凝血因子ix缀合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及与肝素原(HEP)聚合物缀合的因子IX多肽、其制备方法以及此类缀合物的用途。所得缀合物可用于例如出血性病症如B型血友病的治疗或预防。
【专利说明】
凝血因子IX缀合物
技术领域
[0001] 本发明设及凝血因子IX与肝素原化eparosan)聚合物之间的缀合物及其用途。
【背景技术】
[0002] 在患有凝血病的受试者中，诸如在患有血友病的人中，凝血级联的各个步骤由于 例如凝血因子的缺乏或存在不足而成为功能障碍的。凝血级联的一部分的运种功能障碍导 致不充分的血液凝固W及潜在危及生命的出血或对内脏器官如关节的损伤。
[0003] B型血友病是由凝血因子IX活性的缺乏或功能障碍引起的，并且其患者可通过按 需施用因子IX来治疗。
[0004] 目前的治疗建议正从传统的按需治疗转向预防。目前的预防性疗法需要每周多次 给药，但为了获得最佳血浆水平和功效，每日一次注射将会更好。由于与每日施用相关的实 际和经济的限制，运对于患者而言不是理想的解决方案。
[0005] 凝血因子IX是一种用于治疗B型血友病的有价值的治疗性多肤。虽然现今正在使 用商购可得形式的因子IX，但本领域仍然普遍需要具有改善的药代动力学的更长效的因子 IX多肤。
[0006] 治疗性多肤如因子IX多肤可W与半衰期延长部分融合或缀合，W便延长所述药物 在施用于患者之后的血浆半衰期。
[0007] 可通过使用酶法进行例如亲水聚合物形式的半衰期延长部分与肤或多肤的缀合。 运些方法可W是选择性的，其要求在蛋白质序列中存在特异性的肤共有基序，或要求存在 翻译后部分如聚糖。
[0008] 已描述了用于修饰凝血因子上的N-或0-聚糖的选择性酶法。例如，已描述了化学 修饰的唾液酸底物（Malmstromj Anal Bioanal 化em 2012;403:1167-1177)，其可用 于使用唾液酸转移酶ST3Gaini使因子Vila在N-聚糖上发生糖基聚乙二醇化(Stennicke， 皿等人.Thromb 化emost. 2008年11月；100(5) :920-8),?及使用ST3GalI使因子VIII在0- 聚糖上发生糖基聚乙二醇化（Stennicke，皿等人，Blood. 2013年3月14日；121 (11): 2108- 16)。
[0009] 例如，US2006040856设及经由完整的糖基连接基团连接的因子IX与聚乙二醇 (PEG)部分之间的缀合物，该糖基连接基团在肤与PEG部分之间插入并与该肤和PEG部分共 价连接。
[0010] W上提及的方法的共同特征是使用修饰的唾液酸底物，甘氨酷基唾液酸胞巧一憐 酸(GSC)和采用半衰期延长部分对GSC的化学酷化。
[001。 例如，可W使激活为硝基苯基-或N-径基-班巧酷亚胺醋的阳G聚合物酷化至化SC的 甘氨酷基氨基基团上，W产生可W酶促转移至糖蛋白的N-和0-聚糖上的PEG取代的唾液酸 底物(参见 W02006127896、W02007022512、US2006040856)。W类似的方式，可W使用N-?基- 班巧酷亚胺激活的醋化学法使脂肪酸酷化到GSC的甘氨酷基氨基基团上(W020m01277)。
[0012]然而，本发明人已发现先前公开的方法不适合于将高度官能化的半衰期延长部分 如碳水化合物聚合物附接至GSC。
[0013] 在本发明中，公开了半衰期延长聚合物肝素原与因子IX之间的新型缀合物，W及 该缀合物的用途和制备方法。
【发明内容】
[0014] 本文描述了新型肝素原-因子IX化EP-FIX)多肤缀合物及其制备。运些缀合物提供 了优于本领域已知的某些其他缀合物例如基于PEG的缀合物的生物学性质。
[0015] 本文描述的缀合物被肝素原化EP)形式的生物可降解的半衰期延长部分保护，该 部分延长因子IX(FIX)的体内半衰期。在一些实施方案中，本发明的皿P-FIX多肤缀合物具 有与未缀合的FIX多肤相比延长的循环半衰期;或与未缀合的FIX多肤相比延长的功能性半 衰期。
[0016] 在一些实施方案中，该肥P-FIX多肤缀合物具有与未缀合的FIX多肤相比增加的平 均停留时间;或与未缀合的FIX多肤相比增加的功能性平均停留时间。
[0017] 而且，在一些实施方案中，所述缀合物在aPTT试验中尤其显示了与类似的聚乙二 醇化FIX变体相比改善的性能。
[001引在一些实施方案中，聚合物形式的皿P具有小于1.10或小于1.05的多分散性指数 (Mw/Mn)0
[0019] 在一个实施方案中，所述聚合物可具有约13至约60kDa如38、41和44kDa的平均大 小。
[0020] 而且，可W使用具有改善的性质(例如，稳定性)的连接体产生本文描述的皿P-FIX 多肤缀合物。在一个运样的实施方案中，提供了皿P-FIX多肤缀合物，其中W获得稳定且无 异构体的缀合物的方式将皿P部分与FIX连接。在一个运样的实施方案中，使用包含与唾液 酸衍生物如甘氨酷基唾液酸胞巧一憐酸(GSC)连接的4-甲基苯甲酯基的化学连接体，将肥P 聚合物与FIX连接。
[0021] 本文描述的肥P-FIX多肤缀合物在凝血病的治疗、特别是B型血友病的预防性治疗 中尤其有用。
【附图说明】
[0022] 图1:甘氨酷基唾液酸胞巧一憐酸(GSC)采用苯甲醒基团的官能化。用4-甲酯基苯 甲酸使GSC酷化，随后通过还原胺化反应使GSC与肝素原化EP)-胺反应。
[0023] 图2:肝素原化EP)聚合物采用苯甲醒基团的官能化，及随后在还原胺化反应中与 甘氨酷基唾液酸胞巧一憐酸(GSC)的反应。
[0024] 图3:甘氨酷基唾液酸胞巧一憐酸(GSC)采用琉基的官能化，及随后与马来酷亚胺 官能化的肝素原化邸)聚合物的反应。
[0025] 图4:肝素原化EP)-甘氨酷基唾液酸胞巧一憐酸(GSC)。
[0026] 图5:经由4-甲基苯甲酯基亚连接（sublinkage)而缀合到因子IX上的双触角 (biantenna)N-聚糖（位置N157或N167)上的肝素原化EP)-甘氨酷基唾液酸胞巧一憐酸 (GSC)o
[0027] 图6:F9-K0小鼠中相对于时间的血浆FIX浓度。通过基于抗原的试验(a) W及分别 基于凝固活性和显色活性的试验(b)和（c)，随时间测量该浓度。向F9-K0小鼠静脉内给予 27nmol/kg(1.5mg FIX/kg)的BeneFIX"、i〇kDa PEG-[N]-FIX和60kDa HEP-[C]-FIX 化162C)。结果为半对数图中的平均值±SD，n = 3。
[002引图7: F9-K0小鼠中相对于时间的FIX血浆浓度。通过基于抗原的试验（图7a)和基于 显色活性的试验（图7b)测量该浓度。向小鼠静脉内给予27皿ol/kg(1.5mg FIX/kg)的与13 至60kDa皿P聚合物缀合的FIX。Τ'表示切S-缀合而"N"表示N-聚糖缀合。结果为半对数图 中的平均值±SD，n = 3。
[00巧]图8:60kDa皿P-[C]-FIX E162C和FIX剂量依赖性地且显著地减少了F9-K0小鼠在 尾静脉横切后的失血，它们具有相当的效力。F9-K0小鼠在诱导出血前lOmin给药。FIX-皿P 和FIX的抓50分别为0.012mg/kg和0.030mg/kg(p = 0.38)。*和***分别表示与接受载体的血 友病对照组相比在P<〇.〇5和p<0.001下的统计学显著性差异。数据为平均值±561。
[0030] 图9:60kDa肥P-[C]-Fix E162C(FIX-肥P)和rFIX剂量依赖性地且显著地缩短了 F9-K0小鼠在尾静脉横切后的出血时间，它们具有相当的效力。F9-K0小鼠在诱导出血前 lOmin 给药。FIX-肥巧日 FIX 的抓 50 分别为 0.009mg/kg 和 0.024111旨/1^(9 = 0.18)。*、**和***分 别表示与接受载体的血友病对照相比在P<0.05、p<0.01和p<0.001下的统计学显著性差 异。数据为平均值±561。
[0031] 图10:40W)a肥P-阳]-FIX和rFIX剂量依赖性地且显著地减少了F9-K0小鼠在尾静 脉横切后的失血，它们具有相当的效力。F9-K0小鼠
[0032] 在诱导出血前lOmin给药。40kDa皿P-[N]-FIX和rFIX的抓50分别为0.032mg/kg和 0.027111旨/1^(9 = 0.67)。*林和****分别表示与接受载体的血友病对照相比在9<0.001和口 <0.0001下的统计学显著性差异。数据为平均值±561。
[0033] 图11:在渗加的人FIX缺乏的血浆中的FIX活性相对于显色活性的恢复率。将Ξ种 浓度的化合物渗加到人FIX耗尽的血浆中，并使用Biophen Hypen显色试验和在一期凝固试 验(one-s化ge clotting assay)中使用五种指定的aPTT试剂进行分析。结果W凝固活性占 显色活性的百分比给出，并且为平均值+/-SD，n = 3。在所有试验中针对正常人血浆校准物 (ILS)测量活性。
[0034] 化合物：柱l-5:BeneF^IX';;柱6-10:27kDa肥P-[C]-FIX巧162C);柱ll-15:40kDa HEP-[C]-FIX化162C);柱16-20:40kDa 肥P-[N]-FIX;柱21-25:60kDa HEP-[C]-FIX 化162C);柱26-30:N9-GP)。
[0035] 基于aPTT的试验的类型：柱1、6、11、16、21、26iActinp'.S? (Siemens);柱2、7、12、 17、22、27:Syn化船il愈(ILS);柱3、8、13、18、23、28:SyrΓ出afaχK([LS);柱4、9、14、19、24、 29:APTT SP(ILS);柱5、10、15、20、25、30:STApTT?(S^go)。
[0036] 图12:该图显示了与等效剂量的rFIX相比，40W)a肥P-阳]-FIX的止血作用的显著 延长的持续时间。在F9-K0小鼠中运两种化合物在给药后均立即显著减少了由尾静脉横切 引起的失血，但在给药后72小时与载体组（P = 0.0028)和rFIX治疗组（P = 0.022)相比， 40kDa肥P-[N]-FIX的作用仍然是显著的。*、林和****分别表示在p<0.05、p<0.01和口< 0.0001下的统计学显著性差异。数据为平均值±561。
[0037] 图13:反应方案，其中在ST3GalIII唾液酸转移酶的存在下使去唾液酸FIX糖蛋白 与肥P-GSC反应。
[00；3引 序列简述
[0039] 沈Q ID NO: 1给出了人因子IX的氨基酸序列。
【具体实施方式】
[0040] 本发明设及新型肝素原-因子IX多肤化EP-FIX)缀合物及其制备。运些缀合物提供 了优于本领域已知的其他缀合物的生物学性质。
[0041] 因子IX(FIX)缺乏症，常被称为B型血友病，是影响全世界约120,000人的先天性出 血性病症，运120,000人中约有27,000人目前得到诊断并且少于10,000人接受照护。常规治 疗由替代疗法组成，其作为出血发作的预防或按需治疗而提供。当前对于患有重度B型血友 病的人的治疗通常是每周2-3次预防性注射BeneFIX'K (野生型rFix)。
[0042] 在患有凝血病的受试者中，诸如在患有A型和B型血友病的人中，凝血级联的各个 步骤由于例如凝血因子的缺乏或存在不足而成为功能障碍的。凝血级联的一部分的运种功 能障碍导致不充分的血液凝固W及潜在危及生命的出血或对内脏器官如关节的损伤。患有 B型血友病的个体可W接受凝血因子替代疗法，如外源FIX。然而，运样的患者具有生成针对 此类外源因子的中和抗体(所谓"抑制物"）的风险，从而使得先前有效的疗法变得无效。此 夕h外源凝血因子只可W静脉内施用，运对于患者是相当不便和不适的。例如，对于婴儿和 幼儿，可能必须将静脉内导管经手术插入胸部静脉，W确保静脉通路。运使他们处于很大的 发生细菌感染的风险中。因此，在血友病群体中，特别是在患有凝血病的受试者中，仍普遍 存在许多未得到满足的医疗需求。
[0043] 先天性低凝血病化ypocoagulopathies)包括B型血友病。所述B型血友病可W是重 度、中度或轻度的。血友病的临床严重性通过血液中FIX的功能单位的浓度来确定，并分类 为轻度、中度或重度。按照对应于小于正常水平的1%的<〇.〇lU/ml的凝血因子水平定义重 度血友病，而中度和轻度患者分别具有1-5%和>5%的水平。
[0044] FIX活性的先天性缺乏是X连锁的出血性病症即B型血友病的病因，该疾病影响到 100000个男性中的大约1个。目前通过采用重组的或血浆衍生的因子IX的替代疗法来治疗 运些B型血友病患者。
[0045] 具有"抑制物"（即针对FIX的同种抗体）的B型血友病是部分先天性且部分获得性 的凝血病的非限制性实例。
[0046] 获得性凝血病的一个非限制性实例是由维生素 K缺乏引起的丝氨酸蛋白酶缺乏 症;运样的维生素 K缺乏可能是由维生素时吉抗剂如华法林的施用引起的。获得性凝血病还 可能在大面积创伤之后发生。在运种也被称为"出血性恶性循坏'的情况下，其特征为血液 稀释(稀释性血小板减少症和凝血因子的稀释）、低体溫、凝血因子的消耗和代谢素乱(酸中 毒）。补液疗法和纤维蛋白溶解增加可能使运种情况恶化。所述出血可能来自身体的任何部 位。
[0047] 医源性凝血病的一个非限制性实例是可被开出用于治疗血栓栓塞性疾病的抗凝 血药物-如肝素、阿司匹林、华法林和其他血小板聚集抑制剂-的过量用药。医源性凝血病的 第二个非限制性实例是由过度和/或不适当的补液疗法诱发的医源性凝血病，诸如可能由 输血诱发的医源性凝血病。
[0048] 在本发明的一个实施方案中，出血与B型血友病相关。在另一个实施方案中，出血 与具有获得的抑制物的B型血友病相关。在另一个实施方案中，出血与血小板减少相关。在 另一个实施方案中，出血与冯?维勒布兰德(von Willebrand)病相关。在另一个实施方案 中，出血与重度组织损伤相关。在另一个实施方案中，出血与重度创伤相关。在另一个实施 方案中，出血与外科手术相关。在另一个实施方案中，出血与出血性胃炎和/或肠炎相关。在 另一个实施方案中，出血为血崩，诸如在胎盘早剥中。在另一个实施方案中，出血发生在机 械止血的可能性有限的器官中，诸如烦内、耳内或眼内。在另一个实施方案中，出血与抗凝 血疗法相关。
[0049] 因子 IX
[0050] FIX是与因子VII、凝血酶原、因子X和蛋白C具有结构相似性的维生素 K依赖性凝血 因子。循环酶原形式由分为四个不同结构域的415个氨基酸组成，运四个结构域包括N-末端 富含丫-簇基谷氨酸(Gla)的结构域、两个EGF结构域和C-末端膜蛋白酶样丝氨酸蛋白酶结 构域。"野生型Fir的一个例子是全长人FIX分子，如SEQ ID NO: 1所示。
[0051] FIX的激活通过在ArgMS-AlaM哺Argiw-Valisi处的限制性蛋白水解而发生，该蛋 白水解释放35-aa片段，即所谓的激活肤。该激活肤被高度糖基化，其含有两个N-连接的(在 位置N157和N167处)和若干个0-连接的聚糖。激活的因子IX被称为因子IX(a)或FIX(aKFIX (a)是通过在凝结过程中产生支持形成适当凝血酶所必需的大多数因子Xa作为tenase复合 物的一部分而在止血中发挥关键作用的膜蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。"FIX(ar包括可在个体 之间存在并发生的FlX(a)的天然等位基因变体。
[0052] 除非另有说明，FIX结构域包括W下氨基酸残基:Gla结构域，即残基Tyrl至残基 Lys43的区域;EGF1，即残基Gln44至残基Leu84的区域;EGF2,即残基Asp85至残基Argl45的 区域;激活肤，即残基Alal46至残基ArglSO的区域；W及蛋白酶结构域，即残基VallSl至 化r414的区域。轻链是指包含Gla结构域、EGF1和EGF2的区域，而重链是指蛋白酶结构域。W 下列出了野生型人凝血FIX的序列：
[005；3] YNSGKL 丫丫 FVQGNL 丫 R 丫 CM 丫丫 KCSF 丫丫 AR 丫 VF 丫 NT 丫 RTT 丫 FWKQYVDGDQCESNP化NGGSC邸DINSYECWCPFGFEGKNCE…VTCN化NGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRL AENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAEAVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPW QV化NGKVDAFCGGSIV肥KWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEET邸TEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIA LL 化肥 PLVLNSYVTPICIAD 邸 YTNI 化 KFGSGYVSGWGRVF 服 GRSAL 化 QYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNM FCAGF肥GG畑SCQGDSGGPHVTEVEGTS化TGIISWG邸CAMKGKYGIYTKVSRYVNWIK邸TKLT
[0054] 其中丫表示丫-簇基化的Glu( 'E'）。在完全丫-簇基化的FIX中，前12个Glu残基是 丫-簇基化的，但存在发生较少丫 -簇基化的变体(尤其在重组FIX的情况下）。在FIX中的位 置148处存在二态性，该位置可W是Ala或Τ'虹(参见McGraw等人（1985)PNAS，82:2847)。
[0055] 如本文所用的，"因子IX"或"FIX"是指人血浆FIX糖蛋白，它是凝血接触激活途径 (也称为内源性凝血途径）的成员并且对于血液凝固是必需的。除非另有说明或指示，FIX意 指在凝血中发挥其正常作用的任何功能性人FIX蛋白质分子。
[0056] 如本文所用的，术语"FIX类似物"意在表示具有SEQ ID N0:1的序列的FIX,不同之 处在于FIX的一个或多个氨基酸已被另一个氨基酸置换，和/或其中FIX的一个或多个氨基 酸已经缺失，和/或其中一个或多个氨基酸已经插入FIX中，和/或其中一个或多个氨基酸已 添加至FIX。运样的添加可在母体蛋白质的N-末端或C-末端或运两个末端处发生。该定义中 的"类似物"在其激活形式下仍具有FIX活性。在一个实施方案中，变体与SEQ ID NO: 1的序 列至少90%相同。在进一步的实施方案中，变体与SEQ ID NO: 1的序列至少95%相同。如本 文所用的，任何提及的具体位置均指SEQ ID N0:1中的相应位置。
[0057]如本文所用的，术语"因子IX多肤"或"FIX多肤"包括但不限于野生型人FIX和FIX (a) W及相对于野生型人FIX显示出基本相同或改善的生物活性的多肤。运些多肤包括但不 限于已化学修饰的FIX或FIXa，W及已引入特定氨基酸序列变化的FIX或FIXa类似物，该变 化改变了该多肤的生物活性，除非另有说明。还包括具有修饰的氨基酸序列的多肤，例如， 相对于人FIX具有修饰的N-末端(包括N-末端氨基酸缺失或添加）的多肤。还包括具有修饰 的氨基酸序列的多肤，例如，相对于人FIX具有修饰的C-末端(包括C-末端氨基酸缺失或添 加)的多肤。
[005引FIX多肤(包括与野生型FIX相比显示出基本相同或更好的生物活性的FIX的类似 物、变体和衍生物)包括但不限于具有与野生型FIX的序列相差一个或多个氨基酸的添加、 插入、缺失或置换的氨基酸序列的多肤。
[0059] 本发明绝不限于本文所述的序列。FIX类似物例如在US5521070(其中在第一位的 酪氨酸被丙氨酸替代及W02007/135182(其中FIX中的一个或多个天然氨基酸残基被半 脫氨酸残基置换）中公开。所述参考文献通过引用W其全文并入于此。因此，FIX的类似物和 变体是本领域公知的，并且本公开内容涵盖那些已知的或未来将会开发或发现的类似物或 变体。
[0060] FIX或FlX(a)可W使用公知的生产和纯化方法从血浆衍生或重组产生。糖基化、 丫-簇基化和其他翻译后修饰的程度和位置可W根据所选的宿主细胞及其生长条件而不 同。
[0061 ]用于产生重组蛋白的宿主细胞优选为哺乳动物来源的，W便确保分子在折叠和翻 译后修饰例如0-和N-糖基化和硫酸化过程中适当地被加工。合适的宿主细胞包括但不限于 中国仓鼠卵巢(CH0)、幼仓鼠肾(BHK)和HEK29始田胞系。
[0062] 在一些实施方案中，使用例如包含与肥P缀合的FIX多肤的制剂形式的药物组合物 治疗患有凝血病的受试者，所述凝血病例如是B型血友病。
[0063] 在一些实施方案中，提供了包含皿P-FIX缀合物的组合物和制剂。特定的实施方案 包括包含与药学上可接受的载体配制在一起的本文所述肥P-FIX缀合物的药物组合物。
[0064] 凝血因子如因子IX的治疗用途的主要限制是成本，特别是由于运些蛋白质的有效 剂量很高。常见剂量为250此蛋白质/kg体重。
[0065] 提供具有成本效益的糖肤治疗剂的问题的一个解决方案是提供具有较长体内半 衰期的肤。例如，已通过将合成聚合物附接至肤骨架上产生了具有改善的药代动力学性质 的糖肤治疗剂。与肤缀合的一种示例性聚合物为聚乙二醇(PEG)。
[0066] 当前采用FIX对B型血友病的治疗通常包括每周约两次注射，并根据需要补充注 射，例如在拔牙或外科手术之前。FIX作为无活性的酶原而循环，并且仅在要阻止出血时才 转化成活性形式的因子IX(a)。因此，基于例如每周一次注射实现预防性FIX治疗的一种方 式是增加 FIX在患者血流中的循环时间。W运种方式，将总是存在一定水平的有待激活的酶 原FIX, W确保在患者中任何时间都有正常的血液凝固条件。
[0067]半衰期延长部分，或者被称为侧链或侧基，可W包括生物相容的脂肪酸及其衍生 物W及亲水聚合物如径乙基淀粉、PEG、透明质酸和皿P聚合物。多年来，聚乙二醇化已成为 用于产生长效药物的优选半衰期延长技术之一，并且若干种PEG-蛋白质缀合物现已上市销 售。PEG聚合物具有降低与其结合的蛋白质药物的活性的倾向。运通常导致在溶液中较低的 药物-受体亲和力或较低的与相应药物结合配偶体的结合亲和力。在大多数情况下，活性的 降低与附接至蛋白质药物的阳G大小或阳G基团的数目相关。因此，大阳G基团的附接导致比 小PEG基团的附接高得多的活性损失。
[006引除了PEG大小和PEG数目的活性调节作用之外，最近已证明了阳G强烈干扰在止血 中使用的标准试验。例如，在一期凝固试验中测得的糖基聚乙二醇化FVIII的比活性根据所 用的aPTT试剂而不同（Stennicke，Blood 2013; 121(11) :2108-16)。
[0069] aPTT-期FIX凝固试验的应用是用于在治疗起始过程中对剂量和给药方案的单独 优化和用于常规监测FIX预防的标准程序。通常，aPTT试验在中屯、实验室进行，在该实验室 中通过添加 aPTT试剂和重新巧化启动从患者获得的血液的凝固，之后在血凝分析仪上测量 到纤维蛋白凝块形成的时间。有很多该试验的商购可得形式。
[0070] 干扰PEG性能的试验可能在临床前开发中具有显著影响，并且在临床应用中尤为 如此，其中需要在多组分一期凝固试验中精确测量患者的凝血因子。
[0071] 肝素原
[0072] 肝素原化EP)是包含(-GlcUA-l，4-GlcNAc-l，4-)重复单元的天然糖聚合物。它属 于糖胺聚糖多糖家族，并且在生理pH下为带负电荷的聚合物。HEP可见于某些细菌的芙膜 中，但它还见于更高等的脊椎动物中，在脊椎动物中它充当天然聚合物肝素和硫酸乙酷肝 素的前体。HEP可被溶酶体酶如N-乙酷基-a-D-氨基葡糖巧酶(NA化U)和β-葡萄糖醒酸酶 (GUSB)降解。一些实施方案提供了式(-GlcUA-f31，4-GlcNAc-al，4-)n的肝素原聚合物。皿Ρ 聚合物的大小可由重复单元的数目η来定义。所述重复单元的数目η可W是例如2至约5， 000。重复单元的数目可W是例如50至2，000个单元，诸如105个单元、100至1，000个单元、5 至450个或200至700个单元。重复单元的数目可W是200至250个单元、500至550个单元或 350至400个单元。运些范围的任何下限均可W与运些范围的任何较高的上限组合，W形成 肥Ρ聚合物中单元数目的合适范围。
[0073] 肥Ρ聚合物的大小还可W由其分子量来定义。该分子量可W是一群肥Ρ聚合物分子 的平均分子量，如重均分子量。
[0074] 在实践中，如本文就皿Ρ聚合物大小所述的分子量值可能并非恰好是所列出的大 小。由于在皿Ρ聚合物生产过程中批次间的差异，因此一些变化是可W预期的。因此应当理 解，为了包含批次间的差异，可W预期在目标肥Ρ聚合物大小左右约+/-1〇%、9%、8%、7%、 6%、5%、4%、3%、2%或1 %的变化。例如，40kDa的肥Ρ聚合物大小表示40kDa+/-10%，例如 4〇kDa实际上可W例如意指38.8kDa或41.5kDa，均落在40kDa的+/-10%范围36至44kDa之 内。
[00巧]在一些实施方案中，该皿P聚合物具有500Da至1，000kDa的分子量。在其他实施方 案中，该聚合物的分子量为500Da至650kDa、5至750kDa、10至500kDa、15至550kDa、25至 250kDa或50至175kDa。
[0076]在一些实施方案中，选择在前述范围内的特定水平的分子量，W便实现在FIX多肤 的活性与缀合物的半衰期之间的适当的平衡。例如，该皿P聚合物的分子量可W在选自5至 15403、15至251^)3、25至351^)3、35至451^)3、45至551^)3、55至651^)3、65至751^)3、75至851^)曰、 85至95kDa、95至105kDa、105至115kDa、115至125kDa、125至135kDa、135至145kDa、145至 15化化、155至16化化或165至17化化的范围内。在其他实施方案中，分子量可W是500Da至 21kDa，诸如IkDa至15kDa，诸如5至15kDa，诸如8至17kDa，诸如10至14kDa，诸如约12kDa。分 子量可W是20至35kDa，诸如22至32kDa，诸如25至30kDa，诸如约27kDa。分子量可W是35至 65kDa，诸如40至60kDa，诸如47至57kDa，诸如50至55kDa，诸如约52kDa。分子量可W是50至 75kDa，诸如60至70kDa，诸如63至67kDa，诸如约65kDa。分子量可W是75至125kDa，诸如90至 120kDa，诸如95至llSkDa，诸如100至11240日，诸女日106至llOkDa，诸如约lOSkDa。分子量可W 是125至17化Da,诸如140至165kDa，诸如150至16化Da,诸如155至leOkDa，诸如约157kDa。分 子量可W是5至lOOkDa，诸如13至60kDaW及诸如27至40kDa。
[0077] 在一些实施方案中，与FIX多肤缀合的肥P聚合物具有在选自13至65kDa、13至 60kDa、13至55kDa、13至50kDa、13至49kDa、13至48kDa、13至47kDa、13至46kDa、13至45kDa、 13至44kDa、13至43kDa、13至42kDa、13至41kDa、13至40kDa、13至39kDa、13至38kDa、13至 37kDa、13至36kDa、13至35kDa、13至：MkDa、13至33kDa、13至32kDa、13至31kDa、13至30kDa、 13至29kDa、13至28kDa、13至27kDa、13至26kDa、13至25kDa、13至21kDa、25至55kDa、25至 50kDa、25至45kDa、27至40kDa、27至41kDa、27至42kDa、27至43kDa、27至43kDa、27至44kDa、 27 至 45kDa、27 至 60kDa、30 至 45kDa、36 至 44kDaW 及 38 至 42kDa 的范围内的大小。
[007引运些分子量范围的任何下限可W与运些范围的任何较高的上限组合，W形成如本 文所述的HEP聚合物的分子量的合适范围。
[0079] 关于如本文所述的FIX多肤缀合物，在侧链中使用肥P提供了一种延长体内循环半 衰期的非常灵活的方式，因为肥P大小的范围导致了显著改善的半衰期。
[0080] 肥P聚合物在高质量浓度下变为高度粘稠的。
[0081] 皿P聚合物可具有窄的大小分布（即单分散)或宽的大小分布（即多分散）。可根据 式Mw/Mn W数字表示多分散性的水平，其中Mw =重均分子量且Μη =数均分子量。对于理想的 单分散聚合物，使用该等式获得的多分散性值为1。优选地，皿Ρ聚合物是单分散的。因此该 聚合物可具有约为1的多分散性，多分散性可W小于1.25,优选小于1.20,优选小于1.15,优 选小于1.10,优选小于1.09,优选小于1.08,优选小于1.07,优选小于1.06,优选小于1.05。 可通过与可W在琼脂糖凝胶上运行的单分散大小标准品化A L〇-Ladde;r，Hyalose化C)进 行比较来测量HEP的分子量大小分布。
[0082] 或者，可通过高效大小排阻色谱法-多角度激光散射(SEC-MA化S)确定皿P聚合物 的大小分布。可W使用运样的方法来评估肥P聚合物的分子量和多分散性。可W在酶促生产 方法中调节聚合物大小。通过控制肥P受体链与UDP糖的摩尔比，可W选择所需的最终肥P聚 合物大小。
[0083] 可通过同步的酶聚合反应制备肥P聚合物化S20100036001)。该方法使用来自多杀 己斯德氏菌(Pasturella multocida)的乙酷肝素合成酶I(PmHSl)，该酶可W在大肠杆菌 化.coin中表达为麦芽糖结合蛋白融合构建体。当将纯化的MBP斗mHSl添加至糖核巧酸 (G1 cNAc-UDP和G1 cUA-UDP)的等摩尔混合物中时，该MBP-PmHS 1能够在同步的、化学计量控 制的反应中产生单分散聚合物。可使用Ξ糖引发剂(GlcUA-GlcNAc-GlcUA)引发反应，聚合 物长度取决于引物:糖核巧酸之比。通常，聚合反应运行至消耗掉约90 %的糖核巧酸。通过 阴离子交换色谱法将聚合物从反应混合物中分离出来，随后冷冻干燥为稳定的粉末。
[0084] 制备肥P-FIX缀合物的方法
[0085] 在一些实施方案中，如本文所述的FIX多肤与如本文所述的皿P聚合物缀合。如本 文所述的任何FIX多肤可W与如本文所述的任何肥P聚合物组合。
[0086] 用于将半衰期延长部分如碳水化合物聚合物连接至糖蛋白的常用方法包括朽、腺 或酷阱键的形成。W02006094810描述了用于将径乙基淀粉聚合物附接至糖蛋白如红细胞生 成素的方法，该方法避免了与使用活化醋化学法相关的问题。在运些方法中，在碳水化合物 部分上用高舰酸盐单独地氧化径乙基淀粉和红细胞生成素，并使用双径胺连接剂将反应性 幾基连接在一起。该方法将产生经由朽键与红细胞生成素连接的径乙基淀粉。
[0087] 对于将碳水化合物聚合物附接至GSC，可W想到类似的基于目亏的连接方法（参见 W02011101267)，然而，由于已知运样的目亏键W顺式和反式异构体两种形式存在，因此聚合 物与蛋白质之间的连接将含有顺式和反式异构体组合。运样的异构体混合物在用于长期重 复施用的蛋白质药物中通常是不希望的，因为连接体不均一性可能导致生成抗体的风险。
[0088] W上提到的方法具有进一步的缺点。在激活糖蛋白所需的氧化过程中，一部分碳 水化合物残基被化学裂解，因此碳水化合物将不会W完整形式存在于最终的缀合物中。此 夕h该氧化过程将产生产物异质性，因为在大多数情况下氧化剂即高舰酸盐对于氧化哪一 个聚糖残基是非特异性的。在最终的药物缀合物中产物异质性和不完整聚糖残基的存在均 可能造成免疫原性风险。
[0089] 用于将碳水化合物聚合物连接至糖蛋白的替代方案包括使用马来酷亚胺化学法 (W02006094810)。例如，可W向碳水化合物聚合物提供马来酷亚胺基，该基团可W选择性地 与祀蛋白上的琉基反应。该连接随后将含有环状班巧酷亚胺基团。
[0090] 可W将碳水化合物聚合物如肥P经由马来酷亚胺基连接至硫修饰的GSC分子，并借 助于唾液酸转移酶将该试剂转移至糖蛋白上的完整糖基基团，从而产生含有环状班巧酷亚 胺基团的连接。然而，当缀合物在水溶液中储存延长的时间段时，基于班巧酷亚胺的连接可 能经历水解开环（Bioconjugation Techniques，G.T.Hermanson，Academic Press，第3版， 2013p. 309)，并且尽管该连接可能仍然完整，但开环反应将在最终的缀合物中增加区域异 构体(regi0 isomerS)和立体异构体形式的不期望的异质性。
[0091] 由上文可知，优选将半衰期延长部分W运样的方式连接至糖蛋白：1) W完整形式 保留糖蛋白的聚糖残基，和2)在完整糖基残基与半衰期延长部分之间的连接体部分中不存 在异质性。
[0092] 本领域中需要将半衰期延长部分如肥P与蛋白质聚糖如FIX多肤聚糖缀合的方法， 其中连接运些化合物W便获得稳定且无异构体的缀合物。
[0093] 在一些实施方案中，提供稳定且无异构体的连接体W供在肥P与FIX的基于唾液酸 的缀合中使用，其中可将HEP聚合物附接至唾液酸的适合于衍生化的位置处。合适的位点是 技术人员已知的，或者可W从W003031464(其通过引用W其全文并入于此）中推断出，其中 W多种方式将PEG聚合物附接至唾液酸胞巧一憐酸。
[0094] 在一些实施方案中，唾液酸化喃糖环的C4和巧位置W及侧链的C7、C8和C9位置可 W充当衍生化位点。衍生化优选设及唾液酸的现有杂原子如径基或胺基团，但用于在唾液 酸上提供合适的附接点的官能团转化也是可能的。
[00M]在一些实施方案中，可通过本领域已知的方法将唾液酸N-乙酷基神经氨酸的9-径 基转化为氨基巧ur J Biochem 168,594-602(1987))。如下所示的所得9-脱氧-氨基N-乙酷 基神经氨酸胞巧一憐酸是可W充当GSC的替代物的激活的唾液酸衍生物。
[0096]
[0097] 在一些实施方案中，还可W按照相同的方案将不含胺的唾液酸如2-酬基-3-脱氧- 壬酬糖酸（2-ket〇-3-deoxy-nonic acid)(也称为邸N)转化为9-氨基衍生化的唾液酸。
[009引
[0099] 类似的方案可用于属于唾液酸家族的更短的C8-糖类似物。因此，唾液酸的更短形 式如2-酬基-3-脱氧辛酬糖酸（2-ket〇-3-deoxyoctonate)(也称为邸0)可转化为8-脱氧-8- 氨基-2-酬基-3-脱氧辛酬糖酸胞巧一憐酸，并用作不缺乏C9碳原子的唾液酸的替代物。
[0100] 在一些实施方案中，在本发明中可W使用神经氨酸胞巧一憐酸。可如Eur J化g Chem. 2000,1467-1482中所述制备该材料。 h
[0101]
[0102] 在一些实施方案中，提供了在皿P与FIX的基于甘氨酷基唾液酸胞巧一憐酸(GSC) 的缀合中使用的稳定且无异构体的连接体。本发明中使用的GSC起始材料可W化学合成 (Dufner，G.Eur.J 0巧 Chem 2000,1467-1482)，或者可W通过如W02007056191 中所述的化 学酶途径获得。W下示出了 GSC结构：
[0103]
[0104] 在一些实施方案中，本文描述的缀合物包含连接体，该连接体包含W下结构：
[0105]
[0106] 该连接体在下文中还称为亚连接体或亚连接，其W下列方式之一将皿P-胺与GSC 连接：
[0107]
[0108] 因此，突出显示的4-甲基苯甲酯基亚连接体构成了连接半衰期延长部分与祀蛋白 的完整连接结构的一部分。该亚连接体与替代物如基于班巧酷亚胺的连接体（由马来酷亚 胺与琉基的反应制备）相比本身是稳定的结构，因为当缀合物在水溶液中储存延长的时间 段时，后一种类型的环状连接具有经历水解开环的倾向（Bioconjugation Techniques， G. Τ. Hermanson，Academic Press，第3版2013p. 309)。即使在运种情况下连接(例如在肥P与 糖蛋白上的唾液酸之间）仍可能保持完整，但开环反应将向最终的缀合物组合物中增加区 域异构体和立体异构体形式的异质性。
[0109] 因此，与根据本发明的缀合物相关的一个优势是得到了同质组合物，即由连接体 结构和稳定性引起的异构体形成的趋势显著降低。另一个优势是根据本发明的连接体和缀 合物可W在简单的过程、优选一步过程中产生。
[0110] 异构体是不希望的，因为运些异构体可能导致异质产物并增加人体中不需要的免 疫应答的风险。
[0川]如在本文描述的方法中所用的，在肥P与GSC之间使用的4-甲基苯甲酯基亚连接不 能形成立体异构体或区域异构体。在一个非限制性实施方案中，图5显示了使用本发明的4- 甲基苯甲酯基亚连接缀合到因子IX上的双触角N-聚糖(位置N157或N167)上的肥P。
[0112] US20100036001中描述了功能性皿P聚合物的制备方法，其列出了例如醒、胺和马 来酷亚胺官能化的皿P试剂。US20100036001通过引用W其全文并入于此，如同在本文中充 分阐述。使用类似的化学法可得到一系列其他功能修饰的皿P衍生物。根据US20100036001 中描述的方法，最初产生了在本发明的某些实施方案中使用的肥P聚合物，其在还原末端处 具有伯胺柄。例如，可W如Sism巧-Ragatz等人，2007 J Biol Chem和US8088604所述制备具 有伯胺柄的肥P聚合物化EP-N也）。简而言之，使用大肠杆菌麦芽糖结合蛋白与Pm服1的融合 体作为催化剂，W采用UDP-GlcNAc和UDP-GlcUA前体将在还原末端处具有游离胺的肝素原 寡糖受体延长为更长的链。该受体使反应同步发生，因此所有链均具有相同的长度(准单分 散大小分布），并且它还赋予糖链游离胺基团w进行随后的修饰或偶合反应。
[0113] 可通过与N-班巧酷亚胺基4-甲酯基苯甲酸醋的反应将根据US20100036001制备的 胺官能化的皿P聚合物（即具有胺柄的皿P)转化为皿P-苯甲醒，随后通过还原胺化反应与 GSC的甘氨酷基氨基基团偶合。随后可使用唾液酸转移酶将所得的肥P-GSC产物与糖蛋白酶 促缀合。
[0114] 例如，可根据W下方案通过与N-班巧酷亚胺基4-甲酯基苯甲酸醋反应将皿P上的 所述胺柄转化为苯甲醒官能团：
[0115]
[0116] 在W上方案中肥P胺（υ到4-甲酯基苯甲酯胺化合物(2)的转化可W通过与4-甲酯 基苯甲酸的酷基激活形式反应来进行。
[0117] 可W选择N-径基班巧酷亚胺基作为酷基激活基团，但许多其他的酷基激活基团是 技术人员已知的。非限制性实例包括由肤化学所知的1-径基-7-氮杂苯并Ξ挫-醋、1-径基- 苯并Ξ挫-醋、五氣苯基-醋。
[0118] 当W干燥形式冷冻(-80°C)储存时，经苯甲醒官能团修饰的肥Ρ试剂可W在延长的 时间段内保持稳定。
[0119] 或者，可将苯甲醒部分附接至GSC化合物，从而产生适合与胺官能化的皿P部分缀 合的GSC-苯甲醒化合物。图1中示出了该合成路线。
[0120] 例如，GSC可与N-班巧酷亚胺基4-甲酯基苯甲酸醋在中性抑条件下反应，W得到含 有反应性醒基团的GSC化合物。随后可使醒衍生化的GSC化合物(GSC-苯甲醒)与肥P-胺和还 原剂反应，W形成肥P-GSC试剂。
[0121] W上提到的反应可W颠倒，使得皿P-胺首先与N-班巧酷亚胺基4-甲酯基苯甲酸醋 反应，W形成醒衍生化的皿P-聚合物，随后该皿P-聚合物在还原剂的存在下直接与GSC反 应。在实践中，运消除了GSC-C册的冗长的色谱处理。图2中示出了该合成路线。
[0122] 因此，在一些实施方案中，肥P-苯甲醒通过还原胺化与GSC偶合。
[0123] 还原胺化是如下进行的两步反应:首先，在醒组分与胺组分（在本实施方案中为 GSC的甘氨酷基氨基基团）之间形成亚胺(也称为希夫碱）。随后在第二步中将该亚胺还原成 胺。选择还原剂使得它选择性地将形成的亚胺还原成胺衍生物。
[0124] 技术人员可利用多种合适的还原剂。非限制性实例包括氯基棚氨化钢(化B曲CN)、 棚氨化钢(NaBH4)、化晚棚烧复合物(B出:Py)、二甲基硫酸棚烧复合物(MesS: B出)和甲基化晚 棚烧复合物。
[0125] 尽管到碳水化合物的还原端(例如皿P聚合物的还原末端）的还原胺化是可能的， 但它通常被描述为缓慢且低效的反应(JC. Gi Idersleeve，Biocon jug Chem. 2008年7月；19 (7) :1485-1490)。诸如Amadori反应(其中最初形成的亚胺重排为酬胺）的副反应也可能发 生，并将导致如先前所述在本情况下不期望的异质性。
[0126] 芳香醒如苯甲醒衍生物不能形成运样的重排反应，因为亚胺无法締醇化并且也缺 乏通常在碳水化合物衍生的亚胺中发现的所需的相邻径基。因此，芳香醒如苯甲醒衍生物 在用于生成无异构体的肥P-GS村式剂的还原胺化反应中是特别有用的。
[0127] 任选地使用过量的GSC和还原剂，W推动还原胺化化学反应快速地完成。当反应完 成时，过量(未反应)的GS村式剂和其他小分子组分如过量的还原剂随后可通过透析、正切流 动过滤或大小排阻色谱法来去除。
[01%]唾液酸转移酶的天然底物Sia-CMPW及GSC的衍生物均为带电荷且高度亲水的多 功能分子。此外，它们在延长的时间段内在溶液中是不稳定的，尤其在抑低于6.0时。在运样 的低pH下，由于酸催化的憐酸二醋水解而失去底物转移所必需的CMP激活基团（Yasuhiro Kajihara等人，化em Eur J 2011，17,7645-7655)。因此，65巧日51曰-〔1?衍生物的选择性修 饰和分离需要小屯、控制抑，W及快速且有效的分离方法，W避免CMP水解。
[0129] 在一些实施方案中，使用还原胺化化学法将大的半衰期延长部分与GSC缀合。已发 现芳醒如苯甲醒修饰的皿P聚合物对于运种类型的修饰是最优的，因为它们可W在还原胺 化条件下与GSC高效地反应。
[0130] 由于GSC在酸性介质中可能经历水解，因此在与肥P-苯甲醒偶合的过程中维持接 近中性或微碱性环境至关重要。皿P聚合物和GSC均是高度水溶性的，因此优选水性缓冲液 系统用于使pH维持在接近中性水平。可W使用多种有机和无机缓冲液;然而，缓冲液组分应 当优选在还原胺化条件下不具有反应性。运排除了例如含有伯氨基和一一在较小程度 上一一仲氨基的有机缓冲液系统。由本说明书可知，技术人员将会了解哪些缓冲液合适而 哪些不合适。W下表1显示了合适的缓冲液的一些实例：
[0131] 表1-缓冲液
[0132]
[0133] 通过应用该方法，具有无异构体的稳定连接的经半衰期延长部分如皿P修饰的GSC 试剂可W得到高效制备，并在使CMP激活基团水解的可能性最小化的简单过程中进行分离。
[0134] 通过使所述化合物彼此反应，可W产生包含4-甲基苯甲酯基亚连接体部分的肥P- GSC缀合物。
[0135] GSC还可W与硫代下内醋反应，从而产生琉基修饰的GSC分子(GSC-SH)。运样的试 剂可W与马来酷亚胺官能化的皿P聚合物反应W形成皿P-GS村式剂。图3中示出了该合成路 线。所得产物具有包含班巧酷亚胺的连接结构。
[0136]
[0137] 然而，基于班巧酷亚胺的（亚)连接可能经历水解开环，尤其当修饰的GS村式剂在水 溶液中储存延长的时间段时，并且尽管该连接可能仍然完整，但开环反应将增加区域异构 体和立体异构体形式的不期望的异质性。
[0138] 糖缀合方法
[0139] 可经由多肤骨架中的残基上存在的聚糖进行皿P-GSC缀合物与多肤的缀合。运种 形式的缀合还被称为糖缀合。
[0140] 与基于半脫氨酸烷基化、赖氨酸酷基化和设及蛋白质骨架中氨基酸的类似缀合的 缀合方法相反，经由聚糖的缀合是一种有吸引力的方法，它将较大结构如皿P聚合物附接至 生物活性蛋白质上，而对生物活性的干扰较小。运是因为高度亲水的聚糖通常倾向于远离 蛋白质表面并在溶液中向外定向，使对于蛋白质活性至关重要的结合表面处于游离状态。
[0141] 所述聚糖可W是天然存在的，或者可使用本领域公知的方法经由例如N-连接的聚 糖的插入而插入。
[0142] 肥P聚合物的糖缀合方法包括基于半乳糖氧化酶的缀合(W02005014035)和基于高 舰酸盐的缀合(W02008025856)。多年来已经证明基于唾液酸转移酶的方法对于修饰凝血因 子如FIX上的N-聚糖或0-聚糖是溫和且高度选择性的。
[0143] GSC是通过使用唾液酸转移酶可转移至糖蛋白的唾液酸衍生物。可W在甘氨酷基 氨基基团上用诸如PEG或皿P的取代基选择性地修饰GSC，并仍然通过使用唾液酸转移酶将 65(：酶促转移至糖蛋白。可^通过酶法大规模地高效制备65(：(￥02007056191)。
[0144] 在一些实施方案中，通过唾液酸酶处理去除FIX聚糖上的末端唾液酸，W得到去唾 液酸FIX(asialoFIX)。去唾液酸FIX和经肥P修饰的GSC将一起充当唾液酸转移酶的底物。唾 液酸转移酶反应的产物是具有经由聚糖上的完整糖基连接基团连接的皿P的皿P-FIX缀合 物。
[0145] 唾液酸转移酶
[0146] 唾液酸转移酶是一类糖基转移酶，它将唾液酸从天然激活的唾液酸(Sia) -CMP (胞 巧一憐酸）化合物转移至例如蛋白质上的半乳糖基部分。许多唾液酸转移酶（ST3GalIII、 ST3GalI、ST6GalNAcI)能够转移已在巧乙酷氨基基团上尤其经大基团如40kDa阳G修饰的 唾液酸-CMP(Sia-CMP)衍生物(W003031464)dW02006094810中公开了本发明可W使用的相 关唾液酸转移酶的广泛但非限制性的列表，该文献通过引用W其全文并入于此。
[0147] 在一些实施方案中，通过唾液酸酶处理去除糖蛋白上的末端唾液酸，W得到去唾 液酸糖蛋白。去唾液酸糖蛋白和经半衰期延长部分修饰的GSC将一起充当唾液酸转移酶的 底物。该反应的产物是具有经由完整糖基连接基团-在该情况下为完整的唾液酸连接体基 团-连接的半衰期延长部分的糖蛋白缀合物。图13中显示了在唾液酸转移酶的存在下去唾 液酸FIX糖蛋白与肥P-GSC反应的反应方案。
[0148] 肥P-FIX缀合物的性质
[0149] 在一些实施方案中，本文描述的缀合物具有各种有利的生物学性质。例如，与合适 的对照FIX分子相比，该缀合物可显示W下(非限制性)优势中的一个或多个：
[0150] -改善的体内循环半衰期
[0151] -改善的体内平均停留时间
[0152] -改善的体内生物可降解性
[0153] -在FIX敲除小鼠的尾静脉横切(TVT)模型中改善的出血时间和失血
[0154] -在各种基于aPTT的试验中改善的试验间变异性。
[0155] 所述缀合物可显示如本文所述的FIX的任何生物活性的改善，并且运可使用如本 文所述的任何试验或方法如W下关于FIX活性描述的方法来测量。
[0156] 当本发明的缀合物与合适的对照FIX分子相比时可看出优势。对照分子可W是例 如未缀合的FIX多肤或缀合的FIX多肤。缀合的对照可W是与水溶性聚合物缀合的FIXa多肤 或与蛋白质化学连接的FIXa多肤。缀合的FIX对照可W是一种FIX多肤，它与大小与感兴趣 的缀合物中的皿P分子类似的化学部分(是蛋白质或水溶性聚合物)缀合。该水溶性聚合物 可W是例如PEG、支链PEG、葡聚糖、聚（1-径甲基乙締径甲基缩甲醒)或2-甲基丙締酷氧基- 2^-乙基Ξ甲基憐酸锭(MPC)。
[0157] 对照FIX分子中的FIX多肤优选为存在于感兴趣的缀合物中的相同FIX多肤。例如， 对照FIX分子可具有与感兴趣的缀合物中的FIX多肤相同的氨基酸序列。对照FIX可具有与 感兴趣的缀合物中的FIX多肤相同的糖基化模式。
[0158] 在一些实施方案中，与合适的对照相比，如本文所述的缀合物具有改善的循环半 衰期或平均停留时间。
[0159] 在一些实施方案中，如本文所述的缀合物具有与野生型蛋白质分子相比改变的循 环半衰期，优选延长的循环半衰期。循环半衰期优选延长至少10%，优选至少15%，优选至 少20 %，优选至少25%，优选至少30%，优选至少35%，优选至少40%，优选至少45%，优选 至少50%，优选至少55%，优选至少60%，优选至少65%，优选至少70%，优选至少75%，优 选至少80%，优选至少85 %，优选至少90 %，优选至少95 %，优选至少100%，更优选至少 125%，更优选至少150%，更优选至少175 %，更优选至少200%，最优选至少250 %或300 %。 甚至更优选地，运样的分子具有延长至少400 %、500 %、600 %或甚至700 %的循环半衰期。
[0160] 当比较的活性是FIX的生物活性如凝固活性或蛋白水解时，对照可W是缀合至大 小与本发明肥P缀合物相当的水溶性聚合物上的合适的FIX多肤。
[0161] 所述缀合物可能无法保持在没有通过添加皿P而修饰的FIX中所见的生物活性水 平。优选地，该缀合物保持未缀合的FIX的尽可能多的生物活性。例如，该缀合物可保持未缀 合的FIX对照的至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、 至少50%、至少60 %、至少70%、至少80 %或至少90 %的生物活性。如上所述，该对照可W是 具有与缀合物中的FIX多肤相同的氨基酸序列但缺乏皿P的FIX分子。然而，与合适的对照相 比，该缀合物可显示生物活性的改善。本文的生物活性可W是如本文所述的FIX的任何生物 活性，如凝固活性或蛋白质水解活性。
[0162] 与本文所述的合适对照相比改善的生物活性可W是任何可测量的或统计学显著 的生物活性增加。该生物活性可W是如本文所述的FIX的任何生物活性，如凝固活性、蛋白 水解活性、出血时间和失血的减少。例如，所述增加可W是与合适的对照的相同活性相比， 相关生物活性的至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30 %、至少35%、 至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少70%或更多的增加。
[0163] 如本文所述的缀合物的优势在于肥P聚合物是可酶促生物降解的。因此，该缀合物 优选为可体内酶促降解的。
[0164] 在一些实施方案中，当使用不同的基于aPTT的凝固试验时，包含与FIX连接的皿P 聚合物的缀合物减少或不引起显著的试验间变异性。
[01化]组合物
[0166] 在另一个方面，本发明提供了包含如本文所述的缀合物的组合物。在一些实施方 案中，该药物组合物包含与药学上可接受的载体配制在一起的一种或多种缀合物。
[0167] 如本文所用的，"药学上可接受的载体"包括任何和全部生理学上相容的溶剂、分 散介质、涂料、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。
[0168] 优选的药学上可接受的载体包括水性载体或稀释剂。可在本发明的药物组合物中 使用的合适的水性载体的实例包括水、缓冲水和盐水。其他载体的实例包括乙醇、多元醇 (诸如甘油、丙二醇、PEG等)及其合适的混合物，植物油如橄揽油，W及可注射的有机醋如油 酸乙醋。例如，通过使用涂层材料如卵憐脂，通过在分散体的情况下维持所需的颗粒大小， W及通过使用表面活性剂，可W维持适当的流动性。在许多情况下，将优选在组合物中包含 等渗剂，例如糖，多元醇如甘露醇、山梨糖醇，或氯化钢。
[0169] 所述药物组合物主要旨在用于预防性和/或治疗性处理的肠胃外施用。优选地，该 药物组合物肠胃外即静脉内、皮下或肌内施用，或者它可W通过连续或脉冲式输注而施用。 用于肠胃外施用的组合物包含与药学上可接受的载体、优选水性载体组合(优选溶解在该 载体中）的本发明FIX缀合物。可W使用多种水性载体，如水、缓冲水、ο . 9 %盐水、ο . 4 %盐 水、0.3%甘氨酸等。还可将如本文所述的FIX缀合物配制成脂质体制剂，W递送至或祀向至 损伤部位。例如，在US4837028、US4501728和US4975282中概括地描述了脂质体制剂。所述组 合物可通过常规的公知灭菌技术进行灭菌。所得的水溶液可进行包装W供使用或在无菌条 件下过滤并冻干，在施用前将冻干的制剂与无菌水溶液合并。所述组合物可含有接近生理 条件所需的药学上可接受的辅助性物质，如pH调节剂和缓冲剂、张度调节剂等，例如乙酸 钢、乳酸钢、氯化钢、氯化钟、氯化巧等。
[0170] 运些制剂中的FIX缀合物的浓度可广泛地变化，即，从小于约0.5重量％，通常等于 或至少约1重量％，至高达15重量％或20重量％，并且将根据选择的特定施用方式主要按照 流体体积、粘度等来选择。用于制备可肠胃外施用的组合物的实际方法对于本领域技术人 员将是已知的或显而易见的，并且在例如Remington' S曲armaceutical Sciences,第18 版.，Mack Publishing Company,Easton,PA(1990)中更加详细地描述。
[0171] 可将所述组合物配制成溶液、微乳液、脂质体或适合于高药物浓度的其他有序结 构。
[0172] 所述组合物应当是无菌的并且应当是达到易于注射程度的流体。该组合物在制备 和储存条件下应当是稳定的，并且可W对抗微生物如细菌和真菌的污染作用而保存。在用 于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻 干），该方法由其预先无菌过滤的溶液产生活性剂加上任何所需附加成分的粉末。
[0173] 可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂例如对径基苯甲酸醋、氯下醇、苯酪、抗坏血酸、 硫柳隶等实现对微生物作用的阻止。在许多情况下，在组合物中将优选包含等渗剂，例如 糖、氯化钢或多元醇如甘露醇和山梨糖醇。通过将延迟吸收的试剂例如单硬脂酸侣或明胶 包含在组合物中可导致可注射组合物的吸收延长。
[0174] 可通过根据需要将所需量的如本文所述的缀合物并入具有一种或组合的W上所 列成分的适当溶剂中，然后进行过滤除菌，来制备无菌可注射溶液。通常，通过将该缀合物 并入含有碱性分散介质和来自W上列举的那些的所需其他成分的无菌载体中来制备分散 体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法可包括真空干燥、喷雾干 燥、喷雾冷冻和冷冻干燥，该方法由其预先无菌过滤的溶液产生活性成分（即，皿P缀合物） 加上任何所需附加成分的粉末。
[0175] 组合物可W配制成剂量单位形式，W易于施用和保证剂量的一致性。如本文所用 的剂量单位形式是指适合作为待治疗受试者的单一剂量的物理上离散的单元;每个单元含 有经计算将产生所需治疗效果的预定量的缀合物。请求保护和公开的本发明的剂量单位形 式的规格取决于并直接依赖于(a)皿P缀合物的独特特性和待实现的特定治疗效果，W及 (b)在合成用于治疗受试者的所选病况的运种治疗性化合物的技术中固有的限制。
[0176] 除了如本文所述的缀合物之外，如本文所述的药物组合物还可W包含附加的活性 成分。例如，药物组合物可包含附加的治疗剂或预防剂。例如，当药物组合物意欲用于治疗 出血性病症时，其可额外地包含一种或多种旨在减轻该出血性病症的症状的药剂。例如，该 组合物可包含一种或多种附加的凝血因子。该组合物可包含一种或多种旨在改善患者的状 况的其他组分。例如，当该组合物意欲用于治疗遭遇不希望的出血的患者如经历手术的患 者或遭受创伤的患者时，该组合物可包含一种或多种止痛剂、麻醉剂、免疫抑制剂或抗炎 剂。
[0177] 所述组合物可配制用于在特定方法中使用或通过特定途径施用。本发明的缀合物 或组合物可肠胃外、腹膜内、脊柱内、静脉内、肌内、阴道内、皮下、鼻内、经直肠或脑内施用。
[0178] 如本文所述的皿P-FIX多肤缀合物的一个有利特性是，该聚合物具有大约在13至 65kDa(尤其是 13 至 55kDa、13 至 50kDa、13 至 45kDa、13 至 40kDa、25 至 55kDa、25 至 50kDa、25 至 45kDa、30至45kDa或38至42kDa)范围内的聚合物大小，因为运可W允许体内有用的半衰期 或平均停留时间，同时还在液体溶液中具有合适的粘度。
[0179] 缀合物的用途
[0180] 如本文所述的缀合物可施用于有需要的个体，W便向该个体递送FIX多肤。该个体 可W是需要FIX多肤的任何个体。
[0181] 根据本发明的FIX多肤缀合物可用来控制可能由例如凝血因子缺乏(例如B型血友 病)或凝血因子抑制剂引起的出血性病症，或者可用来控制在具有功能正常的血凝级联(没 有凝血因子缺乏或针对任何凝血因子的抑制物）的患者中发生的过量出血。
[0182] 对于与有意干预有关的治疗，通常在进行该干预之前约24小时内-或由于延长的 半衰期而甚至更早一施用本发明的FIX多肤缀合物，并在此后持续多达7天或更长时间。可 W通过如本文所述的多种途径进行施用。
[0183] 根据病况的严重程度，对70kg受试者递送的FIX多肤的剂量可为每天约0.05mg至 500mg FIX多肤缀合物，优选每天约Img至lOOmg，并且更优选每天约5mg至约75mg，作为负荷 和维持剂量。对于本发明的特定缀合物，合适的剂量还可W根据该缀合物的特性进行调整， 该特性包括其体内半衰期或平均停留时间及其生物活性。例如，具有较长半衰期的缀合物 可W按减少的剂量施用，和/或与野生型FIX相比具有降低的活性的组合物可W按增加的剂 量施用。
[0184] 可W施用含有本发明的FIX多肤缀合物的组合物W用于预防性和/或治疗性处理。 在治疗性应用中，W足W治愈、减轻或部分抑制疾病如W上所述的任何出血性病症及其并 发症的量，向已经患有该疾病的受试者施用组合物。足W实现该目的的量被定义为"治疗有 效量"。本领域技术人员将会理解，对该目的而言有效的量将依赖于疾病或损伤的严重程 度，W及受试者的体重和一般状态。然而，通常，对于70kg受试者，有效递送量的范围将为每 天约0.05mg至约500mg FIX多肤缀合物，其中每天递送约l.Omg至约lOOmg缀合物的剂量更 常使用。
[0185] 在严重的疾病或损伤情况，即，危及生命或潜在危及生命的状况中，通常可采用如 本文所述的缀合物。在运样的情况下，考虑到外来物质的最小化W及人FIX多肤变体的免疫 原性在人类中的普遍缺乏，治疗医生可能认为需要施用大大过量的运些FIX缀合物组合物。 在预防性应用中，向易患疾病状态或损伤或处于其风险中的受试者施用含有本发明FIX缀 合物的组合物，W增强该受试者自身的凝血能力。运样的量被定义为"预防有效剂量"。在预 防性应用中，递送的FIX多肤缀合物的精确量仍然依赖于受试者的健康状态和体重，但对于 70kg受试者，剂量通常在每天约0.05mg至约500mg的范围内，对于70kg受试者更常见的是每 天约1 .Omg至约lOOmg。
[0186] 可采用治疗医生选择的剂量水平和方式进行所述组合物的单次或多次施用。对于 需要每日维持水平的能走动的受试者，可使用例如便携式累系统通过连续输注施用FIX多 肤缀合物。
[0187]可通过例如喷雾、灌注、双球囊导管、支架、引入血管移植物或支架内、用于涂覆球 囊导管的水凝胶或其他完善的方法进行本发明的FIX缀合物的局部递送，例如局部施用。在 任何情况下，所述药物组合物应当提供足W有效治疗受试者的量的FIX多肤缀合物。
[018引 定义
[0189] 除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语通常具有与本发明所属领域 的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。
[0190] 如本文所用的，术语"受试者"包括任何人类患者或非人类脊椎动物。
[0191] 术语"治疗"是指对任何有需要的人或其他脊椎动物受试者的医学疗法。所述受试 者预期已经经历由医生或兽医进行的体检，该医生已经给出将表明所述特定治疗的使用有 益于所述人或其他脊椎动物的健康的初步或明确诊断。根据受试者的健康现状，所述治疗 的时机和目的可W在个体之间不同。因此，所述治疗可W是预防性、姑息性、对症性和/或根 治性的。就本发明而言，预防性、姑息性、对症性和/或根治性治疗可W代表本发明的不同方 面。
[0192] 术语"凝血病"是指可能由正常凝血级联的任何促凝组分的任何性质或含量上的 缺陷或纤维蛋白溶解的任何上调引起的增强的出血倾向。运样的凝血病可能是先天性和/ 或获得性和/或医源性的，并且由本领域技术人员加 W确定。
[0193] 术语"聚糖"是指与单个氨基酸残基共价连接的整个寡糖结构。聚糖通常是N-连接 的或0-连接的，例如，聚糖连接至天冬酷胺残基(N-连接的糖基化)或丝氨酸或苏氨酸残基 (0-连接的糖基化）dN-连接的寡糖链可W是多触角的，例如，二三或四触角的，并且大多数 通常含有Man3-GlcNAc-GlcNAc-的核屯、结构。产生蛋白质的细胞将N-聚糖和0-聚糖两者附 接至蛋白质上。当初生蛋白质从核糖体易位至内质网时，细胞的N-糖基化机器识别氨基酸 链中的N-糖基化共有基序（N-X-S/T基序）并使其糖基化化iely等人（1976)Journalof Biological Chemistry 251，549〇-5495;Glabe等人（1980)Jou;rnal of Biological 化emis化y 255,9236-9242)。当在人体中原位产生时，一些糖蛋白具有运样的聚糖结构：其 具有末端或"加帽"唾液酸残基，即，每个触角的末端糖是经由曰2->3或曰2->6连接与半乳 糖连接的N-乙酷基神经氨酸。其他糖蛋白具有用其他糖残基封端的聚糖。然而，当在其他情 况下产生时，糖蛋白可含有在其一个或多个触角上具有不同末端结构的寡糖链，例如，含有 N-径乙酷基神经氨酸(Neu5Gc)残基或含有末端N-乙酷基半乳糖胺(GalNAc)残基来代替半 乳糖。
[0194] 本文在向患者施用肤药物的上下文中所用的术语"半衰期"是指患者中药物的血 浆浓度减少一半所需的时间。
[0195] 术语"半衰期延长部分"是指当与多种治疗性蛋白质/肤缀合时能够延长运些蛋白 质/肤的体内循环半衰期的一个或多个化学基团。半衰期延长部分的实例包括:生物相容性 脂肪酸及其衍生物、径基烷基淀粉(HAS)例如径乙基淀粉化ES)、聚乙二醇(PEG)和它们的任 意组合。
[0196] 术语"因子IX活性的恢复率"是指在aPTT试验中测得的活性占使用显色试验测得 的活性的百分比。
[0197] 术语"唾液酸"是指九个碳的簇基化糖的家族中的任何成员。唾液酸家族的最常见 成员是N-乙酷基神经氨酸（2-酬基-5-乙酷氨基-3,5-二脱氧-D-甘油-D-半乳糖化喃壬-1- 酬糖酸(通常缩写为Neu5Ac、化uAc、NeuNAc或NANA))。该家族的第二个成员是N-径乙酷基- 神经氨酸(Neu5(ic或化uGc)，其中化uNAc的N-乙酷基被径基化。第Ξ个唾液酸家族成员是2- 酬基-3-脱氧-壬酬糖酸（2-ket〇-3-deo巧-nonulosonic acid)化DN)(化dano等人（1986) J Biol Chem 261:11550-11557;Kanamori等人，J Biol Chem 265:21811-21819(1990))。还 包括9-取代的唾液酸，诸如9-0-C1-C6酷基-Neu5Ac，如9-0-乳酷基化u5Ac或9-0-乙酷基- Neu5Ac。在1992年10月1日公布的国际申请W092/16640中公开了在唾液酸化程序中唾液酸 化合物的合成和使用。
[0198] 术语"唾液酸衍生物"是指经一个或多个化学部分修饰的如上定义的唾液酸。例 如，修饰基团可W是烷基如甲基、叠氮基-和氣基团，或可W充当用于附接其他化学部分的 柄的官能团，如氨基或琉基。实例包括9-脱氧-9-氣-Neu5Ac和9-叠氮基-9-脱氧-Neu5Ac。该 术语还包括缺乏一个或多个官能团如簇基或一个或多个径基的唾液酸。该术语还包括其中 簇基被甲酯胺基团或醋基团替代的衍生物。该术语还指其中一个或多个径基已被氧化为幾 基的唾液酸。此外，该术语还指在例如用高舰酸盐氧化处理之后缺乏C9碳原子或C9-C8碳链 的唾液酸。
[0199] 甘氨酷基唾液酸是根据上述定义的唾液酸衍生物，其中化uNAc的N-乙酷基被甘氨 酷基(也称为氨基乙酷基)所替代。甘氨酷基唾液酸可W用W下结构表示：
[0200]
[0201] 术语"CΜP激活的"唾液酸或唾液酸衍生物是指含有唾液酸部分和胞巧一憐酸 (CMP)的糖核巧酸。
[0202] 在本说明书中，使用术语"甘氨酷基唾液酸胞巧一憐酸"描述GSC，并且该术语是相 同的CMP激活的甘氨酷基唾液酸的别名的同义词。别名包括CMP-5 ' -甘氨酷基唾液酸、胞巧- 5/ -单憐酷-Ν-甘氨酷基神经氨酸、胞巧-5/ -单憐酷-Ν-甘氨酷基唾液酸。
[0203] 术语"完整的糖基连接基团"是指衍生自糖基部分的连接基团，其中在多肤与皿Ρ 部分之间插入并与该多肤和皿Ρ部分共价连接的糖单体在缀合物形成过程中没有被降解， 例如，没有被例如偏高舰酸钢氧化。通过添加糖基单元或从母体糖结构中去除一个或多个 糖基单元，"完整的糖基连接基团"可从天然存在的寡糖衍生。
[0204] 术语"去唾液酸糖蛋白"意在包括运样的糖蛋白：其中，例如通过唾液酸酶处理或 通过化学处理已去除一个或多个末端唾液酸残基，从而使来自下"层"半乳糖或Ν-乙酷基半 乳糖胺的至少一个半乳糖或Ν-乙酷基半乳糖胺残基暴露Γ暴露的半乳糖残基"）。
[0205] 结构式中的虚线表示打开的价键(即，将该结构与其他化学部分连接的键）。
[0206] 进一步的实施方案
[0207] 在一个实施方案中，与肥Ρ缀合的FIX多肤是野生型FIX。
[0208] 在一个实施方案中，与肥P缀合的FIX多肤是野生型FlX(a)。
[0209] 在另一个实施方案中，与皿P缀合的FIX多肤是与野生型FIX或FlX(a)具有>95% 的序列同一性的类似物或变体。
[0210] 在一个实施方案中，该皿P-FIX多肤缀合物的FIX是突变的，使得它具有增强的蛋 白水解活性。
[0211] 在一个实施方案中，与FIX多肤缀合的肥P聚合物具有5至15kDa的分子量。
[0212] 在一个实施方案中，与FIX多肤缀合的肥P聚合物具有15至25kDa的分子量。
[0213] 在一个实施方案中，与FIX多肤缀合的肥P聚合物具有25至35kDa的分子量。
[0214] 在一个实施方案中，与FIX多肤缀合的肥P聚合物具有35至45kDa的分子量。
[0215] 在一个实施方案中，与FIX多肤缀合的肥P聚合物具有45至55kDa的分子量。
[0216] 在一个实施方案中，与FIX多肤缀合的肥P聚合物具有55至65kDa的分子量。
[0217] 在一个实施方案中，与FIX多肤缀合的肥P聚合物具有13至60kDa的分子量。
[0218] 在一个实施方案中，与FIX多肤缀合的肥P聚合物具有13至50kDa的分子量。
[0219] 在一个实施方案中，与FIX多肤缀合的肥P聚合物具有13至45kDa的分子量。
[0220] 在一个实施方案中，与FIX多肤缀合的肥P聚合物具有13至40kDa的分子量。
[0221] 在一个实施方案中，与FIX多肤缀合的肥P聚合物具有13至35kDa的分子量。
[0222] 在一个实施方案中，与FIX多肤缀合的肥P聚合物具有13至30kDa的分子量。
[0223] 在一个实施方案中，与FIX多肤缀合的肥P聚合物具有13至25kDa的分子量。
[0224] 在一个实施方案中，与FIX多肤缀合的肥P聚合物具有27至40kDa的分子量。
[0225] 在一个实施方案中，与FIX多肤缀合的肥P聚合物具有27至41kDa的分子量。
[0。6]在一个实施方案中，与FIX多肤缀合的肥P聚合物具有27至42kDa的分子量。
[0227]在一个实施方案中，与FIX多肤缀合的肥P聚合物具有27至43kDa的分子量。
[0。引在一个实施方案中，与FIX多肤缀合的肥P聚合物具有27至44kDa的分子量。
[0229] 在一个实施方案中，与FIX多肤缀合的肥P聚合物具有27至45kDa的分子量。
[0230] 在一个实施方案中，所述皿P聚合物具有约5、10、15、20、21、22、23、24、25、26、27、 28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、 53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、80、85、 90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、175、180、190 或 200kDa 的大小。
[0231] 在一个优选的实施方案中，与FIX多肤缀合的肥P聚合物具有40kDa+/-10 %的分子 量。
[0232] 在一个实施方案中，公开了用于生产具有末端胺的肥P的高产率方法。
[0233] 在一个实施方案中，提供了适合与感兴趣的化合物缀合的用苯甲醒部分官能化的 GSC化合物。
[0234] 在一个实施方案中，苯甲醒部分附接至GSC化合物，从而产生适合与用胺基团官能 化的肥P聚合物缀合的GSC-苯甲醒化合物(参见图1)。
[0235] 在一个实施方案中，4-甲酯基苯甲酸与肥P聚合物化学偶合，随后通过还原胺化与 GSC偶合(参见图2)。
[0236] 在优选的实施方案中，本发明提供了一种基于GSC的试剂，其中4-甲基苯甲酯基亚 连接体连接肥P与GSC(参见图4)。
[0237] 在一个实施方案中，使用基于4-甲基苯甲酯基-GSC的缀合将肥P聚合物与FIX多肤 缀合。
[0238] 在一个实施方案中，包含氨基的皿P聚合物部分与4-甲酯基苯甲酸反应，随后通过 还原胺化与GSC的甘氨酷基氨基基团偶合。
[0239] 在一个实施方案中，包含反应性胺的肥P聚合物与用苯甲醒部分官能化的GSC化合 物缀合，其中所述胺与所述苯甲醒部分反应，W产生在皿P与GSC之间的包含4-甲基苯甲酯 基亚连接部分的连接体。
[0240] 在另一个实施方案中，用反应性苯甲醒官能化的皿P聚合物与GSC化合物的甘氨酷 基胺部分缀合，其中所述苯甲醒与胺反应，W产生在皿P与GSC之间的包含4-甲基苯甲酯基 亚连接部分的连接体。
[0241] 在一个实施方案中，所述肥P-GSC缀合物进一步缀合到FIX多肤上，W产生其中肥P 聚合物与所述FIX多肤经由4-甲基苯甲酯基亚连接部分连接的缀合物。
[0242] 在一个实施方案中，根据W02007056191制备的GSC与包含苯甲醒部分的肥P聚合物 部分在还原条件下反应。
[0243] 在一个实施方案中，提供了适合与GSC偶合的各种肥P-苯甲醒化合物。
[0244] 在一个实施方案中，HEP与GSC之间的亚连接体不能形成立体异构体或区域异构 体。
[0245] 在一个实施方案中，HEP与GSC之间的亚连接体不能形成立体异构体或区域异构 体，因此具有较低的在人体中产生免疫应答的潜力。
[0246] 在一个实施方案中，使用包含4-甲基苯甲酯基-GSC的化学连接体将皿P聚合物与 FIX多肤连接。
[0247] 在一个实施方案中，肥P-GSC用于制备FIX多肤N-聚糖肥P缀合物(参见图5)。
[0248] 在一个实施方案中，肥P-GSC用于使用ST3Gaini制备FIX多肤N-聚糖肥P缀合物。
[0249] 在一个实施方案中，肥P-GSC用于使用ST3GalI制备FIX多肤0-聚糖肥P缀合物。
[0巧0] 在一个实施方案中，所述皿P聚合物连接至FIX激活肤上的N-聚糖，如SEQ ID NO: 1 的N157或N167。
[0251] 在另一个实施方案中，所述皿P聚合物连接至FIX激活肤上的0-聚糖，如在SEQ ID N0:1的位置159、169或172上的0-聚糖。
[0252] 在一个实施方案中，所选择的肥P聚合物大小允许体内有用的半衰期，而同时保持 适当的体内激活为FIXa的能力，同时还在液体溶液中具有合适的粘度。
[0253] 在一个实施方案中，选择73kDaW下的皿P聚合物大小W在液体制剂中达到合适的 粘度。
[0254]在一个实施方案中，选择52kDaW下的HEP聚合物大小W在液体制剂中达到合适的 粘度。
[0255] 在一个实施方案中，选择40kDa或更小的肥P聚合物大小W在液体制剂中达到合适 的粘度。
[0256] 在一个实施方案中，本发明中使用的CMP激活的唾液酸衍生物由W下结构表示：
[ο 巧 7]
[Ο 巧引 其中 R1 选自-COOH、-C0NH2、-COOMe、-COCffit、-COOPr，并且 R2、R3、R4、R5、R6 和 R7可 独立地选自-Η、-畑2、-甜、-N3、-OH、-F或甘氨酷基氨基基团如-畑C (0) C出畑2。
[0259] 在一个实施方案中，R1 为-C00H，R2 为H，R3 = R5 = R6 = R7 = -OH，并且 R4 为-NHC(O) C出N出，并且所述唾液酸衍生物是CMP激活的。
[0260] 在一个实施方案中，CMP激活的唾液酸为具有W下结构的GSC:
[0261]
[0262]在一个实施方案中，所述唾液酸衍生物在去除CMP基团之后与FIX多肤聚糖连接并 具有W下结构：
[0%3]
[0264]其中打开的价键表示与FIX连接的键，并且
[02 化]其中 R1 选自-C00H、-C0NH2、-COOMe、-COCffit、-COOPr，并且 R2、R3、R4、R5、R6 和 R7 可 独立地选自-H、-畑2、-甜、-N3、-OH、-F或甘氨酷基氨基基团如-畑C (0) C出畑2。
[0266] 在一个实施方案中，肥P聚合物与所述唾液酸衍生物的甘氨酷基氨基基团连接。
[0267] W下是本发明的方面的非限制性列表：
[0268] 1.-种连接具有反应性胺的半衰期延长部分与具有反应性胺的GSC部分的方法， 其中首先使所述半衰期延长部分上的反应性胺与激活的4-甲酯基苯甲酸反应W产生式A1 的化合物：
[0269]
[0270] 随后使式A1的化合物与GSC部分在还原条件下反应W产生根据式A2的化合物：
[0271]
[0272] 2.-种连接具有反应性胺的半衰期延长部分与具有反应性胺的GSC部分的方法， 其中首先使所述GSC部分上的反应性胺与激活的4-甲酯基苯甲酸反应W产生根据式A3的化 合物：
[0273]
[0274] 随后使式A3的化合物与所述半衰期延长部分上的反应性胺在还原条件下反应W 产生根据式A4的化合物：
[0275]
[0276] 3.根据方面1至3中任意一项所述的方法，其中所述半衰期延长部分为肝素原聚合 物。
[0277] 4.根据方面1所述的方法，其中使经4-甲酯基苯甲酯基修饰的肝素原聚合物 (AA1)：
[027引
[02巧]与GSC(BBl)在还原剂的存在下反应，
[0283] 其中η为5至450的整数。
[0284] 5.根据方面1至4中任意一项所述的方法，进一步包括后续步骤，其中将与GSC缀合 的半衰期延长部分与因子IX多肤酶促缀合W产生缀合物，其中半衰期延长部分经由包含4- 甲基苯甲酯基亚连接体并缺乏GSC的胞巧一憐酸基团的连接体附接至蛋白质。
[0285] 6.可通过根据方面1至5中任意一项所述的方法获得的产物。
[0286] 通过W下非限制性实施方案进一步描述本发明：
[0287] 1.-种缀合物，其包含因子IX多肤、连接部分和肝素原聚合物，其中连接所述因子 IX多肤与所述肝素原聚合物的所述连接部分包含X，如下所示：
[0288] [肝素原聚合物]-[X]-[因子IX多肤]
[0289] 其中X包含将根据W下式Ε1的部分与所述因子IX多肤连接的唾液酸衍生物：
[0290]
[0291] 2.根据实施方案1所述的缀合物，其中所述唾液酸衍生物是根据W下式E2的唾液 酸衍生物：
[0292]
[0293] 其中在位置R1的基团选自-C00H、-CON此、-COOMe、-COOEt、-COOPr，并且在位置R2、 R3、R4、R5、R6 和 R7 的基团可独立地选自-Η、-NH-、-畑2、-甜、-N3、-OH、-F 或-NHC (0)邸2畑-。
[0294] 3.根据实施方案2所述的缀合物，其中所述唾液酸衍生物是根据W下式E3的甘氨 酷基唾液酸：
[0295]
[0296] 并且其中式1的部分与式E3的末端-NH柄连接。
[0297] 4.根据实施方案1、2或3所述的缀合物，其中
[0298] 肝素原聚合物]-[X]-
[0299] 包含W下式E4所示的结构片段：
[0300]
[0301] 其中η为5至450的整数。
[0302] 5.-种缀合物，其包含因子IX多肤和肝素原聚合物，其中所述肝素原聚合物具有 在5至lOOkDa范围内的分子量。
[0303] 6.根据实施方案5所述的缀合物，其中所述肝素原聚合物具有在13至60kDa范围内 的分子量。
[0304] 7.根据实施方案5所述的缀合物，其中所述肝素原聚合物具有在27至40kDa范围内 的分子量。
[0305] 8.根据实施方案5所述的缀合物，其中所述肝素原聚合物的分子量为40kDa+/- 10%。
[0306] 9. 一种药物组合物，其包含根据实施方案1至8中任意一个所述的缀合物。
[0307] 10与因子IX多肤缀合的肝素原聚合物在aPTT试验中的用途，其中因子IX活性的恢 复率的变异性小于523个百分点。
[0308] 11.根据实施方案10所述的与因子IX多肤缀合的肝素原聚合物的用途，其中因子 IX活性的恢复率的变异性不大于115个百分点。
[0309] 12.根据实施方案1至8中任意一个所述的缀合物，其用作药物。
[0310] 13.根据实施方案1至8中任意一个所述的缀合物，其用于凝血病的治疗。
[0311] 14.根据实施方案1至8中任意一个所述的缀合物，其用于B型血友病的治疗。
[0312] 15.根据实施方案1至8中任意一个所述的缀合物，其用于B型血友病的预防性治 疗。
[0313] 16.-种将肝素原聚合物与因子IX多肤缀合的方法，其包括W下步骤：
[0314] a)使包含反应性胺的肝素原聚合物阳EP-NH]与激活的4-甲酯基苯甲酸反应，W产 生W下式E5的化合物，
[0315]
[0316] 其中化EP-N扣表示用末端伯胺官能化的任意肥P聚合物，
[0317] b)使式5的化合物与CMP激活的唾液酸衍生物在还原条件下反应，
[0318] C)将步骤b)中获得的化合物与因子IX多肤上的聚糖缀合。
[0319] 17.根据实施方案16所述的方法，其中在步骤b)中使用的CMP激活的唾液酸衍生物 具有W下式E6:
[0320]
[0321] 其中在位置R1的基团选自-C00H、-CON肥、-COOMe、-C00化、-COOPr，并且在位置R2、 R3、R4、R5、R6 和 R7 的基团可独立地选自-H、-NH-、-畑2、-甜、-N3、-OH、-F 或 NHC0CN 出。
[0322] 18.根据实施方案16或17所述的方法，其中R4为NHC0CN出。
[0323] 19.使用根据实施方案16、17或18所述的方法可获得的缀合物。
[0324] 通过W下实施例进一步阐述本发明，但运些实施例不应被理解为限制保护范围。 在前述说明书和W下实施例中公开的特征单独地W及W其任意组合可能对于实现不同形 式的本发明是重要的。
[0325] 实施例
[03%]实施例中使用的缩写：
[0327] AUS:产脈节杆菌(Art虹obacter ureafaciens)唾液酸酶
[0328] CMP:胞巧一憐酸 [03巧]邸TA:乙二胺四乙酸
[0330] Gla: 丫-簇基谷氨酸
[0331] GlcUA:葡糖醒酸
[0332] GlcNAc:N-乙酷基葡萄糖胺
[0333] Grx2:谷氧还蛋白II
[0334] GSC:甘氨酷基唾液酸胞巧一憐酸
[03巧]GSC-SH:[(4-琉基下酷基)甘氨酷基]唾液酸胞巧一憐酸
[0336] GSH:谷脫甘肤
[0337] GSSG:谷脫甘肤二硫化物
[0338] 肥P:肝素原
[0339] 肥P-FIX:与因子IX多肤缀合的肝素原(可与FIX-肥P互换使用）
[0340] 肥P-[C]-FIX化162C):经由半脫氨酸与FIX化162C)缀合的肝素原
[0；341] 肥P-[N]-FIX:经由N-聚糖与FIX缀合的肝素原
[ο%2] 肥P-GSC:GSC官能化的肝素原聚合物 [0；3创肥P-N出:胺官能化的肝素原聚合物
[0344] HEPES:2-[4-(2-径乙基)赃嗦-1-基化横酸
[0345] His:组氨酸
[0；346] IV:静脉内 [0：347] K0:敲除
[0%引 MRT:平均停留时间 [0349] PABA:对氨基苯甲脉
[03加 ]PmHSl:多杀己斯德氏菌(Pasteurella mutocida)肝素原合酶I
[0巧1] pNA:对硝基苯胺 惦52] SXa-11:因子Xa显色底物
[0353] UDP:尿巧二憐酸
[0354] 实施例1:定量方法
[0355] 通过HPLC分析本发明的缀合物的纯度。册LC还用于缀合物定量。定量基于使用 280nm波长吸收谱的曲线下面积积分。使用由Wyeth F*ha;rmaceuticals Inc .生产的 BeneFIXK 重组凝血因子 IX 作为参考。使用Zorbax 300SB-C3柱（4.6x50mm;3.5ym Agilent,目录号:865973-909)。在配备有巧光检测器巧X 280nm，血：M8nm)的Agilent 1100 Series册LC上操作该柱。柱溫为30°C，样品注射量为化g且流速为1.5ml/min。采用含有 0.1%Ξ氣乙酸的水(A)-乙腊(B)溶剂体系洗脱柱。梯度程序如下:0min(25%B);4min(25% B); 14min(46%B) ;35min(52%B) ;40min(90%B) ;40. lmin(25%B)。
[0356] 实施例 2:SDS-PAGE 分析
[Ο%7] 使用全部来自Invihogen的预制N叫age 7%1:;ris-乙酸盐凝胶、Nu化ge tris-乙 酸盐SDS电泳缓冲液和N证age LDS样品缓冲液进行SDS PAGE分析。在分析之前使样品变性 (70°C，10min)。使用HiMark HMW(Invitrogen)作为标准。电泳在150V、120mA下在具有发电 站的XCe 11 Sure lock Complete (Invitrogen)中运行80min。使用来自 Invitrogen的 SimplyBlue SafeSl:ain将凝胶染色。
[0358] 实施例3:FIX化162C)的选择性还原
[0359] W与US20090041744中针对FVIIa407C描述的方式类似的方式，使用基于谷脫甘肤 的氧化还原缓冲液体系还原FIX化162C)。将未还原的FIX化162〇(10.5111旨）在含有0.51111 65山154]?6556、2.5111]\1对氨基苯甲脉和24]\16'义2的总体积为5.251111的50111]\1胎963，100111]\1 化CiaOmM CaCl2(pH 7.0)中，在室溫下溫育23小时。随后用50mM胎pesaOOmM化C1将反 应混合物稀释至44ml，在冰上冷却，并添加至4ml lOOmM抓TA溶液中，同时保持pH为7.0。随 后将全部内含物加载到W缓冲液A(50mM HepesaOOmM化Cl，pH 7.0)平衡的2x5ml HiTrap Q FF柱(Amersham BiosCiences，GE Healthcare)上，W捕获FIX(E162C)。用缓冲液A洗涂 W 去除未结合的Grx2之后，用缓冲液B(50mM胎pes，lM化CiaOmM CaCl2，pH 7.0)-步洗脱 FIX化162C)。通过册LC测定洗脱物中FIX化162C)的浓度。随后添加对氨基苯甲脉（2化1的 0.5M水溶液)至最终浓度为2mM。在5ml的50mM Hepes，lM化CiaOmM CaCl2,2mM对氨基苯甲 脉(pH 7.0)中分离出7.95mg的单一半脫氨酸还原的FIX化162C)。
[0360] 实施例4:60kDa 肥P-[C]-FIX化 162C)的合成
[03W]向单一半脫氨酸还原的FIX化 162C)(7.95mg)在50mM Hepes，lM 化CiaOmM CaCl2,2mM PABA(pH 7.0)(5ml)中的溶液中添加溶解于 50mM Hepes，100mM 化 CiaOmM CaCb(pH 7.0) (2.95ml)中的60kDa皿P-马来酷亚胺(55.3mg)。将澄清溶液置于滚轴混合 器上，并在室溫下轻轻旋转22小时。随后将反应混合物加载到经Gla-结构域特异性抗体修 饰的FIX特异性亲和柱(CV = 66ml，总结合容量为13.3mg FIX)上，并首先用2个柱体积的缓 冲液A(50mM胎pesaOOmM化CiaOmM CaCl2，pH 7.4)然后用两个柱体积的缓冲液8(5〇111]\1 Hepes，100mM化Cl，10mM邸TA，pH7.4)分步洗脱。收集含有FIX和60kDa肥P-FIX缀合物的 级分，并将该级分直接加载到用10mMHis，100mM化Cl(pH7.5)预平衡的2x5mlHiTrapQ FF离子交换柱（Amersham Biosciences，GE 胎althcare)上。用4个柱体积的lOmM His, lOOmM化Cl(pH 7.5)洗柱W去除未结合的物质。随后将洗脱液更换为缓冲液A(l〇mM化s， lOOmM NaCiaOmM CaCl2，pH=6.0)。用5个柱体积的20%缓冲液B(l〇mM HisaOOmM NaCl， lOmM CaCl2，pH = 6.0)洗脱未修饰的FIX化162C)，随后用5个柱体积的40%缓冲液B洗脱 60kDa皿P-FIX。将含有缀合物的级分合并，并采用lOkDa的截断值使用Slide-A-Lyzer盒 (Thermo Scientific)针对lOmM His, lOOmM NaCl，10mM 化〔12(抑=6.0)进行透析。通过添 加 lOmM HisaOOmM化CiaOmM CaCl2(pH = 6.0)将最终体积调整至0.3mg/ml。如实施例2所 述W SDS-PAGE分析缀合物的纯度。如通过针对FIX标准的HPLC定量所测定的，缀合物的产量 为 3.75mg(47%)。
[0362] 实施例5:38.840曰肥口-[口斗《化1620的合成
[0363] 使用如实施例1所述制备的单一半脫氨酸还原的FIX化1620(6.30mg)和38.8kDa 肥P-马来酷亚胺（18.9mg)，如实施例4所述制备该缀合物。在6.3ml lOmM His，150mM NaCl， 5mMCaCl2,0.005%吐溫80(pH6.4)中分离出2.8mg(44%)38.8kDa皿P-[C]-FIX化162C) (祉M;0.45mg/ml)。
[0364] 实施例6:27kDa 肥P-[C]-FIX化 162C)的合成
[0365] 使用如实施例1所述制备的单一半脫氨酸还原的FIX化162C)(6.32mg)和27kDa 皿P-马来酷亚胺（10.2mg)，如实施例4所述制备该缀合物。在8.84mll0mMHis，150mM 化Cl，5mMCaCl2,0.005%吐溫80(pH6.4)中分离出3.96mg(62%)2化DaHEP-[C]-FIX (E162C)(8yM;0.45mg/ml)。
[0366] 实施例7:13kDa 肥P-[C]-FIX化 162C)的合成
[0367] 使用如实施例1所述制备的单一半脫氨酸还原的FIX化1620(10.0 mg)和13kDa 皿口-马来酷亚胺（10.〇111旨），与实施例4类似地制备该缀合物。在5.1〇11111〇11^化3，15〇1111 NaCl，5mMCaCl2,0.005%吐溫80(pH6.4)中分离出2.3mg(23%)13kDaHEP-[C]-FIX (E162C)(8yM;0.45mg/ml)。
[036引实施例8: FIX的去唾液酸化
[0369] 室溫下，使FIX(20.4mg)与唾液酸酶（产脈节杆菌，140μ1，0.3mg/ml，200U/ml)在 1.7ml的10mM组氨酸、3mMCaCl2、150mMNaCl(抑6.2)中反应l小时。随后用50mM胎pes， lOOmM化Cl (pH 7.0) (20ml)稀释反应混合物，并将反应混合物在冰上冷却。W小份添加 lOOmM邸TA溶液(3ml)。在每次添加后测量抑。将抑维持在5.5-9.0内。用Mi 11 iQ水将反应混 合物稀释至40mlW降低电导率，并施加至用缓冲液A(50mM HepesaOOmM化Cl，pH 7.0)平 衡的2x5ml HiTrap Q FF离子交换柱（Amersham Biosciences，GE Healthcare)上。用缓冲 液B(50mM胎pes，lM化CiaOmM CaCl2,抑7.0)-步洗脱去唾液酸FIX。通过HPLC测定洗脱 物中去唾液酸FIX的浓度。在6ml 50mM Hepes，lM化CiaOmM CaCl2(pH 7.0)中分离出 17.2mg去唾液酸FIX( 2.86mg/ml)。
[0370] 实施例9: [(4-琉基下酷基)甘氨酷基]唾液酸胞巧一憐酸(GSC-SH)的合成
[0371]
[0372] 将甘氨酷基唾液酸胞巧一憐酸(200mg;0.318mmol)溶解在水(2ml)中，并添加硫代 下内醋（325111旨；3.18111111〇1)。在室溫下将两相溶液轻轻混合2化。随后将反应混合物用水 (10ml)稀释，并施加至反相HPLC柱（C18,50mm X 200mm)上。采用水(A)、乙腊(B)和250mM碳 酸氨锭(C)的如下梯度体系W50ml/min的流速洗脱柱:0min(A:90%，B:0%，C:10%);12min (A:90%，B:0%，C: 10% ) ;48min(A:70%，B:20%，C: 10% )。收集级分(20ml大小)并通过LC- MS对其进行分析。将纯级分合并，并使其缓慢通过钢形式的Dowex 50W X 2(100-200目）树 脂的短垫，之后冻干成干燥粉末。随后使用260皿处的吸光度并且W甘氨酷基唾液酸胞巧一 憐酸作为参考物质，通过HPLC测定冷冻干燥的粉末中标题物质的含量。对于HPLC分析，使用 了Waters X-Bridge苯基柱(5ym4.6mm X 250mm)和水乙腊体系（30min内0-85%乙腊的线性 梯度，含有0.1 %憐酸）。产量：61.6mg(26% ) dLCMS:732.18(MH+);427.14(MH+-CMP)。当在-80 °C下储存时，化合物在延长的时间段(> 12个月）内稳定。
[0373] 实施例10:具有末端氨基乙基柄的肝素原聚合物的合成
[0374] 步骤l:(2-Fmoc-氨基）乙基2,3,4-Ξ-0-乙酷基-β-D-葡糖醒酸甲基醋的合成
[0375]
[0376] 将粉末化的分子筛（1.18g，4 Α)在安装有磁力揽拌棒的50ml圆底烧瓶中在110°C 下加热过夜，用氣气冲洗，并使其冷却至室溫。在氣气下添加900mg(2.19mmol)乙酷-漠-β- D-葡糖醒酸甲醋和748.5mg (2.64mmo 1，1.2当量)2- (Fmoo-氨基）乙醇，然后添加28ml二氯甲 烧。将悬浮液在室溫下揽拌15分钟，随后在冰/化C1浆体上冷却30分钟。在冷却过程中形成 白色沉淀物。在约5分钟的时间内分3份添加676.3mg(2.63mmo 1，1.2当量）Ξ氣甲横酸银 (Ag0Tf)"20分钟后去除冰浴。先前注意到的白色沉淀物开始溶解，同时开始形成灰色沉淀 物。将反应在室溫下揽拌过夜，随后通过添加19化LS乙胺(2.63mmol，1.2当量)巧灭。在通 过薄Celite 521垫（约0.1-0.2cm深)过滤并随后用20ml二氯甲烧洗涂滤饼之后，用二氯甲 烧将合并的滤液稀释至150ml。将有机相用5 %化肥化（1巧OmL)和水（1巧OmL)洗涂，随后经 硫酸儀干燥并过滤。将滤液在旋转蒸发仪(《40°C水浴)上真空浓缩至干，随后再溶解于2mL 二氯甲烧中。将溶液注射到VersaPak硅胶快速柱(23xll0mm，23g)上，并用在己烧中的50% 乙酸乙醋洗脱产物。通过化C(乙酸乙醋：己烧，1:1)鉴定含有产物的级分，并将该级分在旋 转蒸发仪（《40°C水浴)上真空浓缩至干。将得到的残余物用约lOmL二乙酸研磨，产生呈白 色结晶泡沫的标题物质。产量:293mg(0.49mmol，22.4% )。
[0377]步骤2: (2-Fmoc-氨基）乙基β-D-葡糖醒酸钢盐的合成 [037引
[0379] 将步骤1中获得的490mg(0.817mmol，1当量）的（2-Fmoc-氨基）乙基2，3，4-Ξ-0-乙 酷基-β-D-葡糖醒酸甲醋溶解于47.5mL甲醇中，并在揽拌下缓慢添加2.5mL( 2.45mmol，3当 量）的1M化OH溶液。使用1 -下醇：乙酸：水=1:1:1作为洗脱液，通过化C监测反应。在化C显 示该甲醋完全消耗后，通过添加1N HC1将反应混合物的pH降至pH 8-9。然后添加204mg (2.45mmol，3当量）固体化HC03，接着添加241.7mg(0.899mmol，1.1当量）化〇。-氯化物。当 TLC分析显示反应完全时，将反应混合物用约150mL水稀释，用乙酸乙醋(2x30mL)萃取两次， 随后在40°C水浴上真空浓缩至约20mLW去除任何残余的有机溶剂。通过添加乙酸至约5% (V: V)的含量将溶液酸化，并使溶液通过5克Strata C-18E S阳管(在甲醇中预湿，并根据制 造商的说明在5%乙酸中平衡）。用5%乙酸洗涂树脂，并用90%甲醇与10%Tris.HCl，pH 7.2(v:v)的混合物洗脱产物。真空浓缩(《40°C水浴)至干后，将残余物再溶解并用氨氧化 钢将pH调节至抑7.2。将该溶液直接作为储备溶液用于W下(2-Fmoc-氨基）乙基4-0-(2-脱 氧-2-乙酷氨基-a-D-化喃葡萄糖基)-β-0-葡糖醒酸的合成，而无需进一步纯化。
[0380] 步骤3:(2-Fmoc-氨基）乙基4-0-(2-脱氧-2-乙酷氨基-a-D-化喃葡萄糖基）-β-0- 葡糖醒酸钢盐的合成
[0381]
[0382] 向步骤2中获得的380mg(2斗moc-氨基）乙基β-D-葡糖醒酸（0.83mmol，l当量）在 lOO.SmL水中的溶液中添加5.6mL 1M Tris.HCKpH 7.2)、5.6mL lOOmM MnCb和 1.8g UDP-GlcNAc(2.79mmo 1,3.4当量）。在约 Imin内缓慢添加5. ImL MBP-PmHS 1 酶（15.47mg/mL 78.9mg)后，使反应在室溫下缓慢揽拌直到化C分析（1-下醇：乙酸:水=2:1:1)显示起始材 料几乎完全转化。通过添加2.8mL乙酸将溶液酸化W沉淀用过的MBP-PmHSl，并转移至50mL 离屯、瓶中。随后将溶液在JM-12旋转器(约16,000x g)中在室溫下ΚΙΟ,ΟΟΟ巧m离屯、30min。 倾出上清液并添加160血甲醇。用4x 25血水：甲醇：乙酸=45:50:5(V: V: V)的溶液萃取沉淀 物。使合并的上清液和萃取物通过2g S化ata-SAX管(在水：甲醇：乙酸= 45:50:5(v:v:v)中 平衡）W去除任何UDP&UDP-GlcNAc(完全去除需要28克树脂）。在运些条件下祀分子没有被 保留并通过树脂；而带更高电荷的UDP&UDP-GlcNAc被保留。将合并的洗脱物真空浓缩（水 浴;《40°C)，再溶解于水中，并使用氨氧化钢将抑调节至抑7.2。该溶液直接在下一步中使 用而无需进一步纯化。
[0383] 步骤4:(2-Fmoc-氨基）乙基4-0-(2-脱氧-2-乙酷氨基-4-0-(β-0-化喃葡萄糖基糖 醒酸)-a-D-化喃葡萄糖基)-β-0-葡糖醒酸二钢盐的合成
[0384]
[03化]将含有9mM(2-Fmoc-氨基）乙基4-0-(2-脱氧-2-乙酷氨基-a-D-化喃葡萄糖基)-β- D-葡糖醒酸、30mM UDP-GlcUA、50mM Tris.HQ和5mM MnCl2的水溶液（38ml)置于旋转瓶中。 在约Imin的时间内，在缓慢揽拌下逐滴添加9.5mL MBP-PmHSl。将反应混合物揽拌过夜，之 后TLC分析(洗脱液:n-BuOH: AcOH:此0 = 4:1:1 (V: V: V))显示起始材料完全转化。使反应混 合物通过1皿玻璃纤维注射器式滤器过滤，并通过5克C18-E S阳管(根据制造商的说明在水 中平衡）。用水洗涂树脂，然后用90 %MeOH水溶液，ImM化i S.肥1 (pH 7.2)的混合物洗脱祀 分子。将洗脱物真空浓缩(水浴《40°(：)，随后再溶解于25血1〇1111化13.肥1(抑7.2)中，并 通过0.2μπι SFCA注射器式滤器进行过滤。通过阴离子交换色谱法进一步纯化含有祀分子的 滤液。使用配备有2.6χ 13cm Q Sepharose HP柱并用Unicorn 5.11软件操作的441日 Explorer 100。使用两个缓冲液体系（缓冲液A:10mM Tris.HCl，pH 7.2，和缓冲液8:1〇1111 Tris.HCl，pH 7.2，1M化Cl)进行洗脱。使用在175min内0-20%B的梯度WlOml/min的流速 洗脱祀分子。收集10ml级分。将含有产物的级分合并，在旋转蒸发仪上真空浓缩(水浴<40 °C)至干，并在下一步中使用而无需进一步纯化。
[03化]步骤5 :(2-氨基乙基）4-0-(2-脱氧-2-乙酷氨基-4-0-(β-0-化喃葡萄糖基糖醒 酸)-a-D-化喃葡萄糖基)-β-0-葡糖醒酸二钢盐的合成
[0387]
[0388] 将如步骤4所述获得的（2-Fmoc-氨基）乙基4-0-(2-脱氧-2-乙酷氨基-4-0-(β-0- 化喃葡萄糖基糖醒酸)-a-D-化喃葡萄糖基)-β-0-葡糖醒酸二钢盐溶解在4mL水中并在冰浴 上冷却。在揽拌下添加体积为4mL的纯吗嘟并去除冰浴。在室溫下继续揽拌，直到使用UV 254nm检测的TLC分析(n-BuOH: AcOH:此0 = 3:1:1 (V: V: V))显示起始材料完全消耗。反应在 不到1.化r内完成。将反应混合物用约50mL水稀释，并用50mL化OAc萃取Ξ次。将含有祀分 子的水相在旋转蒸发仪上真空浓缩(水浴<4(TC)并与水共蒸发Ξ次。将残余物再溶解于 lOmL水中并通过在水中预平衡的1克SDB-L SPE柱。通过柱的祀分子没有被保留。用lOmL水 洗涂该柱，并将含有祀分子的合并级分真空浓缩至干(水浴;《40°〇。将获得的剩余物溶解 在1.5mL 1M化OAc，抑7.5中，通过0.2皿旋转过滤器过滤，并^水作为洗脱液在5邱4曰(16义 G-10柱（2^5cm，235mL)上通过大小排阻色谱法脱盐。通过MALDI-TOF MS(基质：5mg/mL ATT;50%乙腊/0.05%Ξ氣乙酸)确认标题物质的结构：636.83曲+化+]。冻干之后，将标题 物质溶解在水中，通过添加氨氧化钢将获得的溶液的抑调节至抑7.0-7.5，并通过巧挫试 验来测定Ξ糖含量(BitterT，MuirHM.AnalBiocheml962年10月；4:330-4)。将获得的储 备溶液进行等分并在-80°C下储存在密封的容器中直到需要使用。
[0389] 从(2-Fmoc-氨基）乙基β-D-葡糖醒酸开始的（2-氨基乙基)4-0-(2-脱氧-2-乙酷氨 基-4-0-(β-0-化喃葡萄糖基糖醒酸)-a-D-化喃葡萄糖基)-β-0-葡糖醒酸的总分离产量为 210mg(0.34mmol，41%)。
[0390] 步骤6:具有胺末端的肝素原多糖的产生
[0391]
[0392] 为了获得具有游离胺基团的肝素原聚合物衍生物化EP-NH2)，在体外W平行方式 使用多杀己斯德氏菌（Pasteurella multocida)肝素原合酶1 (P恤S1 ;DeAngelis&White， 2002J Biol化em)化学酶促合成聚合物链（Sisme厂Ragatz等人，2007 J Biol畑em和 US8088604)。使用大肠杆菌麦芽糖结合蛋白与PmHSl的融合体作为催化剂，W使用如 US2010036001中所述的UDP-GlcNAc和UDP-GlcUA前体W及MnCh催化，使步骤5中获得的（2- 氨基乙基）4-0-(2-脱氧-2-乙酷氨基-4-0-(β-0-化喃葡萄糖基糖醒酸）-a-D-化喃葡萄糖 基)-β-D-葡糖醒酸化EP3-N也)延长为更长的聚合物链。
[0393] 步骤7:具有末端苯甲醒官能团的肝素原多糖的产生
[0394] 为了获得肝素原聚合物衍生物W供经由还原胺化等与祀药物化合物上的可接近 的氨基官能团偶合，将肝素原-N也与N-班巧酷亚胺基-4-甲酯基苯甲酸偶合W形成苯甲醒 修饰的肝素原聚合物。基本上，在一个实例中，将溶解在二甲基亚讽中的N-班巧酷亚胺基- 4-甲酯基苯甲酸（Qiem-Impex，Inc)(在205mL中11.94mg)缓慢添加至62.7g 43.8kDa肝素原 聚合物-N也溶解在380mL 1M憐酸钢(pH 7.0)、2180ml水和1040mL二甲基亚讽中的揽拌溶液 中。将反应混合物在室溫下揽拌过夜，然后在环境溫度下进行醇沉淀。将含有产物的沉淀物 溶解在化的500mM乙酸钢(pH 6.8)中，进一步纯化，随后通过错流过滤进行浓缩。
[0%日]实施例11:肥P-马来酷亚胺和肥P-苯甲醒聚合物的合成
[0396] 使用两种糖核巧酸UDP-GlcNAc和UDP-GlcUA，通过酶促(PmHSl)聚合反应制备规定 大小的马来酷亚胺和醒官能化的皿P聚合物。使用引发Ξ糖(GlcUA-GlcNAc-GlcUA)N也启动 反应，并且运行聚合反应直到糖核巧酸结构单元耗尽。随后用合适的反应性基团将末端胺 (源于引物)官能化，在运种情况下该反应性基团为设计用于与游离半脫氨酸和硫代GSC衍 生物缀合的马来酷亚胺官能团，或设计用于与GSC发生还原胺化化学反应的苯甲醒官能团。 可W通过糖核巧酸：引物化学计量的变化来预先确定肥P聚合物的大小。该技术在US2010/ 0036001中详细描述。
[0397] 可W通过在中性水溶液中使胺官能化的皿P聚合物与过量的N-班巧酷亚胺基-4- 甲酯基苯甲酸(化no 16的6'3(2007)7(8)，口口.2207-2210)反应来制备皿口-苯甲醒。可^通 过离子交换色谱法、大小排阻色谱法或HPLC来分离苯甲醒官能化的聚合物。
[0398] 可通过使胺官能化的皿P聚合物与过量的N-马来酷亚胺基下酷基-氧基班巧酷亚 胺酯（GMBS;Fujiwara，K等人（1988)J Immunol Meth 112,77-83)反应来制备皿P-马来酷亚 胺。
[0399] 可W通过离子交换色谱法、大小排阻色谱法或HPLC分离苯甲醒或马来酷亚胺官能 化的聚合物。本实施例中可W使用任何用末端伯胺官能化的肥P聚合物化EP-N此）。^下示 出了两个选项：
[0400]
[0402] 此外，多糖的非还原端上的末端糖残基可W是N-乙酷基葡萄糖胺或葡糖醒酸 上描绘了葡糖醒酸）。通常，如果在聚合反应中已经使用了等摩尔量的UDP-GlcNAc和UDP- GlcUA，则可W预期两者的混合物。
[0403] 实施例12:具有班巧酷亚胺亚连接的38.8kDa肥P-GSC试剂的合成
[0404]
[040引实施例12(续）
[0406]如下所述通过将GSC-細（[(4-琉基下酷基)甘氨酷基]唾液酸胞巧一憐酸）与皿P- 马来酷亚胺Wl:l摩尔比偶合来制备皿P试剂：向溶解在50mM HepesaOOmM化Cl，pH 7.0 (50μ1)中的GSC-甜(0.50mg)中添加溶解在50mM HepesaOOmM NaCl，pH 7.0(1350μ1)中的 26.38mg 38.8kDa皿Ρ-马来酷亚胺。使澄清溶液在25°C下静置2小时。采用lOkDa的截断值 使用Slide-A-Lyzer盒（Thermo Scientific)通过透析去除过量的GSC-細。透析缓冲液为 50mMHepes，100mMNaCl，10mMCaCl2，pH7.0。将反应混合物在2.5小时内透析两次。回收 的物质原样在实施例14中使用，假设GSC-SH与皿P-马来酷亚胺之间定量反应。通过该程序 制成的肥P-GSC试剂将含有经由班巧酷亚胺连接附接至唾液酸胞巧一憐酸的肥P聚合物。
[0407] 实施例13:具有班巧酷亚胺亚连接的60kDa肥P-GSC的合成
[040引按照与W上针对38.8kDa皿P-GSC描述的类似的方式，使用60kDa肥P-马来酷亚 胺和[(4-琉基下酷基)甘氨酷基]唾液酸胞巧一憐酸制备该分子。
[0409] 实施例14:具有班巧酷亚胺亚连接的38.8kDa肥P-[N]-FIX的合成
[0410] 如下所述合成38.8kDa 皿P-[N]-FIX:向在50mM Hepes，lM 化CiaOmM CaCl2，pH 7.0(6ml)中的去唾液酸 FIX(17.2mg)中添加在 50mM HepesaOOmM NaCiaOmM CaCl2，pH 7.0(1.5ml)中的38.8kDa 皿P-GSC(26.38mg，来自实施例 11)，然后添加在20mM Hepes， 120mM NaCl，50%甘油，pH 7.0(6ml)中的大鼠 ST3GalIII酶（3.3mg; 1.1 单位/mg)。将反应混 合物在32°C下溫育17.5小时。然后添加157mMN-乙酷基神经氨酸胞巧一憐酸在50mM Hepes，150mM化CiaOmM CaCl2，pH 7.0(0.21111)中的溶液，并将反应在32°(：下另外溫育一 小时。然后，基本上如实施例4所述通过亲和和阴离子交换色谱法的组合分离38.8kDa肥P- [N]-FIX。将分离的化合物透析至lOmM His，150mM 化Cl，5mM CaCl2,0.005%吐溫80(pH 6.4)中。如实施例2所述WSDS-PAGE分析缀合物的纯度。在6.2mll0mMHis，150mMNaCl， 5mMCaCl2,0.005%吐溫80(pH6.4)中分离出2.76mg(16%)的38.8kDaHEP-[N]-FIX (0.45mg/ml)。
[0411] 实施例15:具有班巧酷亚胺亚连接的60kDa肥P-[N]-FIX的合成
[0412] 使用如实施例8所述制备的去唾液酸FIX(8.5mg)和如实施例13中制备的60kDa 肥P-GSC(30.0mg)，与实施例14类似地制备该缀合物。在1.5ml lOmM His，150mM化Cl，5mM CaCl2，0.005%吐溫80(pH 6.4)中分离出0.69mg(8% )60kDa 肥P-阳]-FIX(0.45mg/ml)。
[0413] 实施例16:具有4-甲基苯甲酯基亚连接的41.5kDa肥P-GSC试剂的合成
[0414]
[041引实施例16(续）
[0416] 将在5.0ml的50mMHepes，100mM化Cl，10mMCaCl2缓冲液(pH7.0)中的甘氨酷基 唾液酸胞巧一憐酸(GSC) (20mg; 32皿〇1)直接添加至干燥的41.5kDa肥P-苯甲醒(99.7mg; 2.5μπιο1，氮定量）中。轻轻旋转混合物直到所有肥P-苯甲醒均溶解。在接下来的2小时内，分 批(5巧化1)添加氯基棚氨化钢在Mi 11 iQ水中的1Μ溶液，W达到48mM的最终浓度。随后如下 通过透析去除过量的GSC:将总反应体积(5250μ1)转移至透析盒(Slide-A-Lyzer Dialysis 化ssette，Thermo Scientific P;rod#66810，截断值lOkDa，容量：3-12ml)中。将溶液针对 2000ml的25mM Hepes缓冲液(pH 7.2)透析2小时，并再一次针对2000ml的25mM Hepes缓冲 液(pH7.2)透析17h。使用GSC作为参考，在WatersX-化idge苯基柱（4.6mmx 250mm，5皿） 上使用水乙腊体系（在30min内0-85 %乙腊的线性梯度，含有0.1 %憐酸），通过HPLC验证过 量GSC从内室中的完全去除。收集内室物质并冷冻干燥，W得到呈白色粉末的83% (氮定量） 41.5kDa肥P-GSC。通过该程序制成的肥P-GSC试剂含有经由4-甲基苯甲酯基连接附接至唾 液酸胞巧一憐酸的肥P聚合物。
[0417] 实施例17:具有4-甲基苯甲酯基亚连接的21kDa肥P-GSC试剂的合成
[0418] 按照与W上针对41.5kDa皿P-GSC描述的类似的方式，使用21kDa肥P-苯甲醒和 甘氨酷基唾液酸胞巧一憐酸(GSC)制备该分子。冷冻干燥之后产率为78%。
[0419] 实施例18:具有4-甲基苯甲酯基连接的41.5kDa肥P-[N]-FIX的合成
[0420] 向在1ml的lOmM组氨酸，150mM化Cl，3mM CaCl2，pH 6.0(反应缓冲液）中的FIX (12.3mg)中添加16.7μ1在反应缓冲液中1:2000稀释的化S-唾液酸酶(AUS)(在稀释之前为 1.33mg/ml，8抓/mg)，ST3Galin(在20mM 胎pes，120mM NaCl，50%甘油，pH 7.0中为 1.4mg/ ml)至24化g/ml反应混合物的最终浓度，99.化1的41.5kDa肥P-GSC(冻干的化合物在反应 缓冲液中重建为lOOmg/ml的浓度）。用1祉1 0.25M肥1将反应混合物的抑调节至6.0。将反 应混合物在25°C下溫育18小时。在用lOmM组氨酸缓冲液，5mM化Cl2，150mM NaCl pH 6.0平 衡的Source 30Q柱上W流通模式从41.5kDa肥P-[N]-FIX中分离未缀合的FIX、St3Gaim 和唾液酸酶。采用洗脱缓冲液（lOmM组氨酸，5mM CaCl2，lM化Cl，pH 6.0)的0-100%梯度经 20个柱体积洗脱41.5kDa肥P-阳]-FIX。将N-乙酷基神经氨酸胞巧一憐酸和St3Gaini添加 至洗脱出的合并物中至最终浓度分别为〇.8mg/m巧日化g/ml，并将反应混合物在25°C下溫育 3小时。然后，除使用不同的缓冲液W外，基本上如实施例4所述，通过亲和色谱法纯化 41.化Da肥P-[N]-FIX。使用W下缓冲液:缓冲液A:50mM组氨酸aOOmM化CiaOmM CaCl2， pH6.2;缓冲液B:50mM组氨酸，100mMNaCl，20mM抓TA，pH6.2。将分离的化合物透析至 10mMHis，150mMNaCl，5mMCaCl2,0.005%吐溫80，pH6.4中。在6.0ml的10mMHis，150mM 化Cl，5mMCaCl2,0.005%吐溫80，pH6.4中分离出0.926mg(7.5%)的41.5kDa皿P-[N]- FIX(0.15mg/ml)。
[0421] 实施例19:具有4-甲基苯甲酯基连接的21kDa肥P-[N]-FIX的合成
[0422] 使用去唾液酸FIX和来自实施例16的21kDa肥P-GSC，W与实施例18中描述的类似 的方式合成该化合物。最终的缀合物含有经由4-甲基苯甲酯基连接附接至FIX的皿P聚合 物。
[0423] 实施例20:具有4-甲基苯甲酯基连接的基于神经氨酸胞巧一憐酸的41.5kDa皿P 缀合物的合成
[0424]
[04巧]如Eur J 0巧化em.2000,1467-1482中所述产生神经氨酸胞巧一憐酸。如实施例 16所述，将GSC替换成神经氨酸胞巧一憐酸，进行与皿P-醒的反应。将神经氨酸胞巧一憐酸 (32皿〇1)溶解在50mM HepesaOOmM NaCiaOmM CaCb缓冲液，pH 7.0缓冲液中，并直接添 加至干燥的41.5kDa皿P-苯甲醒(2.5皿〇1)中。轻轻旋转混合物直到所有肥P-苯甲醒均溶 解。在接下来的2小时内，分批添加氯基棚氨化钢在Mi 11 iQ水中的1M溶液，W达到48mM的最 终浓度。随后如实施例16所述通过透析去除过量的神经氨酸胞巧一憐酸。使用神经氨酸胞 巧一憐酸作为参考，在WatersX-化idge苯基柱（4.6mmx 250mm，5皿)上使用水乙腊体系 (在30min内0-85%乙腊的线性梯度，含有0.1 %憐酸），通过HPLC验证神经氨酸胞巧一憐酸 从内室中的完全去除。随后收集内室物质并将其冷冻干燥。通过该程序制成的试剂含有经 由4-甲基苯甲酯基连接附接至唾液酸胞巧一憐酸的肥P聚合物。
[0426] 实施例21:具有4-甲基苯甲酯基连接的基于9-氨基-9-脱氧-N-乙酷基神经氨酸胞 巧一憐酸的肥P缀合物的合成
[0427]
[0428] 如化r J Biochem 168,594-602(1987)中所述产生9-脱氧-氨基-N-乙酷基神经氨 酸胞巧一憐酸。如实施例15所述，将GSC替换成9-氨基-9-脱氧-N-乙酷基神经氨酸胞巧一憐 酸，进行与肥P-醒的反应。将9-氨基-9-脱氧-N-乙酷基神经氨酸胞巧一憐酸（32μπιο1)溶解 在50mM胎pesaOOmM NaCiaOmM GaGb缓冲液，pH 7.0缓冲液中，并直接添加至干燥的 41.5kDa肥P-苯甲醒(2.5μπιο 1)中。轻轻旋转混合物直到所有皿P-苯甲醒均溶解。在接下来 的2小时内，分批添加氯基棚氨化钢在Mi 11 iQ水中的1Μ溶液，W达到48mM的最终浓度。随后 如实施例16所述通过透析去除过量的9-氨基-9-脱氧-N-乙酷基神经氨酸胞巧一憐酸。使用 9-氨基-9-脱氧-N-乙酷基神经氨酸胞巧一憐酸作为参考，在Waters X-化idge苯基柱 (4.6mm X 250mm，5皿)上使用水乙腊体系(在30min内0-85%乙腊的线性梯度，含有0.1%憐 酸），通过HP1X验证9-氨基-9-脱氧-N-乙酷基神经氨酸胞巧一憐酸从内室中的完全去除。收 集内室物质并将其冷冻干燥。通过该程序制成的试剂含有经由4-甲基苯甲酯基连接附接至 唾液酸胞巧一憐酸的肥P聚合物，并适合与去唾液酸FIX糖蛋白的糖缀合。
[0429] 实施例22:具有4-甲基苯甲酯基连接的基于2-酬基-3-脱氧-壬酬糖酸胞巧一憐酸 的HEP缀合物的合成
[0430]
[0431] 可W采用与实施例20和21中所示的方式类似的方式，从唾液酸KDN开始，制备肥P- 唾液酸胞巧一憐酸试剂。如Eur J化g化em 2000,1467-1482中所述进行9-位的初始氨基 衍生化。如实施例16所述，将GSC替换成9-氨基-9-脱氧-2-酬基-3-脱氧-壬酬糖酸胞巧一憐 酸，进行与皿P-醒的反应。将9-氨基-9-脱氧-2-酬基-3-脱氧-壬酬糖酸胞巧一憐酸（3化 mol)溶解在50mM胎pesaOOmM化CiaOmM CaCb缓冲液，pH 7.0缓冲液中，并直接添加至 干燥的41.5kDa肥P-苯甲醒(2.5μπιο1)中。轻轻旋转混合物直到所有肥P-苯甲醒均溶解。在 接下来的2小时内，分批添加氯基棚氨化钢在Mi 11 iQ水中的1Μ溶液，W达到48mM的最终浓 度。随后如实施例15所述通过透析去除过量的9-氨基-9-脱氧-2-酬基-3-脱氧-壬酬糖酸胞 巧一憐酸。使用9-氨基-9-脱氧-2-酬基-3-脱氧-壬酬糖酸胞巧一憐酸作为参考，在Waters X-化idge苯基柱(4.6mm X 250mm，5皿)上使用水乙腊体系(在30min内0-85%乙腊的线性梯 度，含有0.1 %憐酸），通过HPLC验证9-氨基-9-脱氧-N-乙酷基神经氨酸胞巧一憐酸从内室 中的完全去除。收集内室物质并将其冷冻干燥。通过该程序制成的试剂含有经由4-甲基苯 甲酯基连接附接至唾液酸胞巧一憐酸的皿P聚合物，并适合与去唾液酸FIX糖蛋白的糖缀 厶 1=1 〇
[0432] 实施例23:在FIX缺乏的小鼠中静脉内给药的60kDa皿P-[C]-FIX化162C)与rFIX 和40kDa阳G-[N]-FIX相比的药代动力学
[0433] 在静脉内给予27nmol/kg(等于 1.5mg FIX/kg)的rFIX(BeneFIXK )、4〇kDa 阳G- [N]-FIX或60kDa皿P-[C]-FIX化162C)后，在45只FIX缺乏的小鼠 F9(因子9)敲除化0)小鼠 (最初从D. W. S化f ford(北卡罗来纳大学)获得的皿小鼠（B6.129P2-ratmlDws))中进行药代 动力学研究。在尾静脉中W5ml/kg施用剂量，并按稀疏采样设计经由毛细玻璃管从眶窦收 集血液，得到每只小鼠3个血液样品，在给药后0.08、0.25、0.5、1、4、7、17、24、30、42、48、54、 72、78、96小时的每个时间点对Ξ只小鼠采样。在将血浆送去分析之前，将血液用巧樣酸盐 稳定化，并用pH 7.4的化pes和BSA缓冲液1:4稀释，并在4000RPM下离屯、5分钟。
[0434] 采用抗原试验化0CI)、显色活性试验W及通过凝固试验来测定FIX的血浆浓度，结 果示于图6中并且药代动力学参数示于表2中。
[0435] 基本上按照P〇ulsen，F&Jensen KB，J Biomol Screen 2007; 12(2) :240-7描述的 人膜岛素 LOCI建立hFIX的LOCI试验。简而言之，该试验为基于珠子的夹屯、式免疫测定，它具 有用于定量人血浆中的hFIX的宽分析范围。进行两步反应，将样品与生物素化的抗FIX抗体 和用抗FIX抗体共价包被的珠子的混合物一起溫育。此后与用链霉亲和素共价包被的珠子 一起溫育30min。对由珠子内的化学发光反应生成的光进行定量。FIX LOCI试验中使用的抗 体为内部生产的Novo Nordisk单克隆抗FIX抗体和来自LifeSpan BioSciences，Inc.的多 克隆山羊抗hFIX抗体化S-B7226)。
[0436] 商业显色测定试剂盒来自Hypen Biophen(Hy地en Biomed(#221805))。简而言之， 通过添加激活的因子XI(FXIa)、Ca2\憐脂和激活的因子II(FIIa)将来自样品的FIX激活为 FIXa。随后在化的存在下FIXa与提供的因子VIII(FVIII)和憐脂复合。Tenase复合物将因 子X(FX)激活成因子Xa(FXa)。形成的FXa与SXa-11反应并释放pNAdpNA吸收405nm的光。除了 FIXW外，所有试剂均过量添加。因此，样品中FIX越多，形成的FXa越多，并且释放的pNA越 多。
[0437] 使用0stergaard等人Blood，2011; 118:2333-41描述的一期FIX凝固试验估计血 浆样品中的凝结剂活性。该试验测量了依赖FIX活性的纤维蛋白凝块形成时间。简而言之， 使用等量的测试样品、人FIX缺乏的血浆、APTT试剂(Synthafax)和CaCl2(0.02M)。将血浆样 品在含BSA的肥PES缓冲液中稀释10或20倍。在血浆样品（稀释10倍）中定量的下限为约70U/ L。仪器和试剂来自 Inst;rumen1:ation Laboratories。
[0438] 表2-FIX变体在向F9-K0小鼠静脉内施用后的平均药代动力学参数
[0439]
[0441] 基于稀疏采样，W非房室分析计算所述参数，n = 3Xmax:最大浓度，AUCo-?:曲线下 面积，Vz:分布体积，α:清除率，MRT:平均停留时间。
[0442] 在FIX缺乏的小鼠中，60kDa肥P-[C]-FIX巧162C)与40kDa阳G-[N]-FIX的平均血 浆分布W及药代动力学参数是相当的（图6和表2)。根据该试验和终末消除阶段高于定量下 限化L0Q)的数据点的数目，60W)a肥P-[C]-FIX化162C)的半衰期是rFIX的半衰期的约2至 10倍。与rFIX的清除率相比，60kDa肥P-[C]-FIX巧162C)和40kDa阳G-[N]-FIX的清除率大 约降低了 20倍。
[0443] 图6显示了F9-K0小鼠中相对于时间的血浆rFIX和FIX缀合物浓度。通过基于抗原 的试验(a) W及分别基于凝固活性和显色活性的试验(b)和(C)，随时间测量该浓度。结果为 半对数图中的平均值± SD，η = 3。
[0444] 实施例24:在FIX缺乏的小鼠中静脉内给予13kDa-、21kDa-、27kDa-和40kDa皿Ρ- FIX的药代动力学
[0445] 在静脉内给予27nmol/kg(等于 1.5mg FIX/kg)的 13kDa 皿P-[C]-FIX化 162C)、 21kDa 肥P-[N]-FIX、27kDa 肥P-[C]-FIX(E162C)、40kDa 皿P-[N]-FIX和40kDa 皿P-[C]- FIX化162C)后，在75只FIX缺乏的小鼠（F9-K0小鼠）中进行药代动力学研究。该研究如实施 例23所述进行。采用抗原试验化OClKa)和显色活性试验(b)分析血浆，结果示于图7中，并 且药代动力学参数示于表3(还包含来自实施例23的关于rFIX和60kDa HEP-[C]-FIX 化162C)的数据(斜体供比较）中。结果为半对数图中的平均值±50，11 = 3。
[0446] FIX变体的清除率似乎随着缀合的肥P聚合物的大小而降低。如在抗原试验中测得 的（参见表3)，与大小为13至60kDa的皿P聚合物缀合使半衰期与rFIX相比增加到32至40小 时。
[0447] 表3-与13、20、27、40和60403皿口聚合物缀合的。1乂在向。9-1(0小鼠静脉内施用后 的平均药代动力学参数 [044引
[0450]基于稀疏采样，W非房室分析计算所述参数，n = 3Xmax:最大浓度，AUCo-w曲线下 面积，Vz:分布体积，α:清除率，MRT:平均停留时间。
[0451 ] 实施例25:60kDa肥P-[C]-FIX化162C)在F9-K0小鼠中的剂量响应
[0452] 在F9-K0(因子IX敲除）小鼠（最初从D.W. Stafford(北卡罗来纳大学）获得的皿小 鼠（B6.129P2-F9tml Dws))的尾静脉横切(TVT)模型中比较60kDa皿P-[C]-FIX化162C)和 FIX(Novo Nordisk A/S)的作用。简而言之，向F9-K0小鼠给予剂量逐渐增加的60kDa肥P- [C]-FIX化162C)、rFIX或载体（5ml/kg;20mMHepes，150mMNaCl，0.5%BSApH7.4)，并在 10分钟后通过在尾直径2.5mm处进行模板引导的左侧尾静脉横切而引起出血。将尾部浸入 溫盐水(37°C)中，W允许视觉记录出血60min，之后通过分光光度法测量损失的血红蛋白的 量来测定失血量。从而，通过W4000xg离屯、5min分离红细胞。弃去上清液，并用血红蛋白试 剂（ABX Lysebio;ABX Diagnostics no.906012，T;riolab A/S，B;roen化y，Denmark)裂解细 胞。通过W4000xg离屯、5min去除细胞碎片。在55化m下读取样品，并由标准曲线化emo化e校 准物707037，HemoQie，Ve化aek，Denmark)确定血红蛋白的总量。
[0453] 60kDa皿P-[C]-FIX化162C)显著地且剂量依赖性地减少了失血，在O.lmg/kg下达 到归一化（口<0.001;11 = 8)。运与评1乂的效果相当。因此，6040曰皿？-[(：]斗1乂化162〇和 rFIX的效力分别与0.012和0.03mg/kg60kDa肥P-[C]-FIX巧162C)和rFIX的估算的邸50相当 (p = 0.38;图8;表4)。图8显示了60kDa 肥P-[C]-FIX E162C(FIX-肥P)和rFIX如何剂量依赖 性地且显著地减少F9-K0小鼠在尾静脉横切后的失血，它们具有相当的效力。类似地，60W)a 肥P-[C]-FIX化162C)和巧IX对出血时间的影响是相当的，显著且剂量依赖性地缩短了出血 时间，而两种化合物的抓5〇(分别为0.009和0.024mg/kg;p = 0.18;图9;表4)没有显著性差 异。图9显示了60kDa皿P-[C]-FIX E162C(FIX-肥P)和rFIX如何剂量依赖性地且显著地缩 短F9-K0小鼠在尾静脉横切后的出血时间，它们具有相当的效力。F9-K0小鼠在诱导出血前 lOmin 给药。FIX-肥 P 和 rFIX 的邸日日分别为 0.009mg/kg 和0.024111旨/1^(9 = 0.18)。*、**和***分 别表示与接受载体的血友病对照相比在P<0.05、p<0.01和p<0.001下的统计学显著性差 异。数据为平均值±561式9-1(0小鼠在诱导出血前lOmin给药。FIX-HEP和rFIX的抓50分别为 0.012mg/kg和0.030mg/kg(p = 0.38)。*和***分别表示与接受载体的血友病对照组相比在P <0.05和p<0.001下的统计学显著性差异。数据为平均值±861。
[0454] 表4-在F9-K0小鼠中60kDa肥P-[C]-FIX E162C(FIX-肥P)和rFIX剂量依赖性地减 少了失血和出血时间。
[0455]
[0456] 60kDa皿P-[C]-FIX E162(X皿P-FIX)和rFIX剂量依赖性地且显著地减少了F9-K0 小鼠在尾静脉横切之后的失血和出血时间。F9-K0小鼠在诱导出血前lOmin给药。*、**和*** 分别表示与接受载体的血友病对照组相比在P<0.05、p<0.01和p<0.001下的统计学显著 性差异。'化em'表示用对照载体处理的F9-K0小鼠。C57/化表示用对照载体处理的野生型小 鼠。
[0457] 实施例26:40W)a肥P-[N]-FIX在F9-K0小鼠中的剂量响应
[045引在F9-K0(因子IX敲除）小鼠（最初从D.W.S化fford(北卡罗来纳大学)获得的B型血 友病小鼠（B6.129P2-F9tmlDws))的尾静脉横切（TVT)模型中比较40kDa皿P-[N]-FIX和 rFIX(Novo Nordisk A/S)的作用。简而言之，向F9-K0小鼠给予剂量逐渐增加的40kDa肥P- [N]-FIX、rFIX或载体（5ml/kg; lOmM组氨酸，150mM 化C1，5mM CaCb，0.005 % 吐溫80，pH 6.4)，并在10分钟后通过在尾直径2.5mm处进行模板引导的左侧尾静脉横切而引起出血。将 尾部浸入溫盐水(37°C)中，W允许视觉记录出血60min，之后通过分光光度法测量损失的血 红蛋白的量来测定失血量。从而，通过W4000xg离屯、5min分离红细胞。弃去上清液，并用血 红蛋白试剂（ABX Lysebio;ABX Dia即ostics no.906012，T;riolab A/S，B;roendby， Denmark)裂解细胞。通过W4000xg离屯、5min去除细胞碎片。在550nm下读取样品，并由标准 曲线巧emo化e校准物707037，Hemo化e，Ve化aek，Denmark)确定血红蛋白的总量。
[0459] 40kDa肥P-[N]-FIX和rFIX均显著且剂量依赖性地减少了失血，在0.2mg/kg时达 到完全响应。通过双因素 AN0VA分析，没有观察到在所述化合物的作用之间有显著性差异(P =0.1924)，但检测到显著的。<0.0001)剂量效应。因此，4040曰肥?-^]斗凹和巧^的效 力是相当的，且分别在估算的抓50值〇.〇32mg/kg与0.027mg/kg之间没有显著性差异（p = 0.69;图10,表5)。
[0460] 图10显示了40kDa皿P-[N]-FIX和rFIX如何剂量依赖性地且显著地减少F9-K0小 鼠在尾静脉横切后的失血，它们具有相当的效力。
[0461 ] F9-K0小鼠在诱导出血前lOmin给药。40kDa HEP-[N]-FIX和rFIX的抓50分别为 0.032mg/kg和0.027mg/kg(p = 0.67)。*林和*林*分别表示与接受载体的血友病对照相比在 p<0.001和p<0.0001下的统计学显著性差异。数据为平均值± SEM。
[0462] 类似地，40kDa HEP-[N]-FIX和rFIX对出血时间的影响是相当的：通过双因素 AN0VA，没有观察到在所述化合物的作用之间有显著性差异(P = 0.82)，但检测到显著的（P <0.0001)剂量效应。因此，观察到40403肥?-^]斗^和评^显著地且剂量依赖性地缩短 了出血时间，其中估算的邸5诚有显著性差异(分别为0.028和0.034mg/kg;p = 0.57;表5)。
[0463] 表5-在F9-K0小鼠中40kDa皿P-[N]-FIX和rFIX剂量依赖性地减少了失血和出血 时间
[0464]
[04化]**、***和*林*分别表示与接受载体的血友病对照组相比在ρ<0.01、ρ<0.0(Π 和P <0.001下的统计学显著性差异。'化em'表示用对照载体处理的F9-K0小鼠。
[0466] 实施例27:肥P-因子IX缀合物在一期凝固试验中的性能
[0467] 根据使用的aPTT试剂，蛋白质的聚乙二醇化可能影响在一期凝固试验中的凝固时 间化eong等人J Thromb Haemost 2011;9(增刊2):379(P-TU-223))，并且对于N9-GP (nonacog beta pegol;糖基聚乙二醇化重组FIX),聚乙二醇化可能导致此类试验中大的变 异性。
[0468] 如下所述在五个不同的一期凝固试验和一个两期显色试验中评估肥P-FIX缀合物 相对于Benenxi"和N9-GP的性能。将Ξ种浓度（分别为5、15和45nM)的W下FIX化合物渗 加到人 FIX 耗尽的血浆（Affinity Biologicals)中：2化Da 皿 P-[C]-FIX 化 162C)、40kDa 肥P-[N]-FIX、40kDa HEP-[C]-FIX化 162C)、60kDa 肥？-[(：]斗1乂化162〇、脚-6口和 BeneFIX'-'。根据制造商的说明（Hyphen Biomed)，使用两期显色试验，Biophen因子IX，测 量渗加的样品的FIX活性。将该结果定义为100%活性，因为该显色试验对于聚合物附接是 无色的（neutral)。
[0469] 使用W下aPTT试剂在一期凝固试验中测量相同样品的凝固活性:DadeA地n?FS (Siemens)、STAPTT面（Stago)、APTT SP(ILS)、Syn化afax'gi(ILS)、Synthasii昏（ILS)。简 而言之，使用等量的测试样品、人FIX缺乏的血浆、APTT试剂和化Ch(〇.〇2M)。该试验测量了 在来自ILS的血凝分析仪上测得的依赖FIX活性的纤维蛋白凝块形成时间。使用已针对国际 血浆标准(NIBSC)校准的一组正常人血浆（ILS)作为校准物。将测得的活性与显色试验中测 得的活性进行比较并W显色活性的百分比给出结果。
[0470] 结果:如通过显色方法所确定的，通过计算在渗加的人样品中FIX活性的恢复率来 评估HEP-FIX缀合物在一期凝固试验中的性能。结果列于表6中并在图11中示出。 BeneFIX"的性能正如预期;观察到一些变化，但采用全部五种aPTT试剂的FIX活性的恢复 率均为89-122% (即33个百分点）。另一方面，在使用五种aPTT试剂的情况下，N9-GP活性的 恢复率显示大的变异性和30 %至553 %的恢复率范围（即523个百分点）。肥P-FIX缀合物活 性的恢复率在32-147%范围内（即115个百分点），并且对于运五种aPTT试剂，肥P-FIX缀合 物的试验性能与N9-GP的试验性能相比因此得到改善。皿P聚合物的长度和FIX上的聚合物 附接点均不会很大地影响试验性能。表6和图11显示了在渗加的人FIX缺乏的血浆中的FIX 活性相对于显色活性的恢复率。将Ξ种浓度(分别为5、15和45nM)的化合物渗加到人FIX耗 尽的血浆中，并使用Biophen Hypen显色试验和在一期凝固试验中的五种指定的aPTT试剂 进行分析。结果W凝固活性占显色活性的百分比给出，并且为平均值+/-SD，n = 3。在所有试 验中针对正常人血浆校准物(ILS)测量活性。
[0471 ]表6-在渗加的人FIX缺乏的血浆中的FIX活性相对于显色活性的恢复率。
[0472]
[0474] 实施例28:40W)a肥P-[N]-FIX在F9-K0小鼠中的作用持续时间
[0475] 在F9-K0(因子IX敲除）小鼠（最初从D.W.S化fford(北卡罗来纳大学)获得的B型血 友病小鼠（B6.129P2-F9tmlDws))的尾静脉横切（TVT)模型中比较40kDa皿P-[N]-FIX和 rFIX(Novo Nordisk A/S)的作用持续时间。简而言之，向F9-K0小鼠给予0.4mg/kg(约80IU/ kg)的40kDa肥P-阳]-FIX，等效剂量的rFIX或载体（5ml/kg; lOmM组氨酸，150mM化C1，5mM CaCl2，0.005 %吐溫80，pH 6.4)。在给药后0、48、72、120或168小时通过在尾直径2.5mm处进 行模板引导的左侧尾静脉横切来引起出血。将尾部浸入溫盐水(37°C)中，W允许视觉记录 出血60min，之后通过分光光度法测量损失的血红蛋白的量来测定失血量。从而，通过W 4000xg离屯、5min分离红细胞。弃去上清液，并用血红蛋白试剂（ABX Lysebio;ABX Dia即osticsno.906012，T;riolabA/S，B;roen化y，Denmark)裂解细胞。通过?4000xg离屯、 5min去除细胞碎片。在550nm下读取样品，并由标准曲线化emoCue校准物707037，HemoCue， Ve化aek，Denmark)确定血红蛋白的总量。
[0476] 观察对失血的时间依赖的效应（图12);通过用于多重比较的采用Bonferroni校正 的单因素 AN0VA进行统计分析(表7)。与载体组相比，在给药后0小时，40W)a肥P-阳]-FIX和 rFIX均显著(P<0.0001)减少了在急性情况下的失血。在给药后48小时(P = 0.0012)和72小 时(P = 0.0028)，用40k-HEP-[N]-FIX处理的动物的出血也显著少于载体处理的动物，而用 rFIX处理的动物却不是运样。在注射后72小时，出血响应在所述化合物之间显著不同（P = 0.020)。在给药后168小时，不再能检测到运两种化合物的作用。
[0477] 类似地，观察40kDa肥P-[N]-FIX和巧IX对出血时间的影响（表7)。与载体组相比， 在给药后0小时，40kDa肥P-[N]-FIX和rFIX均显著(P<0.0001)缩短了出血时间，并且在给 药后48小时（P = 0.0060)和72小时(P = 0.0041)，40kDa-皿P-[N]-FIX缩短了出血时间，而 rFIX却不能。在注射后72小时，出血时间在所述化合物之间显著不同（P = 0.022)。在给药后 168小时，不再能检测到运两种化合物的作用。
[0478] 因此，40kDa-HEP-[N]-FIX和rFIX在给药后立即表现出相当的止血作用，然而 40kDa-HEP-[N]-FIX的作用比相当剂量的rFIX持续显著更长的时间。
[0479] 虽然本文已说明并描述了本发明的某些特征，但本领域普通技术人员现将想到许 多修改、替换、变化和等同项。因此，应当理解，所附权利要求旨在涵盖落入本发明的真正范 围之内的所有运样的修改和变化。
[0480] 表7-0.4mg/kg剂量的40kDa肥P-[N]-FIX对失血和出血时间的作用比相当剂量的 rFIX具有显著更长的持续时间
[0481]
[0482] 等效剂量(0.4mg/kg或约80IU/kg)的40kDa肥P-[N]-FIX或rFIXW时间依赖的方 式减少了F9-K0小鼠在尾静脉横切后的失血和出血时间。**、***和****分别表示与接受载 体的血友病对照组相比在p<〇. 01、p<〇 .001和p<〇 .0001下的统计学显著性差异。'化em' 表示用对照载体处理的F9-K0小鼠 。NT =未测试。
【主权项】
1. 一种缀合物，其包含因子IX多肽、连接部分和肝素原聚合物，其中连接所述因子IX多 肽与所述肝素原聚合物的所述连接部分包含X，如下所示： [肝素原聚合物]-[X]-[因子IX多肽] 其中X包含将根据以下式1的部分与所述因子IX多肽连接的唾液酸衍生物：2. 根据权利要求1所述的缀合物，其中所述唾液酸衍生物为根据以下式2的甘氨酰基唾 液酸：并且其中式1的部分与式2的末端-NH柄连接。3. 根据权利要求1或2所述的缀合物，其中所述 [肝素原聚合物]-[X]- 包含以下式3所示的结构片段：其中η为5到450的整数。4. 一种缀合物，其包含因子IX多肽和肝素原聚合物，其中所述肝素原聚合物具有在5至 IOOkDa范围内的分子量。5. 根据权利要求4所述的缀合物，其中所述肝素原聚合物具有在13至60kDa范围内的分 子量。6. 根据权利要求4所述的缀合物，其中所述肝素原聚合物具有在27至40kDa范围内的分 子量。7. 根据权利要求4所述的缀合物，其中所述肝素原聚合物的分子量为40kDa+/-10%。8. -种药物组合物，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的缀合物。9. 与因子IX多肽缀合的肝素原聚合物在aPTT试验中的用途，其中因子IX活性的恢复率 的试验间变异性小于523个百分点。10. 根据权利要求9所述的与因子IX多肽缀合的肝素原聚合物的用途，其中因子IX活性 的恢复率的试验间变异性不大于115个百分点。11. 根据权利要求1至7中任一项所述的缀合物，其用作药物。12. 根据权利要求1至7中任一项所述的缀合物，其用于B型血友病的治疗。13. 根据权利要求1至7中任一项所述的缀合物，其用于B型血友病的预防性治疗。14. 一种将肝素原聚合物与因子IX多肽缀合的方法，其包括以下步骤： a) 使包含反应性胺的肝素原聚合物[HEP-NH]与激活的4-甲酰基苯甲酸反应，以产生以 下式4的化合物，其中所述[HEP-NH]为用末端伯胺官能化的HEP聚合物， b) 使式4的化合物与CMP激活的唾液酸衍生物在还原条件下反应，以及 c) 将步骤b)中获得的化合物与所述因子IX多肽上的聚糖缀合。15. 使用根据权利要求14所述的方法能够获得的缀合物。
【文档编号】A61P7/02GK106029106SQ201580008256
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2015年2月12日
【发明人】C.贝伦斯, P.迪安格里斯, F.M.哈尔勒
【申请人】诺和诺德保健股份有限公司