专利名称：循环的组织因子的体外测定方法及其用于检测凝血性疾病的用途的制作方法
循环的组织因子的体外测定方法及其用于检测凝血性疾病
的用途本发明涉及止血领域，特别是与组织因子的异常表达相关的凝血病症以及与该因子的超表达相关的生理病理学现象。本发明涉及测定生物学样本中循环的组织因子活性的方法。本发明的方法在体外进行，特别是对取自患者的血样或者由所获取的血样制备的样本进行。本发明的方法优选地在血浆介质中进行。有利地，本发明方法使用显色类型的测定。组织因子是体内凝血的主要激活物，为一种47kDa的跨膜糖蛋白，它与因子VII或 VIIa结合而形成组织因子-因子VIIa复合物，该复合物通过激活因子IX和X，引发凝血的激活，从而导致凝血酶的产生和纤维蛋白的形成。真正凝血的开始需要因子VII与其特异性表面蛋白受体即组织因子结合，组织因子由一定数量的细胞或其组件表达(血管内皮细胞、单核细胞-巨噬细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、上皮细胞、细胞来源的微粒，从单细胞来源的微粒分子转移后的血小板、赘生性细胞)。组织因子-因子VIIa复合物的活性不仅与正常的止血相关，而且也与由恶性疾病、急性冠状动脉综合征和重度脓毒症引起的血栓形成的发作相关。组织因子途径抑制剂(tissue factor pathway inhibitor, TFPI)保证了维持止血平衡中的这一关键活性的调控。这种抑制剂TFPI并不是使组织因子失活，而是使组织因子-因子VIIa复合物的催化活性失活。首先，TFPI与因子结合，然后抑制因子叙；接着，Xa/TFPI复合物可与因子Vila-组织因子复合物结合而形成四聚体的因子fe/ TFPI/因子VIIa/组织因子复合物，其中，因子叙、因子VIIa和组织因子不再具有活性。这样，TFPI就限制了由组织因子(TF)的表达所诱导的凝血的激活，在凝血的初始分子事件之前，强加一种初始阶段来克服，实际上能够诱导凝血级联反应的激活。因此，TFPI使得组织因子可以低噪音地暴露而不会有促凝血后果。TFPI由内皮细胞和血小板合成。在生理条件下，组织因子的表达很广泛，它存在于多种类型的细胞表面上，但是不存在于与循环血直接接触的细胞(内皮细胞和成形血液成分(elements figres du sang)) 的表面上。血管、心肌、粘液组织和表皮组织的外膜中富含组织因子。动脉粥样硬化斑块上的血栓形成会导致急性缺血性动脉疾病，它与组织因子的病理性暴露有很密切的关系。动脉粥样硬化斑块的血栓发生与存在的组织因子的数量相关， 在斑块破裂的情况下，所述存在的组织因子在相当程度上促进了血栓发生的过程。类似地， 在脓毒症中，组织因子可由单核细胞和内皮细胞表达，并导致弥散性血管内凝血。还在来源于细胞膜的微粒表面识别到了组织因子。已在动脉粥样硬化斑块中识别到了这种来源于单核细胞和淋巴细胞的微粒。它们具有促凝血活性，来源于凋亡的细胞。除了其促凝血活性之外，现在还认为组织因子是对多种细胞群具有与激素相似的功能的蛋白(1)。因此，例如，已表明组织因子能够增强血管内皮生长因子(VEGF)的产生，并能在体内和体外诱导血管生成。
组织因子还能刺激细胞迁移，已经报道了组织因子参与肿瘤转移和与肿瘤相关 的血管生成中的血管壁的组织化和完整性(2)。因此，目前已经清楚地知道组织因子与多种生理病理环境相关，出于这一原因，必须要有可用的测定方法，该测定方法不仅能够在血栓形成风险的条件下追踪组织因子活性的变化，还能够监测某些病理情况特别是癌症的进程。用于测定血液或血浆中的组织因子的常规方法为免疫学方法，例如ELISA类的方法，这类方法仅测量抗原，因此是定量测定而不是定性测定。在现有文献中已经说明了多种活性测试方法，其中大多数都是使用利用(3)中所述的原理的精密计时方法(测量凝块形成的时间)，由细胞提取物开始而进行的。其它TF活性测试方法包括在存在激活的因子VII (FVIIa)和钙以及因子Xa的特异性底物的条件下评估激活的因子X(FXa)的产生。因此，这种测试包括测量TF-FVIIa复合物将FX激活为FXa的能力。FX的这种激活可以通过水解的底物的数量来计算，例如当使用能够在水解后产生显色基团的底物时，使用显色方法。基于该方案的大多数活性测试均针对被除去纤维蛋白即经处理而防止纤维蛋白单体聚合的血浆样本进行，这种聚合会在进行测试时干扰所进行的光学测量。然而，该在先步骤使这类测试的自动化变得复杂，并且使测试必须分两个阶段进行。而且，现有技术的活性测试没有考虑到血浆中TFPI数量的变化，这也会曲解所测的TF的实际活性，从而提供关于与TF计数相关的患者血栓发生的潜在可能的错误信息。本发明旨在解决现有技术的测试所遇到的问题。为此目的，提出了对循环的组织因子活性进行单步骤测定的方法，在该方法中，消除了 TFPI对组织因子的抑制作用。实际上，本发明包括在存在纤维蛋白聚合抑制剂和抑制TFPI对组织因子的作用的化合物的条件下，在生物学样本中对循环的组织因子的活性进行体外测定。更准确地说，当向测试生物学样本、纤维蛋白聚合抑制剂和TFPI对TF的作用的抑制剂所形成的反应介质中加入过量的凝血因子VII和X时，本发明允许测量循环的组织因子的活性所产生的因子Xa。本发明还涉及在生物学样本中对循环的组织因子进行单步骤体外测定的方法，所述方法基于循环的组织因子在存在过量的因子VII和X的条件下产生因子Xa的能力。进行本发明方法所使用的生物学样本为从个体采样而得到的样本。所述样本优选地为血液样本，更优选地为血浆样本。然而，本发明的方法也可用于尿样或脑脊液(liquide c印halo-rachidien，LCR) 或其他生物学样本。本发明的方法优选地为酶学方法，其中通过测量该因子对特异性底物的水解活性而测定所形成的Xa的量。特别是，所述底物为酶促底物，可为天然的或合成的。优选地，所述底物能够测定因子Xa的酰胺分解活性。特别是，所述底物为显色底物或荧光底物。这类显色底物为，例如Diagnostica Stago的CBS 5244(其他可能的供应商 American Diagnostica ；Biopep SA ；Kabi Vitrum ；Biogenic ；Biophen ；Chromogenix)。
通过测定水解底物的量来计算所产生的因子fe的量(并由此测量循环的组织因子的活性)。所述测定可以根据所选择的底物，通过测量反应混合物在读数窗中的光密度的变化而进行。在本发明的一个具体实施方案中，在合适的缓冲液中稀释由取自患者的生物学样本所获得的血浆。所述缓冲液可以是例如止血测试常用的Owren Koller缓冲液。所得的稀释度依赖于测试样本的性质和所用底物的灵敏度。对于血浆样本，有利的是，稀释范围为1/2至1/20，优选范围为1/2至1/4。钙离子例如可以以CaCl2的形式提供。纤维蛋白聚合抑制剂选自本领域常用的化合物。具体而言，它为多肽抑制剂，例如寡肽GPRP. AcOH,其商品名为Pefabloc，由 Pentapharm i^i"共。用于该反应介质中的所述抑制剂的浓度可为5_25g/L，这根据测试血浆的稀释度进行选择。例如，当将血浆以1/3稀释至，有利的是，所用的所述抑制剂的浓度为10g/L，即终浓度范围为0. 666g/L至3. 33g/L，特别是1. 332g/L。虽然Pefabloc构成了本发明方法中的优选的纤维蛋白聚合抑制剂，但也可以使用其他类型的抑制剂，例如抗纤维蛋白原抗体。 TFPI抑制剂为这样的化合物，它能够抑制TFPI对循环的TF的抑制作用，从而使得 TF的定量测定不致受到样本中存在的TFPI水平变化的影响。TFPI抑制剂选自具有TFPI拮抗剂作用的任何类型的化合物。它优选地为抗-TFPI 抗体或结合TFPI的抗体片段，所述抗体可为单克隆抗体、多克隆抗体或单链抗体。根据本发明的具体实施方案，使用抗体T4E2，该抗体为Diagnostica Stago提供的单克隆抗体。选择抗体的浓度，以使其能够抑制测试样本中含有的所有TFPI。所述浓度可以根据所研究样本而在5至500 μ g/mL(在稀释缓冲液中的浓度)而变化。对于以1/3稀释的血浆样本，抗体的终浓度优选地为6. 6 μ g/mL。根据本发明的方法，反应介质有利地包含过量的因子VII和X。这些因子可用于测量组织因子的活性，因为，如上所解释的，组织因子与激活的因子VII (FVIIa)结合而形成复合物，然后该复合物会激活因子IX和X。由于是通过所产生的因子fe的量来测量TF的活性，测量的是)(a的特异性底物的水解，所以因子VII和X不能限制反应，以便使得所产生的fe的量与TF的活性直接相关。所以，这些因子被过量地加入，这就意味着避免了它们干扰测量的风险。根据测试样本的类型，这两种因子的每一种的终浓度的有利范围为因子VII为5 至 20PEU/mg/mL，因子 X 为 3 至 16PEU/mg/mL。根据本发明的具体实施方案，当样本为以1/3稀释的血浆时，因子VII的浓度为 137PEU/mg/mL,因子X的浓度为80PEU/mg/mL (PEU =血浆当量单位)。这些因子可为人类或动物来源的纯化的或重组形式。例如，它们可由Diagnostica Stago> Enzyme Research Laboratories 或 Sigma 提供。
在一个优选的变化的实施方案中，测试的血浆样本还含有肝素抑制剂化合物，以便当例如测定的样本来自于接受肝素治疗的患者时，使得测试的结果独立于血浆中存在的肝素。所述化合物例如为在止血测试中常用于抑制肝素效果的聚凝胺。
有利的是，所述化合物所使用的终浓度的范围为0. 5-10mg/L。本领域技术人员应能够根据所选择的试剂调整浓度和活性。作为举例说明，应注意，对于包含于本发明内的指示，试剂的浓度和活性可以以士50%的量而变化，例如士20%或甚至士 10%。这一变化可以涉及独立于其他试剂的每种试齐LU根据具体实施方案，本发明的方法按照如下流程进行使用来自Diagnostics Stago提供的STA系列的自动设备进行本发明的方法。将血浆样本在稀释缓冲液中以1/3稀释，所述稀释缓冲液为Owren Koller缓冲液，添加有12mg/L的聚凝胺和50 μ g/L的抗-TFPI抗体(T4E2)。向50 μ 1该混合物中加入下述试剂·25μ 1的含有80PEU/mg/mL因子X的溶液(装有纯化水的冻干瓶终浓度8PEU/ mg/mL)；· 25μ 1的含有137PEU/mg/mL因子VII的溶液(装有纯化水的冻干瓶终浓度 13.7PEU/mg/mL)；· 50 μ 1 的 25mM 的 CaCl2 溶液。将这一反应介质在37°C孵育500秒。在孵育步骤后，加入100 μ 1的含有浓度为0. 84 μ M的CBS 5244底物的溶液，得到的终浓度为3. 36 μ Μ(装有纯化水的瓶)。为了建立校准曲线，从而得到组织因子的功能性活性，使用以下试剂 富含组织因子的正常混合血浆例如通过富集而获得的含有0. 00至44ρΜ的TF 的混合血浆(图3)； 或者富含组织因子的Naci-CaCl2溶液(图3)。每种血浆稀释液均在1/3的稀释度下进行测试。测定了加入混合血浆的对应于44ρΜ、22ρΜ、11ρΜ、5. 50ρΜ、2. 75ρΜ和OpM的活性的 TF的浓度。根据因子Xa的合成底物CBS 52. 44，测定了组织因子活性。事实上，在FVII的存在下，TF将FX激活为FXa。通过在405nm的波长下对硝基苯胺的释放来测量FXa的酰胺分解活性。在405nm的波长下，在6-600秒的读数窗中，测量对应于组织因子活性的每个值 (pM)的光密度。然后测量了抗-TFPI抗体对校准的影响(图4和表1)。表1校准(1)士抗-TFPI 抗体
权利要求
1.用于在来源于患者的预先采样的生物学样本中对循环的组织因子(cTF)进行体外测定的方法，其中在反应介质中测量激活的因子X(Xa)的产生，所述反应介质包括测试的生物学样本、过量的因子VII和因子X、钙离子、纤维蛋白聚合抑制剂和TFPI (组织因子途径抑制剂)活性抑制剂。
2.如权利要求1所述的用于对循环的组织因子(cTF)进行体外测定的方法，其特征在于所述生物学样本为血液样本或其衍生性样本，特别是血浆样本。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其特征在于通过测量因子fe对特异性底物的水解活性，测定所述反应介质中该因子)(a的产生。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述特异性底物为酶促底物。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于使用显色底物或荧光底物测定激活的因子 X(FXa)的酰胺分解活性。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于测量由合成的显色底物CBS5244释放的对硝基苯胺。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于所述反应介质包含在诸如Owren Koller缓冲液的合适的缓冲液中稀释的血浆。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于在1/2至1/20，例如1/2至1/4的稀释范围内，稀释所述血浆；特别是，将所述血浆以1/3稀释。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于所述纤维蛋白聚合抑制剂为多肽抑制剂，例如H-GlyProArgPro-OH. AcOH(GPRP. AcOH)或为抗纤维蛋白原抗体。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于凝血开始所需的钙离子以 CaCl2的形式提供。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其特征在于TFPI对所述循环的组织因子的活性的抑制剂由能够抑制TFPI对循环的组织因子的活性的抗-TFPI抗体和结合TFPI 的功能性抗体片段构成。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述TFPI抑制剂为单克隆抗体T4E2或所述抗体的功能性片段。
13.如权利要求2至12中任一项所述的方法，包括下述步骤a)使血浆样本与试剂1接触，所述试剂1包含纤维蛋白聚合抑制剂、TFPI对cTF的活性的抑制剂，以及如果合适的话，稀释缓冲液；b)将步骤(a)中获得的反应介质与包含过量的因子X、过量的因子VII以及钙离子溶液的试剂2—起孵育，以便产生激活的因子X(FXa)；c)在孵育后，使步骤(b)中获得的反应介质与激活的因子X(FXa)的酶促底物接触；d)检测所述因子fe底物的转化。
14.如权利要求12或权利要求13所述的方法，其特征在于所述试剂1还包含肝素抑制剂，例如聚凝胺。
15.如权利要求13或14中任一项所述的方法，其特征在于将所述血浆样本在添加有 1. 2mg/L聚凝胺和50 μ g/L抗-TFPI抗体的Owren Koller缓冲液中以1/3稀释。
16.如权利要求13至15中任一项所述的方法，其特征在于所述因子fe的酶促底物的转化的定量测量通过在预定窗中读取光密度而实现。
17.如权利要求13至16中任一项所述的方法，其特征在于转化的因子fe底物的量通过参照校准曲线而测定。
18.如权利要求13至17中任一项所述的方法，其特征在于所述反应在下述条件下进行 对于步骤a)，使所述在Owren Koller缓冲液稀释以1/3稀释的血浆样本与50 μ g/ L的抗-TFPI抗体和1. 2mg/L的聚凝胺和浓度为10g/L的称为GPRP. AcOH的纤维蛋白聚合抑制剂接触； 对于步骤b)，将25 μ 1 80PEU/mg/mL比例的因子Χ、25μ 1 137PEU/mg/mL比例的因子 VII以及50 μ 1 25mM的CaCl2溶液加入到50 μ 1的步骤a)的混合物中，并将所获得的反应混合物在37°C孵育500秒； 对于步骤c)，加入100 μ 1的所述激活的因子X的酶促底物，并通过在405nm的波长下6-600秒的读数窗中的光密度读数，测定转化的酶促底物的量。
19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其特征在于所述方法还包括测定内部对照。
20.如权利要求1至17任一项所述的方法，其特征在于将所获得的光密度值与使用富含组织因子的正常混合血浆或使用富含组织因子的Naci-CaCl2溶液制备的校准曲线的值进行比较。
21.用于在生物学介质中测量生物学样本特别是血浆样本中的循环的组织因子活性的试剂盒，包含 试剂1，包括用于测试的样本的稀释缓冲液、纤维蛋白聚合抑制剂、TFPI抑制剂，以及如果合适的话，肝素抑制剂； 纯化的或重组的因子VII，有利地为冻干形式； 纯化的或重组的因子X，有利地为冻干形式； 钙离子，例如为CaCl2的形式； 激活的因子X的酶促底物，有利地为冻干形式； 如果合适的话，校准试剂，有利地为冻干形式。
22.如权利要求21所述的试剂盒，其特征在于所述样本稀释缓冲液为OwrenKoller 缓冲液，所述肝素抑制剂为聚凝胺，且所述纤维蛋白聚合抑制剂为为H-GlyProArgPro-OH. AcOH(GPRP. AcOH)或为抗纤维蛋白原抗体。
23.如权利要求21或权利要求22所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括内部对照。
24.如权利要求21至23中任一项所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含因子fe 活性的校准曲线。
25.用于在体外检测异常凝血的方法，包括如权利要求1至20中任一项所述，测量循环的组织因子的活性。
26.如权利要求25所述的方法，包括将所测量的循环的组织因子活性与所述活性的正常值进行比较。
27.如权利要求沈所述的方法，其中所述正常值通过测定正常血浆样本的混合物中的循环的组织因子活性而获得。
28.如权利要求沈所述的方法，其中所述正常值通过针对单独测定的正常血浆样本而测量的所述循环的组织因子活性的值来建立。
29.如权利要求25至观中任一项所述的方法，用于检测与血栓形成风险或血栓形成相关的循环的组织因子比率的增加，特别是与急性心肌梗塞(AMI)、急性冠状动脉综合征、弥散性血管内凝血(DIVC)、糖尿病、先兆子痫、流产、血栓形成、脓毒症、炎症或癌症的症状相关的循环的组织因子比率的增加。
30.如权利要求20至25中任一项所述的试剂盒，用于检测与血栓形成风险或血栓形成相关的循环的组织因子比率的增加，特别是与急性心肌梗塞(AMI)、急性冠状动脉综合征、 弥散性血管内凝血(DIVC)、糖尿病、先兆子痫、流产、血栓形成、脓毒症、炎症或癌症的症状相关的循环的组织因子比率的增加。
全文摘要
本发明涉及止血领域，特别是与组织因子的异常表达相关的凝血病症以及与所述因子的超表达相关的生理病理学现象。本发明提供了测定生物学样本中循环的组织因子活性的方法。本发明的方法在体外进行，特别是对采集自患者的血液样本进行。
文档编号C12Q1/56GK102159723SQ200980127999
公开日2011年8月17日 申请日期2009年7月16日 优先权日2008年7月17日
发明者奥雷莉·卢梭, 巴里·伍德哈姆斯, 帕特里克·万德丹 申请人:斯塔戈诊断公司