Col4a5基因突变体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了COL4A5基因突变体及其应用，具体涉及分离的编码COL4A5突变体的核酸，分离的多肽，筛选易患AS综合征的生物样品的方法，筛选易患AS综合征的生物样品的系统，以及用于筛选易患AS综合征的生物样品的试剂盒。其中，该分离的编码COL4A5突变体的核酸，与SEQ ID NO：1相比，具有c.1365_1373delTCCAGGCCC突变。通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患AS综合征。
【专利说明】C0L4A5基因突变体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及C0L4A5基因突变体及其应用。具体地，本发明涉及分离编码C0L4A5 突变体的核酸，分离的多肽，筛选易患AS综合征的生物样品的方法，筛选易患AS综合征的 生物样品的系统，用于筛选易患AS综合征的生物样品的试剂盒，构建体以及重组细胞。
【背景技术】
[0002] 遗传性肾炎（即Alport综合征，在本文中有时也称为"AS综合征"）是一种主要表 现为血尿、肾功能进行性减退、感音神经性耳聋和眼部异常的遗传性肾小球基底膜疾病。AS 是一种单病，存在遗传异质性，现在认为共有3种遗传方式，即性连锁显性遗传、常染色体 显性遗传及常染色体隐性遗传。性连锁显性遗传(0MIM =301050)为本病主要遗传方式，约 占85%，致病基因为C0L4A5,基因突变的发生率约为1/10000?1/5000。而1/7?1/3家系 按常染色体显性遗传(MIM ：203780)方式遗传，致病基因为C0L4A3及C0L4A4。常染色体隐 性遗传方式（MIM :104200)并不多见，致病基因为常染色体基因C0L4A3,因而一般近亲结婚 才有发病的可能。本类疾病的致病相关机制已有较多报道，但目前仍不明确。
[0003] 因而，目前对AS综合征的研究尤其是其致病突变的确定仍有待深入。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的 在于提出一种能够有效筛选易患AS综合征的生物样品的方法。
[0005] 本发明是基于发明人的下列工作完成的：发明人通过目标区域捕获联合候 选基因突变验证的方法确定了AS综合征的一个新的致病突变--C0L4A5基因的 c. 1365_1373delTCCAGGCCC突变。
[0006] 根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的编码C0L4A5突变体的核酸。根 据本发明的实施例，所述核酸与SEQ ID N0 :1相比，具有c. 1365_1373delTCCAGGCCC突变， 即相对于野生型C0L4A5基因，本发明的C0L4A5基因突变体的cDNA缺失第1365位到第1373 位碱基TCCAGGCCC。根据本发明的实施例，发明人确定了 C0L4A5基因的突变体，该突变体 与AS综合征的发病密切相关，从而通过检测该突变体在生物样品中是否存在，可以有效地 检测生物样品是否易患AS综合征。
[0007] 根据本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施 例，与SEQIDN0:2相比，所述分离的多肽具有p.456_458delPGP突变，即该突变是由于 c. 1365_1373delTCCAGGCCC突变而引起的，具体地，相对于野生型C0L4A5,本发明的分离的 多肽（即C0L4A5突变体）缺失第456位至第458位氨基酸PGP。通过检测生物样品中是否 表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易患AS综合征。
[0008] 根据本发明的第三方面，本发明提出了 一种筛选易患AS综合征的生物样品 的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：从所述生物样品提取核酸样本； 确定所述核酸样本的核酸序列；所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID N0:1相比，具有 c. 1365_1373delTCCAGGCCC突变是所述生物样品易患AS综合征的指示。通过根据本发明实 施例的筛选易患AS综合征的生物样品的方法，可以有效地筛选易患AS综合征的生物样品。
[0009] 根据本发明的第四方面，本发明提出了一种筛选易患AS综合征的生物样品的系 统。根据本发明的实施例，该系统包括：核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物 样品提取核酸样本；核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连， 用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列；判断装置，所述判断装 置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于所述核酸样本的核酸序列与SEQIDN0 :1相比， 是否具有c. 1365_1373delTCCAGGCCC突变，判断所述生物样品是否易患AS综合征。利用该 系统，能够有效地实施前述筛选易患AS综合征的生物样品的方法，从而可以有效地筛选易 患AS综合征的生物样品。
[0010] 根据本发明的第五方面，本发明提出了一种用于筛选易患AS综合征的生物样品 的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒含有：适于检测C0L4A5基因突变体的试剂，其中 与SEQIDN0:1相比，该C0L4A5基因突变体具有c. 1365_1373delTCCAGGCCC突变。利用根 据本发明的实施例的试剂盒，能够有效地筛选易患AS综合征的生物样品。
[0011] 根据本发明的第六方面，本发明还提出了一种构建体。根据本发明的实施例，该构 建体包含前面所述的分离的编码C0L4A5突变体的核酸。由此，利用本发明的构建体转化受 体细胞获得的重组细胞，能够有效地用于筛选治疗AS综合征的药物。
[0012] 根据本发明的第七方面，本发明还提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该 重组细胞是通过前面所述的构建体转化受体细胞而获得的。根据本发明的一些实施例，利 用本发明的重组细胞，能够有效地筛选治疗AS综合征的药物。
[0013] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变 得明显，或通过本发明的实践了解到。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变 得明显和容易理解，其中 ：
[0015] 图1显示了根据本发明实施例的筛选易患AS综合征的生物样品的系统及其组成 部分的示意图，其中，
[0016] 图1A为根据本发明实施例的筛选易患AS综合征的生物样品的系统的示意图，
[0017] 图1B为根据本发明实施例的核酸提取装置的示意图，
[0018] 图1C为根据本发明实施例的核酸序列确定装置的示意图；
[0019] 图2显示了根据本发明一个实施例的AS综合征患者家系的家系图；
[0020] 图3显示了根据本发明的一个实施例，图2所示AS综合征患者家系中未发病男 性、女性患者及男性患者的C0L4A5基因c. 1365_1373delTCCAGGCCC突变位点的代表性 Sanger测序验证峰图。
【具体实施方式】
[0021] 下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终 相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附 图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0022] C0L4A5基因突变体
[0023] 根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的编码C0L4A5突变体的核酸。根 据本发明的实施例，所述核酸与SEQ ID N0 :1相比，具有c. 1365_1373delTCCAGGCCC突变。 在本文中所使用的表达方式"编码C0L4A5突变体的核酸"，是指与编码C0L4A5突变体的 基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受特别限制，可以是任何包含与C0L4A5突变体的 编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或 cDNA。根据本发明的一个具体示例，前面所述的编码C0L4A5突变体的核酸为DNA。根据本 发明的实施例，发明人确定了 C0L4A5基因的突变体，该突变体与AS综合征的发病密切相 关，从而通过检测该突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患AS 综合征，也可以通过检测该突变体在生物体中是否存在，可以有效地预测生物体是否易患 AS综合征。
[0024] 对于本发明说明书和权利要求书中，提及核酸，本领域技术人员应当理解，实际包 括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况 下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如，提及SEQ ID N0 :1，实际 包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。
[0025] 该编码C0L4A5突变体的核酸，是本申请的发明人通过目标区域捕获测序联合候 选基因突变验证的方法确定的AS综合征的致病基因C0L4A5的新的致病突变。该致病突变 位点在现有技术中并未被提到。需要说明的是，在本文中所使用的表达方式"目标区域捕获 测序"是指利用特制的探针对客户感兴趣的某段特定序列进行捕获富集后，再利用第二代 测序技术进行高通量测序及基因组分析的方法。利用该方法能够获得指定目标区域的遗传 信息，极大的提高了基因组中目标区域的研究效率，显著降低了研究成本。在本发明中，将 该方法用于识别和研究与疾病相关的编码区域内的结构变异，进而，结合大量的公共数据 库提供的数据，有利于更好地解释所得变异结构之间的关联和致病机理。
[0026] 其中，野生型C0L4A5基因的cDNA具有如下所示的核苷酸序列：
【权利要求】
1. 一种分离的编码C0L4A5突变体的核酸，其特征在于，所述核酸与SEQ ID NO :1相比， 具有 c. 1365_1373delTCCAGGCCC 突变， 任选地，所述核酸为DNA。
2. -种分离的多肽，其特征在于，与SEQ ID N0:2相比，所述分离的多肽具有 p. 456_458delPGP 突变， 任选地，所述多肽是由权利要求1所述的核酸编码的。
3. -种筛选易患AS综合征的生物样品的方法，其特征在于，包括以下步骤： 从所述生物样品提取核酸样本； 确定所述核酸样本的核酸序列； 所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO :1相比，具有c. 1365_1373delTCCAGGCCC突变 是所述生物样品易患AS综合征的指示， 任选地，所述生物样本为选自人体血液、皮肤、皮下组织的至少一种， 任选地，所述核酸样本为全基因组DNA。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，从所述生物样品提取核酸样本进一步包 括： 从所述生物样品提取RNA样本，优选所述RNA样本为mRNA ;以及 基于所述RNA样本，通过反转录反应，获得cDNA样本，所述cDNA样本构成所述核酸样 本。
5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，确定所述核酸样本的核酸序列进一步包 括： 针对所述核酸样本，构建核酸测序文库；以及 对所述核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果，任选地，采 用选自Hiseq2000、S0LiD、454和单分子测序装置的至少一种对所述核酸测序文库进行测 序， 任选地，针对所述核酸样本，构建核酸测序文库进一步包括： 利用C0L4A5基因外显子特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增；以及 针对所得到的扩增产物，构建所述核酸测序文库， 任选地，所述特异性引物具有如SEQ ID NO :5-6所示的核苷酸序列。
6. -种筛选易患AS综合征的生物样品的系统，其特征在于，包括： 核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本； 核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核 酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列； 判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于所述核酸样本的核 酸序列与SEQ ID N0:1相比，是否具有c. 1365_1373delTCCAGGCCC突变，判断所述生物样品 是否易患AS综合征， 任选地，所述核酸提取装置进一步包括： RNA提取单元，所述RNA提取单元用于从所述生物样品提取RNA样本；以及 反转录单元，所述反转录单元与所述RNA提取单元相连，用于对所述RNA样本进行反转 录反应，以便获得cDNA样本，所述cDNA样本构成所述核酸样本。
7. 根据权利要求6所述的系统，其特征在于，所述核酸序列确定装置进一步包括： 文库构建单元，所述文库构建单元用于针对所述核酸样本，构建核酸测序文库；以及 测序单元，所述测序单元与所述文库构建单元相连，用于对所述核酸测序文库进行测 序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果， 任选地，所述文库构建单元进一步包括： PCR扩增模块，所述PCR扩增模块中设置有C0L4A5基因外显子特异性引物，以便利用所 述特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增， 任选地，所述特异性引物具有如SEQ ID NO :5-6所示的核苷酸序列， 任选地，所述测序单元包括选自HISEQ2000、S0LiD、454和单分子测序装置的至少一 种。
8. -种用于筛选易患AS综合征的生物样品的试剂盒，其特征在于，含有： 适于检测C0L4A5基因突变体的试剂，其中与SEQ ID N0:1相比，所述C0L4A5基因突变 体具有 c. 1365_1373delTCCAGGCCC 突变， 任选地，所述试剂为核酸探针或引物， 任选地，所述核酸探针或引物具有如SEQ ID NO :5-6所示的核苷酸序列。
9. 一种构建体，其特征在于，包含权利要求1所述的分离的编码C0L4A5突变体的核酸。
10. -种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是通过权利要求9所述的构建体转化受 体细胞而获得的。
【文档编号】C12N15/12GK104450726SQ201310425262
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年9月17日 优先权日:2013年9月17日
【发明者】朱庆燕, 朱倩, 王俊, 汪建, 杨焕明 申请人:深圳华大基因科技有限公司