALPR 基本相同的活性的多肽"。这里，可缺失、置换、插入和/或添加的氨基 酸数为例如1 ~30个、优选1 ~20个、更优选1 ~ 10个、进一步优选1 ~ 5个，最优选1 2个。
根据本发明的另一个技术方案，编码本发明的SALPR的多核苷酸 为"在严格条件下与包含SEQ ID NO:3所示碱基序列的多核香酸杂交、 且编码表现出与SALPR基本相同的活性的多肽，，的多核苷酸。进一步 地，根据本发明的另一个技术方案，编码本发明的SALPR的多核苦酸 为"在严格条件下与包含SEQ ID NO:3所示碱基序列的多核苷酸杂交、 且编码表现出与SALPR基本相同的活性的多肽"的多核苷酸。
质粒
对于上述转化中使用的质粒没有特别限定，只要其包含编码SALPR 的多核苷酸。其可通过向根据所用宿主细胞适当选择的公知表达载体中 插入该多核苷酸得到。
转化体
对于上述转化体也没有特别限定，只要其包含编码SALPR的多核 苷酸。例如，其可以是将该多核苷酸整合入宿主细胞的染色体中形成的 转化体；以质粒形式包含该多核苷酸的转化体；不表达SALPR的转化 体。该转化体可以通过用上述质粒、或上述多核苷酸本身转化所需宿主 细胞得到。
上述宿主细胞的例子包括常用的公知微生物，如大肠杆菌(如E. coli JM109 )和酵母(》口 Saccharomyces cerevisiae W303 ) ; /^知的i备养纟田月包， 例如动物细胞(如CHO纟田月包、HEK-293细胞和COS细胞)和昆虫细胞 (^口 BmN4细月包)。
上述表达载体的例子包括对于大肠杆菌，有pUC、 pTV、 pGEX、 pKK和pTrcHis;对于酵母，有pEMBLY和pYES2;对于CHO细胞、 HEK-293细胞和COS细胞，有pcDNA3、 pMAMneo和pBabe Puro;对 于BmN4细胞，有包含家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的多角体蛋白 启动子的载体(如pBK283 )。
这里所用的含有SALPR的细胞，只要在细胞膜表面表达SALPR，
则没有特别限定。其可如下得到例如在可以表达SALPR的条件下培 养上述转化体(即，用包含编码SALPR的多核苷酸的质粒转化的细胞)； 或将编码SALPR的RNA注入适当的细胞，并在可以表达SALPR的条 件下进行培养。 细胞膜级分
本发明的含有SALPR的细胞膜级分可以通过例如将表达本发明的 SALPR的细胞破碎后，分离富含细胞膜的级分而得到。细胞的破碎方法 包括采用匀浆器(如Potter-Elvehiem型匀浆器)压碎细胞的方法、用 韦林搅切器或Polytron ( Kinematica)破碎、超声波破碎、或采用弗氏细 胞压碎器在加压的同时使细胞从细小喷嘴中喷出而破碎等。此外，细胞 膜的分离方法包括离心分离法，如差速离心分离法或密度梯度离心法。
法中，可以采用SALPR、上述细胞膜级分(即含有SALPR的细胞膜级 分)或上述细胞(即含有SALPR的细胞)。
此外，本发明的筛选方法包括和利用作为第一技术方案，可列举 检查受试物是否与SALPR特异结合的方法；作为第二技术方案，可列 举检查由受试物与SALPR的结合而产生的细胞刺激活性(如细胞内Ca2+ 的游离、腺苷酸环化酶的活化、细胞内cAMP生成、细胞内cGMP生成、 肌醇磷脂生成、细胞膜电位变化、细胞膜附近pH变化、细胞内蛋白质 的磷酸化、c-fos和c-jun的诱导活性、花生四烯酸游离等)的方法。
在本发明的筛选方法的第一技术方案中，例如，通过使受试物与 SALPR、上述细胞膜级分或上述细胞接触，分析受试物是否与SALPR、 上述细胞膜级分或上述细胞结合，从而可以通过SALPR筛选化合物， 但对其促进或抑制焦虑作用的能力不作区分。
具体地，在受试物不存在条件下和受试物存在条件下，使SALPR、 上述细胞或上述细胞膜级分与标记了的松弛素-3接触，比较在上述条件 下SALPR、上述细胞膜级分或上述细胞与松弛素-3的特异结合量，由此 可实现化合物的筛选，而不区分SALPR介导的促进或抑制焦虑作用的 能力。即，当上述受试物具有SALPR介导的促进或抑制焦虑作用的能 力时，与受试物不存在时的SALPR、上述细胞或上述细胞膜级分与松弛 素-3的特异结合量相比，受试物存在时的上述特异结合量降低。
在本发明的筛选方法中，作为松弛素-3,可以使用标记了的松弛素
-3，以比较SALPR、上述细胞膜级分或上述细胞与松弛素-3的特异结合 量。作为上述标记，可以使用例如放射性同位素、酶、荧光物质、或发 光物质等。放射性同位素的例子包括卩H]、 [14C]、 [1251]、 ["S]等。上述 酶的例子包括P-半乳糖苦酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶等。荧光物质物 质的例子包括异硫氰酸荧光素、BODIPY。发光物质的例子包括安光素、 硝酸双-N-曱基吖。定(lucigenin)。根据情况不同，为了使标记物质和本 发明的松弛素-3结合，也可以采用生物素-亲和素系统、松弛素-3的抗 体。
根据本发明的筛选方法，可以筛选与SALPR、上述细胞膜级分或上 述细胞结合的化合物，以抑制它们与本发明的松弛素-3的结合，而不区 分通过SALPR促进或抑制焦虑作用的能力。
在本发明筛选方法的第二个技术方案中，在受试物不存在条件下和 受试物存在条件下，使上述细胞与标记了的本发明的松弛素-3接触，通
一步地，比较在上述条件下的该松弛素-3的特定细胞活性，从而筛选化 合物，并区分其通过SALPR促进或抑制焦虑作用的能力。
在上述技术方案中，与上述细胞结合、并通过包含于上述细胞的受 体表现出细胞刺激活性的受试物，可以作为通过SAPLR抑制焦虑作用 的化合物被选择。
另一方面，在上述技术方案中，阻碍上述细胞和该松弛素-3的结 合、但不表现细胞刺激活性的受试物可以作为通过SAPLR促进焦虑作 用的化合物被选择。
本发明的筛选方法可以通过利用如腺苷酸环化酶活性的抑制作为 细胞刺激活性来实施。
在该技术方案的筛选方法中，例如可以采用^^知的方法测定由腺苷 酸环化酶的活化在细胞内生成的cAMP,从而筛选化合物，并区分该化 合物通过SALPR促进或抑制焦虑作用的能力。该技术方案利用了由本 发明的松弛素-3与SALPR结合所产生的细胞内信号传递，即作为SALPR 的细胞刺激活性之一的腺苷酸环化酶的活性抑制。具体地，该松弛素-3 与SALPR结合时，偶联于SALPR的G蛋白族之一的Gi族抑制腺苷酸 环化酶，使细胞内生成的环腺苷酸(cAMP:通过腺苷酸环化酶从ATP 生成)量减少。例如，当向在细胞膜上表达SALPR (优选通过导入包含SALPR的 表达载体过量表达)的来源于哺乳动物的细胞(如HEK-293细胞或CHO 细胞)中添加腺苦酸环化酶激活剂[如毛喉素(FSK)]时，细胞内的 cAMP的浓度上升。
此外，在添加腺苷酸环化酶激活剂时，如果加入本发明的松弛素-3, 则在促进由腺苦酸环化酶激活剂引起的上述腺苷酸环化酶活性的同 时，也会产生因该松弛素-3作用于本发明的SALPR所产生的腺苷酸环 化酶的活性抑制，结果，与单独施予腺苦酸环化酶激活剂时相比，cAMP 的生成量减少。因此，在篩选具有抑制焦虑作用的作用的化合物时，可 以选择使受试物单独接触，代替在这种筛选系统中通过SALPR作用的 松弛素-3，使cAMP的生成量减少(即与该松弛素-3具有相同作用)的 化合物。
在筛选具有促进焦虑作用的作用的化合物时，可在筛选细胞中添加 腺苷酸环化酶激活剂、本发明的松弛素-3和受试物。与单独添加腺苷酸 环化酶激活剂的情况相比，由于该松弛素-3的作用，cAMP的生成量减 少；但当受试物拮抗松弛素-3的作用时，cAMP生成的减少受到抑制。 此时，选择上述受试物作为促进焦虑作用的化合物。
作为测定细胞内cAMP的方法，例如有免疫测定法等。该测定也可 使用市售的cAMP定量试剂盒实施。
在其他技术方案的筛选方法中，例如，通过采用在细胞膜上表达
应答序列(CUE )位于5'上游的报道基因(如碱性磷酸酶基因、萤光素 酶基因、P-内酰胺酶基因、硝基还原酶基因、氯霉素乙酰转移酶基因、 卩-半乳糖苷酶基因、GFP ( green fluorescent protein)等荧光蛋白基因) 的细胞，可以筛选通过SALPR促进或抑制焦虑作用的化合物，并区分 其促进或抑制能力。该技术方案利用了这一事实，即，当上述cAMP的 生成减少时，在启动子区域具有被导入上述篩选用细胞的CRE的报道 基因的转录被抑制。
以下根据上述技术方案，对筛选程序进行更具体地说明。其中所述 筛选是指，筛选通过SALPR促进或抑制焦虑作用的化合物，并区分其 促进或抑制能力。
即，导入上述筛选用细胞的CRE是一种碱基序列，其共存于在细
胞内的cAMP浓度上升时表达亢进的基因组(cAMP诱导基因)的转录 调节区域。因此，在筛选用细胞中添加腺香酸环化酶激活剂(如FSK) 时，细胞内的cAMP上升，结果位于CRE下游的报道基因的表达量增 加。报道基因产物的表达量可如下容易地测定通过测定与报道基因产 物反应的基质产生的发光物质发光，或通过测定来自作为报道基因产物 产生的荧光蛋白的荧光。
此外，在添加腺苷酸环化酶激活剂时，如果加入本发明的松弛素-3 时，则在促进由腺苷酸环化酶激活剂引起的上述腺苷酸环化酶活性的同 时，也会产生因该松弛素-3作用于本发明的SALPR所产生的腺苷酸环 化酶的活性抑制，结果，与单独施予腺苦酸环化酶激活剂时相比，报道 基因产物表达量减少。因此，在筛选具有抑制焦虑作用的作用的化合物 时，选择使受试物单独接触，代替通过SALPR作用的松弛素-3，使报道 基因产物的表达量减少(即，与松弛素-3具有相同作用)的化合物即可。
在筛选具有促进焦虑作用的作用的化合物时，可在筛选细胞中添加 腺苷酸环化酶激活剂、本发明的松弛素-3和受试物。与单独添加腺苷酸 环化酶激活剂的情况相比，由于该松弛素-3的作用，报道基因产物表达 量减少；但当受试物拮抗松弛素-3的作用时，报道基因产物的表达量减 少受到抑制。此时，选择上述受试物作为促进焦虑作用的化合物。
受试物的作用是否是由于通过与SALPR结合的作用，可以筒单确 认。例如，与采用筛选用细胞(即，在细胞膜上表达SALPR、且含有 CRE位于5'上游的报道基因的细胞)的上述试验并行，采用对照细胞(例 如，虽然含有CRE位于5，上游的报道基因，但在细胞膜上不表达SALPR 的细胞)实施相同的试验。结果，当上述受试物的作用不是与SALPR 结合产生的作用时，关于报道基因产物的表达量，在篩选用细胞和对照 细胞中观察到相同现象；与此相对，当上述受试物的作用是与SALPR 结合产生的作用时，关于报道基因产物的表达量，在筛选用细胞和对照 细胞中观察到不同现象。
此外，作为其他的技术方案，通过将受试物、优选由上述篩选方法 选择的受试物施予受试动物，如人或人以外的生物[如非人哺乳动物(如 牛、猴、家禽、猫、小鼠、大鼠、仓鼠、猪、犬等)、鸟类、爬虫类、 两栖类、鱼类、昆虫类等],通过分析施予后的行为观察、自发运动量、 血中参数(如血中或脑中的激素或分泌肽的量等)的变化等指标，可以 确认和确定对焦虑作用的调节有影响的化合物(即，抑制或促进焦虑作
用的化合物)。具体地，可以通过Defensive burying试验(Treit等人, Pharamacology Biochemistry and Behavior, 15, p.619-626, 1981 )、开电场 (open field )试验、明暗试验、高架十字迷宫试验、Geller-Seifter冲突 试验、Vogel冲突试验、social interaction试验、Hole-board试验、Marble burying试验、恐怖条件负荷试验、强迫游泳试验、tail suspension试验， 进行行为观察。作为非人哺乳动物，例如，不仅限于正常动物，也包括 遗传性疾病模型的动物或遗传修饰动物。
作为受试物的施予形式，有经口或非经口施予。作为非经口的施予 途径，举例如静脉内、动脉内、皮下、腹腔内、气管内、直肠内、脑内、 优选在下丘脑附近的脑室内施予。将受试物施予受试动物的脑室内的方 法，可以按照将药物等施予脑室内规定位置时的常法进行，没有特别限 定。
例如，首先将受试动物麻醉后，实施将引导插管固定在规定位置上 的手术，经过适当的恢复期(如7天 14天，优选至少l周左右)后， 将注射针插入引导插管，使用连接回流泵的微注射器，优选通过上述针 施予受试物。受试物的施予量没有限定，可适当设定。受试物一般采用 人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid)或生理食盐水等配成所需浓 度。作为人工脑脊液，没有特别限定，可以采用^^知常用的人工脑脊液， 但人工脑脊液的优选例子包括aCSF(葡萄糖10mM、 KC12mM、 NaCl 115mM、 CaCl2 2.5mM、 MgS04 1.2mM、 NaHC0325mM、 KH2P04 2.2mM; pH7.4)等。受试物的施予次数可以为每日1次、或分多次使用，受试 物的施予间隔或观察间隔可以为1日至数周。
将松弛素-3施予受试动物的方法优选与上述受试物的情况同样的 方法。此外，将松弛素-3施予受试动物脑室内的方法，也优选与上述受 试物同样、采用人工脑脊液配成所需浓度的溶液。
受试物
上述受试物可以为任何化合物，可以为例如基因文库的表达产物、 合成低分子化合物文库、核酸(寡DNA、寡RNA)、合成肽文库、抗 体、细菌释放物质、细胞(微生物、植物细胞、动物细胞)提取液、细 胞(微生物、植物细胞、动物细胞)培养上清液、纯化或部分纯化多肽、 来源于海洋生物、植物或动物等的提取物、土壤、噬菌体随机肽库
(random phage peptide display library)。该化合物可以成盐,进一 步地, 该化合物及其盐也可以形成水合物，这些也包含于本发明中。
在本说明书中，受试化合物的"盐"表示在药学上容许的盐，只要 是与化合物形成药学上容许的盐，则没有特别限定。这种盐优选的例子 包括氢卣酸盐(如氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐)、无机 酸盐(如硫酸盐、硝酸盐、高氯酸盐、磷酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐)、 有机羧酸盐(如醋酸盐、草酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、柠 檬酸盐)、有机磺酸盐(如曱磺酸盐、三氟甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺 酸盐、曱苯磺酸盐、樟脑磺酸盐)、氨基酸盐(如天冬氨酸盐、谷氨酸 盐等)、季铵盐、碱金属盐(如钠盐、钾盐)、碱土金属盐(如镁盐、 钙盐)。
筛选用试剂盒
本发明的筛选用试剂盒至少含有松弛素-3受体、上述细胞(即含有 松弛素-3受体的细胞)或上述细胞膜级分(即含有松弛素-3受体的细胞 膜级分)。其有时还可以含有松弛素-3。该松弛素-3可以为标记的松弛 素-3。上述筛选用试剂盒根据需要可进一步包含各种试剂，如结合反应 用緩冲液、洗涤用緩冲液、说明书和/或器具。松弛素-3受体的优选例为 SALPR。
本发明的其他技术方案的筛选用试剂盒至少含有本发明的松弛素-
量表达)且含有cAMP应答序列'(CRE)位于5'上游的报道基因(如碱 性磷酸酶基因、或萤光素酶基因)的细胞。上述筛选用试剂盒，根据需 要可进一步包含各种试剂，如报道基因产物(如碱性磷酸酶或萤光素酶 等)的基质、腺苷酸环化酶激活剂(如FSK)、结合反应用緩冲液、洗 涤用緩冲液、说明书和/或器具等。此外，上述筛选用试剂盒也可以包含 虽含有CRE位于5，上游的报道基因，但在细胞膜上不表达松弛素-3受
体的细月包。
这里，松弛素-3受体的优选例为SALPR。 含有根据本发明的筛选方法得到的化合物的药物组合物
根据本发明的筛选方法得到的化合物，是与精神状态调节、优选焦 虑作用调节(抑制或促进焦虑作用)有关的化合物。该化合物可以成盐，
进一步地，该化合物及其盐也可以形成水合物。
因此，根据发明的篩选方法得到的化合物或其盐或它们水合物，可 以用于精神状态的治疗、优选作为焦虑治疗的抗焦虑剂。例如，它们可
以用于精神状态调节、优选焦虑作用调节中由某些异常引起的疾病的 治疗；与其他疾病(例如精神疾病、免疫疾病、代谢疾病、消化管疾病 等)和症状相关联、或由这种其他症状引起的焦虑治疗；由醇、药物等 其他物质引起的焦虑障碍治疗；在检查时或手术前后的焦虑的緩解。此 外，它们也可以作为治疗伴有焦虑症状的精神疾病、治疗由松弛素-3或 编码松弛素-3的多核苷酸异常引起的疾病的药物。
具体地，由于焦虑作用是不快的情绪状态，并经常伴有与恐怖引起 的状态相似的生理学变化和行为，所以具有抗焦虑作用的化合物具有稳 定人或人以外生物的精神状态的作用。因此，可以用于如焦虑症、广泛 性焦虑症、惊恐性障碍、恐怖症、强迫性神经失调、创伤后应激障碍、 创伤后应激障碍的治疗、精神疾病(如抑郁症、抑郁症状、双相性精神 障碍、循环性情感、情感障碍、情绪紊乱、睡眠障碍、精神分裂症)、 免疫疾病(如慢性风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、肾疾病、皮肥厚、 特应性皮炎、支气管译喘、多发性硬化症、风湿性肺炎、结节病、克罗 恩病、炎症性结肠炎、肝硬化、慢性肝炎、暴发性肝炎、脑脊髓炎、重 症肌无力)、代谢疾病(如糖尿病、肥胖性糖尿病、葡萄糖耐量障碍、 酮病、酸中毒、糖尿病性神经病变、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病 变、高脂血症、动脉硬化、心绞痛、心肌梗塞、肥胖、肥胖症、进食障 碍疾患、厌食症)、消化管疾病(如腹泻、便秘、功能性便秘、过敏性 肠综合征)和与这类症状相关的或由这类症状引起的焦虑的治疗，由 醇、药物(如苯丙胺、咖啡因、大麻、可卡因、致幻剂、吸入剂、 Phencychdine )、镇静剂、催眠药、抗焦虑药引起的焦虑障碍的治疗。 此外，也可以用于伴有焦虑症状的精神疾病(如抑郁症、抑郁症状、双 相性精神障碍、循环性情感、情感障碍、情绪紊乱、睡眠障碍、精神分 裂症)的治疗。
根据本发明的筛选方法得到的化合物或其盐或它们的水合物，可以 单独使用，也可以和药学上允许的载体配合、作为药物组合物使用。此 时有效成分在载体中的比例可在1 ~90重量％范围变动。此外，该药剂 可以以各种形式、以经口或非经口 (如静脉注射、肌肉注射、皮下给药、 直肠给药、经皮给药)中的任一给药途径，施予人或人以外的生物[如
非人哺乳动物(如牛、猴、家禽、猫、小鼠、大鼠、仓鼠、猪、犬等)、 鸟类、爬虫类、两栖类、鱼类、昆虫类等]。因此，含有根据本发明的 篩选方法得到的化合物或其盐或它们的水合物的药物组合物，可以根据 给药途径制成适当剂型，具体可制成片剂、胶嚢剂、颗粒剂、散剂和糖 浆剂等口服制剂；或注射剂、静脉滴注剂、脂质体制剂、栓剂等非口服 制剂。这些制剂可采用常用的赋型剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解 剂、表面活性剂、润滑剂、分散剂、緩冲剂、保存剂、增溶剂、防腐剂、 调味剂、止痛剂、稳定剂等，依常法制备。这里使用的无毒性添加剂包 括乳糖、果糖、葡萄糖、淀粉、明胶、硬脂酸镁、甲基纤维素或其盐、 乙醇、柠檬酸、氯化钠、磷酸钠。
这些给药形式和必要的给药剂量取决于根据本发明的筛选方法得 到的化合物或其盐或它们的水合物的选择、给药对象、给药途径、制剂 性质、患者状态、还有医师的判断。适当的给药量范围为，例如患者体
重每lkg约为1.0 ~ 1500昭、优选约10 - 500 iig左右。考虑到给药途径 的效率不同，可以料想，必要的给药量会大范围变动。例如，可以料想 与静脉注射给药相比，经口给药需要更高的给药量。这种剂量水平的变 动可以采用本领域熟知、标准的、经验上的、最优化的规程进行调整。
本说明书中的"治疗" 一般是指达到所希望的药理学效果和/或生理 学效果。从完全或部分地防止疾病和/或症状的角度而言，效果是指预防 性的；从部分地或完全地治愈疾病和/或疾病引起的不良影响的角度而 言，效果是指治疗性的。本说明书中"治疗"包含哺乳动物、尤其是人 的疾病的任意治疗，例如，包含以下(a) ~ (c)的治疗
(a) 对于可能带有疾病或症状的诱因，但尚未诊断出带有所述诱 因的患者，预防疾病或症状的产生；
(b) 抑制疾病症状，或阻止或延迟其发展；
(c) 緩和疾病症状，即，引起疾病或症状的退4亍、或症状发展的逆转。
本说明书中应用的全部先行技术文献，作为参考引入本说明书。
实施例
以下通过实施例详细i兌明本发明，但本发明并不受这些实施例限
定。编码SALPR的多核芬酸的制备
编码SALPR的多核苷酸的分离是基于SEQ ID NO:3所示的碱基序 列如下进行的。在SEQ ID NO:3中显示有1410个碱基对，已知编码 SALPR的区域是从1位到1407位(1410个碱基对，469个氨基酸残基) (GenBank登录号NM_016568)。为了通过聚合酶链反应(PCR)分 离基因，按常法制备SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12所示的PCR引物。
以human genomic DNA( Roche Diagnostics )为才莫4反，采用包含SEQ ID NO:ll和SEQ ID NO:12的组合的PCR引物和Expand High Fidelity PCR System ( Roche Diagnostics ),按照说明书的操作方法(98。C l分 -57°C 1分-72°C分)，重复30次进行PCR。结果得到约1,400个碱 基对的DNA片段。
将该DNA片段插入pCR2.1 (Invitrogen )，并通过ABI prism DNA sequence kit ( Perkin-Elmer Applied Biosystems )确^人序歹寸。结果，#皮甘翁 入从由SEQ ID NO:ll和SEQ ID NO:12构成的引物组合所得到的 pCR2.1-SALPR的1410个石威基对的序列与SEQ ID NO:3中从361位~ 1770位的长度相等，但是发现序列中l处变异。很明显该变异对于由该 位点的核酸序列所翻译的氨基酸没有影响，因此可以得到编码SALPR 的多核苷酸。逆转录病毒载体质粒的制备
通过用Sail和Clal切断pBabe Puro ( Morgenstern, J.P. and Land, H. Nucleic Adds Res., 18, p.3587-3596, 1990 ) ( SEQ ID NO:13 ),除去SV40 promoter-puro ( r)区i或，通过Klenow fragment <吏末端平端4匕。在切,泉 处插入IRES-hyg (r)区域，得到pBabeXIH,其中IRES-hyg (r)区域 是通过用Nsil和Xbal切断pIRES hyg ( Clontech )而切出的，并通过T4 聚合酶对末端进行了平端化。
通过用Sspl和BamHI切断pBabeXIH,除去5，-LTR-packaging signal。 在切，#、处4#入5，LTR-CMV promoter-packaging signal,《寻至'J pBabeCLXIH,其中5，LTR-CMV promoter-packaging signal是通过用Sspl 和BamHI切断pCLXSN (IMGENEX )而切出的。 SALPR基因导入用逆转录病毒载体质粒的制备
通过限制酶Hpal切断上述实施例2所述的逆转录病毒表达用质粒
pBabeCLXIH 。在切点处插入编码SALPR的多核苷酸，得到 pBabeCL(SALPR)IH (图1)，其中编码SALPR的多核普酸是通过用 EcoRV切断上述实施例1中得到的pCR2.1-SALPR而切出，并通过T4聚 合酶对末端进行了平端化。 SALPR基因导入用逆转录病毒载体的制备
在10cm胶原涂层皿(IWAKI)中，采用DMEM ( Sigma)國10 %月台 牛血清(FCS)-青霉素100units/mL-链霉素100pg/mL (PS)(以下 称"EBNA培养液")lOmL，培养2 x 106个293-EBNA细胞(Invitrogen )。 次日，采用脂转染试剂TmnsIT (Panvera)，通过pV-gp (通过用Nsil 和Xbal切断pVPack-GP ( Stratagene )除去IRES-hisD、并通过T4聚合 酶使末端平端化之后，自身环化而得到)、pVPack-VSV-G ( Stratagene ) 和实施例3中得到的SALPR基因导入用逆转录病毒载体质粒 (pBabeCL(SALPR)IH )各3.3昭转染上述293-EBNA细胞。然后在6 ~ 12小时后更换EBNA培养液，在37。C下继续培养。
转染2天后回收培养液，以1,200 xg离心10分钟。
将得到的上清液采用0.45,的过滤器(Millipore)过滤，得到非 浓缩逆转录病毒载体，进一步如下进行病毒载体的浓缩。
将用于超离心的50 Ultra-Clear Tubes (Beckman)用70%乙醇消毒 后用蒸馏水冲洗，然后装入约35mL非浓缩病毒载体。将其放入超离心 旋转器SW28 (Beckman)中，使用超离心装置XL-90 (Beckman)进行 19,500rpm、 IOO分钟的离心操作。离心后弃去上清液，将管放入冰中保 存。l小时后，得到约100pL残留在管壁的培养液，即浓缩病毒载体溶 液。包含环腺苷酸应答序列的报道基因导入细胞SE302的
构建
(1 )包含环腺苷酸应答序列的报道DNA的构建
参考公开发表的论文(Durocher等人 Anal Biochem 2000 284(2):316-26),如下构建与cAMP应答转录相关的unit。
为构建包含cAMP responsive element( CRE)的unit,采用CREx2hb 用的SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 15所示寡DNA、 CREx2bp用的SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示寡DNA依常法构建。
将包含各组合的寡DNA在95。C热处理后，通过緩緩降温至室温形
成双链DNA (CREx2hb、 CREx2bp)。在采用HindIII和BarrHI消化 CREx2hb、采用BamHI和Pstl消化CREx2bp的同时，采用HindIII和 Pstl消化pBluescriptlISK(+) ( Stratagene )。将消化的DNA进行电泳， 纯化两端具有限制酶消化位点的DNA,然后将这3个DNA ( CREx2hb、 CREx2bp、 pBluescriptlISK(+))同时连接，分析得到的质粒的序列，构 建成CRE4/pBluescriptlISK。
才妻着，为了4寻到包含VIP (vasoactive intestinal peptide)启动子的 DNA,按常法构建SEQ IDNO:18和SEQ IDNO:19所示的PCR引物。
以human genomic DNA ( Roche Diagostics )为才莫4反，采用包4舌SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19的组合的PCR引物和recombinant Taq polymerase ( Takara),经反复35次(94°C 30秒-55 °C 30秒-72°C 1 分)进行PCR后，得到264个碱基对的DNA ( SEQ ID NO:20 )。用Pstl 消化该264个石成基对的DNA，并插入CRE4/pBluescriptlISK(+)的Pstl位 点，确认得到的质粒的序列，构建CRE4VIP/pBluescriptIISK(+)(图2A)。 将得到的CRE4VIP/pBluescriptlISK(+)用HindIII和Smal消化后，将得到 的CRE4VIP启动子片段平端化。
从上述病毒表达载体质粒pBabeCLXIH中除去IRES ~ hygro ( r)区 域，构建pBabeCLX (图2B)。在通过从pBabeCLX中除去逆转录病毒 内源的增强子活性(LTR)中的Nhel Narl区域、而得到的外源性启动 子导入用逆转录病毒载体质粒中，导入包含CRE和VIP启动子的序列 和报道基因，即来源于胎盘的碱性磷酸酶(PLAP)(Goto等人，Molecular Pharmacology, 49, p.860-873, 1996 ),得到pBabeCLcre4vPd丽(图2C )。 (2)包含环腺苷酸应答序列的报道基因导入细胞SE302的构建
采用逆转录病毒载体质粒pBabeCLcre4vPdNN，按照实施例4所述 的方法制备逆转录病毒载体，在所述逆转录病毒载体质粒 pBabeCLcre4vPdNN中，报道基因PLAP是由环腺苷酸应答序列诱导的。 将制备的逆转录病毒载体导入HEK293细胞中，通过有限稀释法克隆得 到的细胞，在以下实验中使用在PLAP诱导中表现出最好的反应性的克 隆细胞(以下称"SE302细胞")。采用SALPR基因导入用逆转录病毒载体制备SALPR 表达细月包
采用上述实施例4制备的逆转录病毒载体，如下将SALPR基因导
入细胞。
将上述实施例5中构建的3 x 103个SE302细胞，在96孔板(旭r 夕乂力'，X公司)中，采用DMEM( Sigma公司)國10%月台牛血清(FCS) -PS (以下称"培养液")100pL进行培养。次日，将实施例4中制备的 逆转录病毒载体适当稀释，将其100pL和用培养液调制的polybrene(最 纟冬S农度8pg/mL )(另'J名hexadimethrine bromide, Sigma/>司) 一起力口入 到SE302细胞中。次日，将培养液更换成含有500吗/mL潮霉素 (Hygromycin) (Invitrogen公司)的培养液200pL。在该条件下增殖的 SALPR基因导入SE302细胞(以下称"SALPR-SE302细胞")适时传 代，用于实验。通过在SALPR-SE302细胞中添加毛喉素而增加了转录 活性的松弛素-3所产生的抑制
将上述实施例6中构建的SALPR-SE302细胞在转录活性测定用培 养基(DMEM-10。/。FBS(65。C下灭活30分钟))中混悬后，接种到96孑L 板(Beckton Dickison/^司)中，每孔1 x 104细胞。次日，添加用分析 培养基(在DMEM中添加了 0.1%牛血清白蛋白)稀释的各浓度人松弛 素-3 (Phoenix Pharmaceuticals公司)或胰岛素(Invitrogen公司)，然 后添加毛喉素(Carbio Chem公司)使最终浓度成lpmol/L。再经一 日培 养后，回收15nL细胞上清液，移至化学发光测定用的％孔板(住友《 夕，4卜公司)中，添加分析用緩冲液(280mmol/LNa2CO3-NaHC〇3、 8mmol/L MgS04、 pH10) 60jxL、 Lumiphos530 (Lumigen公司)70)iL, 在室温反应1小时后，通过Fusion平板读取器(PerkinElmer公司)测 定各孔的化学发光，作为转录活性值。以添加毛喉素l|imol/L的细胞上 清液的转录活性为100%、以未添加毛喉素的细胞上清液的活性为0% ， 添加了各受试样品的细胞上清液的活性以％表示(图3)。
结果表明，松弛素-3可以通过SALPR的活化，抑制由毛喉素引起 的转录活性上升。这种转录活性的上升不受相关多肽、即胰岛素的影 响，因此可知，其为松弛素-3特异反应。即，表明采用该实验系统，可 以判别影响松弛素-3对SALPR的激活的化合物、物质。采用Defensive burying试验研究脑室内施予松弛素-3 的抗焦虑作用(大鼠)
采用Defensive burying试验(Treit等人，Pharmacology Biochemistry and Behavior, 15, p.619國626， 1981),研究松弛素-3对焦虑作用的影响。 Defensive burying试验为 一种试验系统，其利用下述现象评价焦虑作用 或其他精神症状，如抑郁状态，所述现象为当通过电极对受试动物施 予电流刺激时，受试动物迅速表现出用铺垫(bedding material)覆盖电
极的行为。
采用抹式会社、y千卜'研究所合成的人松弛素-3 (以下也简称"人 松弛素-3 ( K研究所制)")进行实验。松弛素-3为一种多肽，
其由具有从SEQIDNO:2的N末端开始第26位(Arg) ~第52位(Trp ) 残基的氨基酸序列的多肽(人B链)、和具有从SEQ ID NO:2的N末 端开始第119位(Asp) ~第142位(Cys)残基的氨基酸序列的多肽(人 A链)构成，其中，从SEQIDNO:2的N末端开始第35位的B链半胱 氨酸与从SEQ ID NO:2的N末端开始第129位的A链半胱氨酸结合； 从SEQ ID NO:2的N末端开始第47位的B链半胱氨酸与从SEQ ID NO:2 的N末端开始第142位的A链半胱氨酸结合；以及从SEQ ID NO:2的N 末端开始第128位的A链半胱氨酸与从SEQ ID NO:2的N末端开始第 133位的A链半胱氨酸结合。
(1) 受试大鼠和脑室内施予的前处理
将实验动物用飼料MF ( Oriental Yeast)施予F344雄性大鼠(7周 龄、日本Charles river (林))，使其适应。在麻醉下在大鼠(150~200g) 的侧脑室中插入插管。然后进行一周以上施予松弛素-3的实验。
(2) 对试验箱的适应
从Defensive burying试—验实施的3日前，每日 一次将受试大鼠力丈入 铺有高至5cm的铺垫的试验箱中30分钟以上，使受试大鼠适应试验环 境。在试验实施前，在试验箱中不安装刺激电极，以使受试大鼠适应环 境。
(3) +>弛素-3^^液的配制
将人松弛素-3 ( 卜'研究所制)用生理食盐水溶解后，配制成
最终浓度为0.05nmol/大鼠或lnmol/大鼠。
(4) +>弛素-3溶液的脑室内施予
将带有引导插管的受试大鼠分成3组，采用输液泵、以5iliL/2分的 速度，施予松弛素-3施予液(0.05nmol/大鼠、N = 6、 lnmol/大鼠、N = 8)或溶剂(vehicle)(生理食盐水、N = 6)各5pL。
(5 ) Defensive burying i式^验的实施和4亍为，见察 试验当日，将受试大鼠放入安装有刺激电极的试验箱中(铺垫高 5cm),开始实验。当受试大鼠接触刺激电极时，被施予5mA的电击。 然后，在刺激电极保持通5mA电流的条件下放置受试大鼠，并开始15 分钟(900秒)的行为观察。受试大鼠的行为全部用摄像机录制下来， 用录像带测定从受到最初的电击开始15分钟内的覆盖行为时间 (buryingtime (秒))。覆盖行为定义为，受试大鼠用前足向电极方向 盖铺垫的行为。在人松弛素-3施予组和溶剂组的比较中，按照Dunnett 型多重比较检验法进行显著性差异的检验。图中*表示p<0.05。如图4 所示，与溶剂施予组相比，在人松弛素-3施予组中，发现覆盖行为时间 减少，在lnmol施予组中观察到显箸减少。该结果表明，松弛素-3具有 抗焦虑作用。采用高架十字迷宫试j全研究脑室内施予杠、弛素-3的抗
焦虑作用(小鼠)
采用高架十字迷宫试验，研究了松弛素-3对焦虑作用的影响。高架 十字迷宫试验为一种行为药理学试验，其以在开放臂(叩enarms)中的 探索行为(开放臂滞留时间等)为指标，广泛用于实验动物(如，大鼠 或小鼠)的焦虑水平的测定、抗焦虑药的药效评价。
(1) 受试小鼠和脑室内施予的前处理
在麻醉的7周龄BALB/c雄性小鼠(日本Charles river (抹))的侧 脑室中插入插管。在对小鼠饲养一周以上后，进行施予松弛素-3的实 验。
(2) 松弛素-3溶液的调制
将人松弛素-3 (、:/f卜'研究所制)用生理食盐水溶解后，配制成 最终浓度为lnmol/小鼠。
(3) 松弛素-3溶液的脑室内施予
对带有引导插管的受试小鼠，采用输液泵、以lpL/分的速度施予松 弛素-3施予液(N = 8)或溶剂(生理食盐水)(N = 9)各2pL至脑室内。
(4) 抗焦虑作用的测定
使用高架十字迷宫进行抗焦虑作用的测定。迷宫设置在离地板45cm 高的地方，包括从位于中心的中心平台(5cmx5cm)伸出的以加号(+ )
形式排列的四个臂。2个对立的开放臂(长30cmx宽5cm)和2个对立 的闭合臂(closed arms )(长30cm x宽5cm x壁高15cm )。安装照明 以使开放臂的地板为60~80勒克斯。在脑室内施予IO分钟后将小鼠放 在十字迷宫的中心，面向开》文臂的一侧，该试验进4亍5分钟。试—验时间 限定于上午11时至16时。小鼠的行为用录像机录制下来，试验结束后 通过分析录像，测定各小鼠进入开放臂和闭合臂的次数、在开放臂和闭 合臂的滞留时间。图5和图6分别表示进入开放臂和闭合臂的总次数、 5分钟内滞留在开放臂的时间比例(％ )。在人松弛素-3施予组和溶剂 组的比较中，按照t检验法进行显著性差异的检验。在图5和图6中* 表示p0.05。如图5所示，在人松弛素-3施予组与溶剂组之间，进入开 放臂和闭合臂的总次数没有差异。但如图6所示，与溶剂组相比，在人 松弛素-3施予组中，在开放臂内滞留的时间比例明显提高。该结果表 明，松弛素-3具有抗焦虑作用。采用高架十字迷宫试—验研究脑室内施予*>弛素-3的抗
焦虑作用(大鼠)
通过高架十字迷宫试验研究了松弛素-3对焦虑作用的影响。
(1) 受试大鼠和脑室内施予的前处理
在麻醉的9周龄Wistar雄性大鼠(日本Charles river (抹))的侧 脑室中插入插管。在饲养一周以上后进行施予松弛素-3的实验。
(2) +>弛素-3溶液的配制
将人松弛素-3 ( 、:/f卜'研究所制)用生理食盐水溶解后，配制成 最终浓度为10pmol/大鼠或50pmol/大鼠。
(3) 水>弛素-3溶液的脑室内施予
对带有引导插管的受试大鼠，采用输液泵、以2.SjiL/分的速度施予 松弛素-3施予液(10pmol/大鼠、N = 8、 50pmol/大鼠、N = 7 )或vehicle (生理食盐水、N = 7)各5pL。
(4) 抗焦虑作用的测定
使用高架十字迷宫进行抗焦虑作用的测定。迷宫设置在离地板50cm 高的地方，包括乂人位于中心的中心平台(10cmx 10cm)伸出的以加号 (+ )形式排列的四个臂。2个对立的开放臂(长S0cmx宽10cm)和2 个对立的闭合臂(长50cmx宽10cmx壁高40cm )。安装照明以使开》i: 臂的地板为60~80勒克斯。在脑室内施予10分钟后将小鼠放在十字迷
宫的中心，面向开放臂的一侧，该试验进行5分钟。试验时间限定于上
午11时至16时。大鼠的行为用录像机录制下来，试验结束后通过分析
录像，测定各大鼠进入开放臂和闭合臂的次数、在开放臂和闭合臂的滞
留时间。图7和图8分别表示进入开放臂和闭合臂的总次数、5分钟内 滞留在开放臂的时间比例(％ )。在人松弛素-3施予组和溶剂组的比较 中，按照t检验法进行显著性差异的检验。在图7和图8中，*表示 p<0.05。如图7所示，在10pmol/大鼠施予组、50pmol/大鼠施予组与溶 剂组之间，进入开放臂和闭合臂的总次数没有差异。但如图8所示，与 溶剂组相比，在10pmol/大鼠施予组、50pmol/大鼠施予组中，在开放臂 内滞留的时间增加，且对10pmol/大鼠组的作用具有统计学上的显著差 异。该结果表明，松弛素-3具有抗焦虑作用。
产业实用性
由于松弛素-3具有抗焦虑作用，例如对于焦虑的治疗是有用的。此 外，由于松弛素-3具有抗焦虑作用，激活或抑制松弛素-3受体的化合物 或其盐或它们的水合物，可以用于焦虑的治疗；筛选激活或抑制该多肽 受体的、与焦虑调节有关的化合物或其盐或它们的水合物的方法以及这 种筛选用的试剂盒是有用的。
权利要求
1.抗焦虑剂，其含有松弛素-3、其盐或它们的水合物。
2. 权利要求1所述的抗焦虑剂，其中，松弛素-3为人松弛素-3。
3. 权利要求1所述的抗焦虑剂，其中，松弛素-3为一种多肽，该 多肽由可从松弛素-3前原蛋白的功能等价修饰多肽得到的A链和B链构 成，或由可从松弛素-3前原蛋白的同源多肽得到的A链和B4连构成，其 中，A链和B链的半胱氨酸残基通过二硫键结合。
4. 具有抗焦虑作用的化合物或其盐或它们的水合物的筛选方法， 该方法包括如下步骤(A) 使受试物与松弛素-3受体、含有松弛素-3受体的细胞或该细 胞的膜级分接触的步骤，(B) 测定松弛素-3受体介导的细胞刺激活性的步骤。
5. 抑制或促进焦虑作用的化合物或其盐或它们的水合物的筛选方 法，该方法包括以下步骤(A) 使受试物和松弛素-3、其盐或它们的水合物与松弛素-3受体、 含有松弛素-3受体的细胞或该细胞的膜级分接触的步骤。
6. 权利要求5所述的筛选方法，其中松弛素-3为人松弛素-3。
7. 权利要求5所述的筛选方法，其中松弛素-3为一种多肽，该多 肽由可从松弛素-3前原蛋白的功能等价修饰多肽得到的A链和B链构 成，或由可从松弛素-3前原蛋白的同源多肽得到的A链和B链构成，其 中，A链和B链的半胱氨酸残基通过二硫键结合。
8. 权利要求5 ~ 7中任一项所述的抑制或促进焦虑作用的化合物或 其盐或它们的水合物的筛选方法，其进一步包含如下步骤(B) 测定松弛素-3受体介导的细胞刺激活性的步骤。
9. 权利要求4~8中任一项所述的筛选方法，其中，松弛素-3受体 为抑生长素-血管生成素样肽受体(SALPR)或其部分多肽。
10. 权利要求9所述的筛选方法，其中，SALPR为包含SEQ ID NO:4 所示氨基酸序列的多肽。
11. 具有抗焦虑作用的化合物或其盐或它们的水合物的筛选用试剂 盒，其包含松弛素-3受体、含有松弛素-3受体的细胞或该细胞的膜级分。
12. 权利要求11所述的筛选用试剂盒，其进一步包含松弛素-3、其盐或它们的水合物。
13. 权利要求12所述的筛选用试剂盒，其中，松弛素-3为人松弛素-3。
14. 权利要求12所述的筛选用试剂盒，其中，松弛素-3为一种多 肽，该多肽由可从松弛素-3前原蛋白的功能等价修饰多肽得到的A链和 B链构成，或由可从松弛素-3前原蛋白的同源多肽得到的A链和B链构 成，其中，A链和B链的半胱氨酸残基通过二硫键结合。
15. 权利要求12-14中任一项所述的篩选用试剂盒，其中，松弛 素-3被标记。
16. 权利要求11-15中任一项所述的筛选用试剂盒，其中，松弛 素-3受体为SALPR或其部分多肽。
17. 权利要求16所述的筛选用试剂盒，其中，SALPR为包含SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽。
18. 抑制或促进焦虑作用的化合物或其盐或它们的水合物的筛选方 法，该方法包括将作用于松弛素-3受体的化合物施予人或人以外的生物，并测定施予后的焦虑作用的步骤。
19. 权利要求18所述的筛选方法，其中测定焦虑作用的步骤包括 defensive burying test或高架十字迷宫实3全。
20. 权利要求18或19所述的筛选方法，其中作用于松弛素-3受体 的化合物是根据权利要求4 10中任一项所述的方法得到的化合物。
全文摘要
本发明的目的在于提供具有抗焦虑作用的多肽；含有该多肽的治疗剂；采用该多肽治疗焦虑的方法；筛选可激活或抑制该多肽的受体的、与焦虑调节相关的化合物或其盐或它们的水合物的方法；和这种筛选用的试剂盒。本发明提供含有松弛素-3的抗焦虑剂。
文档编号A61K38/00GK101189019SQ200680014219
公开日2008年5月28日 申请日期2006年4月26日 优先权日2005年4月26日
发明者关矢智子, 志方幸道, 新井彻, 飞弹隆之, 高桥英机 申请人:卫材R&D管理有限公司