用于测量细胞介导的免疫应答的诊断试验所用的方法和组合物的制作方法

专利名称：用于测量细胞介导的免疫应答的诊断试验所用的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本申请概括地涉及诊断试验，更具体地，涉及用于测量生物样品中细胞介导的免疫(CMI)反应性的试验。更具体地，本发明提供了用于测量生物样品中的细胞-介导的对靶抗原的应答的试验和试剂盒，其中使用转运因子将靶抗原递送给生物样品中的细胞。相关申请的交叉引用本申请在35 U. S. C. § 119(e)下要求2009年6月12日提交的美国临时申请 61/186，437的利益，其整个内容通过引用并入本文。
背景技术：
流行病学调查提示，世界上1/3的人口被结核分枝杆菌感染。原发感染会在少数 (约10% )受感染个体中(通常在2年内)导致活动性结核(A-TB)。在其它病例中，免疫系统含有感染，且个体是非传染性的和无症状的。该临床潜伏期可以在个体终生中持续。 但是，在有些情况下，宿主免疫应答被扰乱，潜伏性结核感染(LTBI)可能发展成原发后的 A-TB0在例如人免疫缺陷病毒(HIV)感染、营养不良、使用类固醇或其它免疫抑制药物以后，或因为老年，可以发生该过程。新的诊断工具的开发会改善结核(TB)的控制，这通过改善A-TB的诊断和通过实现LTBI的更准确鉴别来实现。一个这样的试验是结核菌素皮肤试验(TST)，该试验已经成为唯一广泛使用的可用于诊断TB感染的工具。但是，该试验受到它在诊断A-TB时的低灵敏度(75-90% )和由下述事实造成的它的低特异性的限制用于皮肤试验的纯化的蛋白衍生物(PPD)含有> 200种抗原，所述抗原在环境分枝杆菌和用于疫苗接种的牛分枝杆菌BCG 菌株之间广泛地共有。最后，TST不允许辨别A-TB和LTBI。为了检测病毒病原体，现有的诊断试验试剂盒会检测病毒蛋白，且有些会测量针对病毒抗原的抗体。有些试验允许更定量地测量血流中的病毒。但是，这些试验都不会测量T-细胞对病原性感染的应答。研究已经证实，T-细胞应答(或引起对病原体表达的靶抗原的CMI应答的能力)可以决定感染是否可以被免疫系统控制。已经开发了其它诊断试验，它们测量针对病原性蛋白的细胞-介导的免疫(CMI) 应答。现有的用于检测CMI应答的方法包括测量立即型和延迟型超敏反应的皮肤试验，淋巴细胞增殖试验，和测量由用抗原培养的纯化的单核细胞生产的细胞因子。更老的确定的用于测定CMI应答的方法包括增殖试验，使用分裂中的T-细胞对放射性同位素的摄取作为CMI反应性的标志物。更近地，诸如单细胞试验(ELISpot)等技术已经被用于检测响应于抗原刺激而生产某些细胞因子的T-细胞的数目。此外，大多数用于检测CMI应答的体外方法包括从全血纯化淋巴细胞，用抗原培养这些淋巴细胞12小时至6天的时段，然后检测T-细胞对抗原的反应性。已经开发了一些CMI试验，它们检测对靶抗原的肽或靶抗原的重叠肽的CMI应答。 可商业得到的用于测量对TB靶抗原的CMI应答的试验包括=QuantiFERON TB Gold试验(来自Cellestis Ltd)和T SPOT TB试验(来自Oxford Immunotec)。这些试验检测对TB 靶抗原的重叠肽的CMI应答。除了病原性感染(诸如TB)的诊断以外，CMI诊断试验也可以用于许多疾病和障碍(包括传染性疾病和自身免疫病)以及免疫活性标志物的免疫诊断， 和用于检测对内源和外源抗原(即疫苗)的T-细胞应答。

发明内容
本发明涉及用于测量受试者中的CMI应答的方法，其中用融合蛋白温育来自受试者的生物样品，所述生物样品包含免疫系统的T-细胞或其它细胞，其中所述融合蛋白包含与靶抗原融合的致死因子(LF)多肽的多肽片段。通过测量免疫细胞对融合蛋白的细胞因子应答，所述细胞因子应答相对于参照细胞因子应答的水平会指示受试者对抗原的细胞介导的免疫(CMI)应答的水平。本发明涉及下述发现，即与靶抗原融合的致死因子(LF)的多肽片段可以用于将靶抗原递送给在体外的细胞，其可以用于诊断试验中，以测定受试者的CMI应答性水平。通过将靶抗原融合到LF的多肽片段(诸如Un)上，发明人已经发现，该诊断试验可以测定受试者对大抗原(尤其是完整抗原，而不是以前已经实现的抗原片段)的CMI应答性。此外， 发明人发现，这样将靶抗原偶联到LF片段(诸如LFn)上，会产生与以前可能实现的准确度 (当靶抗原没有偶联到LF的多肽片段上时进行的诊断试验)相比远远更高的受试者对抗原的CMI应答性准确度。不希望受理论的约束，发明人以前已经证实，与靶抗原融合或偶联的Un能够将靶抗原递送至细胞的胞质溶胶(在没有PA存在下)。在本文中，发明人已经发现，与靶抗原偶联的1^11可以用于诊断试验中，以测定在没有PA存在下受试者是否具有对靶抗原的细胞介导的免疫(CMI)应答。也不希望受理论的约束，据信，靶抗原向生物样品中的完整细胞的胞质溶胶的递送，允许细胞使用MHC分子在它的表面上处理和展示靶抗原，其中处理过的片段可以与生物样品中可能存在的抗原特异性的细胞(例如，抗原特异性的T细胞)相互作用。因此，本发明涉及用于测量受试者中的CMI应答的方法和用于该方法的组合物，其中所述方法包括用与靶抗原偶联的LF片段(诸如LFn或其片段)(例如LFn-靶抗原融合蛋白)温育来自受试者的生物样品，所述生物样品包含能够处理和呈递靶抗原的细胞和免疫细胞，以便将靶抗原递送至生物样品中的细胞的胞质溶胶。如果存在识别处理过的、展示的靶抗原的免疫细胞，它们在这样的识别以后，会释放出一种或多种指示CMI应答的细胞因子。CMI应答指示受试者向靶抗原的暴露，例如，病原体感染或其它暴露。本发明的一个方面提供了用于检测受试者对与LFn融合的靶抗原的CMI应答的方法和组合物，其中所述靶抗原是完整抗原蛋白，例如，TBl抗原。通过融合到LF上，靶抗原被递送至生物样品中的细胞(诸如抗原呈递细胞(APC))的细胞质，所述生物样品从受试者得到，例如血液样品。如果受试者具有以前已经对抗原(但是可能是独特的或特殊的抗原组或多种抗原)敏化(即通过暴露于表达靶抗原的病原体或病原体感染)的免疫细胞(诸如T细胞)，所述免疫细胞(诸如T细胞)会释放出至少一种细胞因子，例如，IFN-g。可以测量释放的细胞因子，且释放的细胞因子的水平和/或释放的细胞因子的特殊特性会指示，受试者已经被感染，或曾经暴露于表达靶抗原的病原体。可以使用用于检测一种或多种细胞因子的水平的任意方法；作为一个非限制性实例，使用在本文实施例中所述的商业的IFN-γ ELISA试验，可以测量IFN-γ的水平。在具体实施方案中，测量细胞因子的独特的或特殊的特性，会增加对靶抗原的CMI 应答的特异性和定性评估。例如，基于从T-细胞释放的细胞因子集合的独特的或特殊的特性，可以区别慢性感染的受试者和携带者感染的受试者，或者区别被病原体的一种亚型 (或变体)感染的受试者和被病原体的不同亚型(即变体)感染的受试者。作为实例，慢性感染的受试者的细胞因子特性会不同于携带者受试者的细胞因子特性，同样地，被一种病原体亚型感染的受试者会不同于被不同病原体亚型(即变体)感染的受试者的细胞因子特性。可以与LFn融合的靶抗原可以是与传染病或癌症或免疫病有关的任意抗原。在有些实施方案中，与Un融合的靶抗原可以由多种传染物表达，包括病原体、病毒、细菌、真菌或寄生物。因为整个或完整靶抗原可以与Un融合并经由LFN递送至完整活细胞的胞质溶胶，本发明能够检测对整个或完整靶多肽抗原的CMI应答。以前开发的CMI试验使用可以有效地进入细胞中的肽，而不是不能进入细胞中的完整抗原蛋白。因此，本文所述的方法会提供一个优点，即可以采用特定抗原的全范围表位，而不仅仅是单个或选择的几个肽表位。 用于本发明的方法和组合物中来检测CMI应答的靶抗原不是HLA限制的表位。因此，本文描述了用于检测或监测CMI应答的试验所用的方法和组合物，它更灵敏，因为它可以诊断对抗原的暴露，无论哪个表位在个体的免疫应答中起作用。在有些实施方案中，为了避免与增加的灵敏度有关的假阳性，还可以将靶抗原分解成整个靶抗原的片段，例如，3个或4个，这取决于蛋白的大小。通过评估对与LFn融合的靶抗原集合(它们是整个靶抗原的片段)的CMI应答，可以证实对与LFn融合的整个靶抗原的阳性CMI应答。如果1个或2个片段(而不是所有片段)产生阳性应答，则证实真实的CMI应答。如果检测到所有片段的阳性CMI应答，对与LFn融合的整个靶抗原的阳性 CMI应答可能是假阳性。在另一个方面，CMI试验的方法和组合物可用于受试者的预后评价。例如，如上面所讨论的，可以使用CMI试验来区别慢性感染的受试者、携带者受试者或潜伏感染的受试者。或者，可以区别被病原体的不同变体感染的受试者。在另一个实施方案中，可以使用本文公开的CMI试验来鉴别靶抗原的哪个表位可用于诊断和/或预后。这可用于帮助治疗受试者，例如CMI试验可以用于测定哪个表位是优势的，且因此可以用作靶物来刺激对该表位做出应答的细胞。本发明提供了许多胜过现有的细胞介导的免疫(CMI)试验的优点。例如，本发明提供了用于检测对靶抗原集合(它们是靶抗原的重叠蛋白或重叠多肽，而不是靶抗原的重叠肽)的CMI应答的方法。本发明的使用与Un融合的靶抗原的重叠蛋白的方案，能够实现融合蛋白的更廉价且更快速的生产和增加的稳定性，这会显著降低试验成本。此外，使用与LFn融合的靶抗原的重叠蛋白，会增加CMI应答的特异性。例如，本文公开的CMI试验能够区别已经针对病原体免疫的受试者和被病原体感染或已经暴露于病原体的受试者之间的差异。在另一个实施例中，本文公开的CMI试验可以区别T细胞靶物。因此，本文公开的诊断方法和CMI试验会提供简单的、廉价的且快速的方法，用于检测对靶抗原的CMI应答， 和/或检测受病状(诸如病原体感染)影响的受试者。
本文公开的诊断方法和CMI试验的另一个优点允许早期检测对靶抗原的CMI应答。例如，在暴露于病原体或靶抗原以后1周或更短，可以检测出CMI应答，而抗体应答需要数月才能达到可测量的水平，这取决于暴露和/或感染的水平和范围。本文公开的诊断方法和CMI试验的另一个优点是，对于在细菌中难以生成的靶抗原，可以检测对靶抗原的CMI应答。在一个实施方案中，本文所述的方法会提供病原性感染的早期无症状筛查系统， 其中使用本文公开的诊断试验。这样的筛查可以在例如从受试者采取的生物样品上进行， 包括、但不限于血液样品，其中所述受试者已经暴露于病原体，或其中受试者处于被病原体感染的风险中。例如，在受试者疑似具有病原性感染的情况下，例如受试者正在表现出特定病原性感染的特有症状，或者，受试者已经暴露于病原体(即受试者已经接触包含传染剂的样品，或受试者已经接触具有病原性感染的人)，可以从受试者获得生物样品，并使用本文公开的方法和组合物，评估引起对靶抗原(其由受试者已经暴露或处于被该病原体感染的风险中的病原体表达)的CMI应答的能力。因为病原体感染或癌症的早期检测对于有效治疗而言是关键性的，本文公开的病原性感染的鉴别或癌症的存在(例如，通过对肿瘤标志物的CMI应答来鉴别)极大地提高了有效治疗的机会。本文描述了用于检测或监测受试者(例如哺乳动物受试者，诸如人受试者)中的 CMI应答的组合物。本发明涉及使用它们来检测受试者中的CMI应答的组合物和方法，其基本上由LF片段(诸如二分的(bipartate)外毒素的N-端致死因子(LFn)或其羧基片段) 组成，其中LFn与靶抗原融合或以其它方式物理地连接，且所述组合物不包含二分的外毒素的保护抗原(PA)。本文所述的组合物和方法的一个方面涉及测量受试者中对靶抗原的细胞介导的免疫应答(CMI)的方法，所述方法包括下述步骤(a)用至少一种融合多肽温育来自受试者的生物样品，所述融合多肽包含与靶抗原多肽或与其片段融合的LF多肽的一部分(该部分缺少LF酶活性，但是足以促进融合多肽跨膜递送给细胞)，其中所述生物样品包含免疫系统的细胞，所述细胞响应于抗原而释放出至少一种细胞因子；(b)测量在生物样品中释放的至少一种细胞因子的水平；和(c)对比生物样品中的细胞因子的水平和相同细胞因子的参照水平，其中来自受试者的生物样品中的细胞因子的水平相对于细胞因子参照水平的增力口，指示对靶抗原的细胞介导的免疫应答(CMI)。另一个方面涉及检测受试者的目标病状的方法，所述方法包括下述步骤(a)用至少一种融合多肽温育来自受试者的生物样品，所述融合多肽包含与靶抗原多肽或与其片段融合的LF多肽的一部分(该部分缺少LF酶活性，但是足以促进融合多肽跨膜递送给细胞)，其中所述靶抗原在受病状影响的组织中表达，且其中所述生物样品包含免疫系统的细胞，所述细胞响应于抗原而释放出至少一种细胞因子；(b)测量在生物样品中释放的至少一种细胞因子的水平；和(c)对比生物样品中的细胞因子的水平和相同细胞因子的参照水平，其中来自受试者的生物样品中的细胞因子的水平相对于细胞因子参照水平的增加，会将受试者鉴别为具有所述病状，或具有增加的遭受所述病状的风险。另一个方面涉及测量受试者中对靶抗原的细胞介导的免疫应答(CMI)的方法，所述方法包括下述步骤(a)用至少一种靶抗原温育来自受试者的生物样品，其中所述生物样品包含免疫系统的细胞，所述细胞在被靶抗原刺激以后释放出至少一种细胞因子；(b)测量生物样品中释放的细胞因子的存在或水平，其中细胞因子的存在或水平指示在来自受试者的生物样品中存在对靶抗原的细胞介导的免疫应答(CMI)，其中所述改进包括，在温育步骤(a)中，用与LF多肽的一部分融合的至少一种靶抗原多肽或其片段温育生物样品，所述部分缺少LF酶活性，但是足以促进融合多肽跨膜递送给细胞。在有些实施方案中，所述方法包括使用LF多肽的一部分，该部分是SEQIDN0 3 的至少60个羧基端氨基酸或其保守置换变体，包括促进跨膜递送的保守置换变体。在有些实施方案中，所述LF多肽片段包含SEQ ID NO :3的至少80个羧基端氨基酸或其保守置换变体，包括促进跨膜递送的保守置换变体，或SEQ ID NO :3的至少104个羧基端氨基酸或其保守置换变体，包括促进跨膜递送的保守置换变体。在有些实施方案中，所述LF多肽部分包含与SEQ ID NO :3相对应的氨基酸序列或其保守置换变体，包括促进跨膜递送的保守置换变体。在有些实施方案中，所述LF多肽不结合PA多肽。在另一个实施方案中，在本文公开的方法和组合物中使用的LF多肽的一部分基本上缺少SEQ ID NO :3的氨基酸1-33。在该背景下使用的术语“基本上缺少”是指，所述 LF多肽缺少信号肽功能。在另一个实施方案中，在本文公开的方法和组合物中使用的LF多肽的一部分由 SEQ ID NO :4或其促进跨膜递送的保守置换变体组成。在有些实施方案中，在本文公开的方法和组合物中使用的LF多肽片段偶连至靶抗原上，例如长度为至少15个氨基酸的靶抗原多肽或其片段。在有些实施方案中，这样的靶抗原多肽或其片段折叠成它的天然构象。在有些实施方案中，所述靶抗原多肽或其片段是多分子多肽复合物的一部分，或者是多分子多肽靶抗原的亚基多肽。在另一个实施方案中，靶抗原多肽是全长靶抗原大小的基本上一半，或者是全长靶抗原大小的基本上1/3或 1/4，或小于全长靶抗原大小的1/4，且其中所述片段的长度是至少15个氨基酸。在有些实施方案中，本文公开的方法和组合物测量生物样品中的CMI应答，所述生物样品例如但不限于全血样品或血浆或淋巴结生物样品。通常，所述生物样品包含免疫细胞，包括、但不限于NK细胞；T-细胞；B-细胞；Th细胞；Thl细胞；Th2细胞；Tc细胞；基质细胞；内皮细胞；白细胞；淋巴细胞；树突细胞；巨噬细胞；肥大细胞和单核细胞。所述生物样品包含能够加工和展示靶抗原的细胞。在有些实施方案中，本文公开的方法和组合物测量响应于靶抗原从免疫细胞释放的细胞因子的水平，例如，这样的细胞因子可以是下述细胞因子中的任一种，或下述细胞因子的任意组合，包括但不限于=GM-CSF ；IL-I α ；IL-I β ；IL-2 ；IL-3 ；IL-4 ；IL-5 ；IL-6 ； IL-7 ；IL-8 ；IL-10 ；IL-12 ；IFN-α ； IFN-β ； IFN-γ ；MIP-I α ；MIP-I β ； TGF-β ；TNFa 禾口 TNF^。在具体实施方案中，在测量T-细胞细胞因子的情况下，所述细胞因子可以是下述细胞因子中的任一种或组合IFN-g ;TGF3 ；TNF β ；IL-10 ;GM_CSF ;IL_3 ;IL_4 和 IL-5。在具体实施方案中，测量的细胞因子是IFN-γ。本发明的一个方面涉及CMI应答的检测和/或将受试者诊断为具有目标病状，包括、但不限于病原性感染或癌症或自身免疫病。与传染病有关的抗原可以源自多种传染物中的任一种，包括病原体、病毒、细菌、 真菌或寄生物。目标病原体的非限制性实例包括单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、 HBV、巨细胞病毒、非洲淋巴细胞瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒、人疱疹病毒6、人疱疹病毒7、人疱疹病毒8、天花病毒、水疱性口炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、 丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、鼻病毒、冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、麻疹病毒、 多瘤病毒、人乳头瘤病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯萨奇病毒、登革热病毒、腮腺炎病毒、 脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、鲁斯肉瘤病毒、黄热病病毒、埃波拉病毒、马尔堡病毒、拉沙热病毒、东方马脑炎病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、Murray山谷热病毒、西尼罗病毒、立夫特山谷热病毒、甲型轮状病毒、乙型轮状病毒、丙型轮状病毒、Sindbis病毒、人 T-细胞白血病病毒1型、汉坦病毒、风疹病毒、牛疫、鼻病毒、埃可病毒、乳多泡病毒、棘状病毒、虫媒病毒、人免疫缺陷病毒I型或II型和猿免疫缺陷病毒。可以为其提供免疫检测的细菌的实例包括、但不限于结核分枝杆菌、分枝杆菌、 支原体、奈瑟球菌和军团病杆菌。寄生物的实例包括、但不限于立克次氏体和衣原体。传染病抗原的一个实例是TbH9(也称作Mtb 39A)，即一种结核抗原。其它结核抗原包括、但不限于:DPV(也称作 Mtb8. 4)、381、Mtb41、Mtb40、Mtb32A、Mtb9. 9A、Mtb9. 8、 Mtbl6、Mtb72f、Mtb59f、Mtb88f、Mtb71f、Mtb46f 和 Mtb31f ( “f” 指示它是融合体或 2 个或更多个蛋白)。因此，在其中诊断或检测受试者对目标病状的CMI应答的这类实施方案中，靶抗原多肽或其片段是病原体抗原，例如，TB-特异性的抗原。TB-特异性的抗原的一个实例包括包含SEQ ID NO 7的TBI (CFP或CFP-10)多肽或其片段，诸如多肽序列SEQ ID NO 30 至SEQ ID NO :46ο可以使用的另一种TB-特异性的抗原是包含SEQ ID NO :6的ΤΒ2 (ESAT 或ESAT-6)多肽或其片段，诸如多肽序列SEQ ID NO :8至SEQ ID NO :29。在有些实施方案中，使用本领域普通技术人员普遍已知的任意方法，例如，使用抗体、抗体片段、重组抗体、嵌合抗体、适体、肽或其类似物，在蛋白表达水平测量细胞因子。或者，可以使用选自下述的方法，测量细胞因子免疫测定、放射免疫测定(RIA)、免疫放射测定(IRMA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)；酶联免疫斑点测定(ELISpot) ；CELISA[细胞的酶联免疫吸附测定]；RHPA(反向溶血空斑测定)或激酶受体活化测定(KIRA)。通常，本文公开的方法和组合物可用于诊断或测定受试者(诸如哺乳动物受试者，包括人受试者)的CMI应答，但是，所述方法和组合物同样适用于非人受试者(包括家畜类动物、驯养动物和伴侣动物)和其它兽类和野生型受试者。在有些实施方案中，用融合多肽集合温育生物样品，所述融合多肽集合包含与靶抗原多肽或其片段融合的LFn多肽，其中所述融合多肽集合包含靶抗原多肽或其基本上覆盖靶抗原多肽的整个全长的片段。在有些实施方案中，融合多肽集合是多个与不同靶抗原多肽融合的LFn多肽，所述不同靶抗原多肽为基本上覆盖靶抗原多肽的整个全长的重叠和 /或邻近的靶抗原多肽片段。融合多肽集合可以是任意数目的融合多肽，例如至少2个或至少2-5个或6-10个或11-15个或16-20个或超过20个融合多肽。在一个实施方案中，可用于本文公开的方法和组合物中的融合多肽集合包含与至少2个选自下述的不同靶抗原片段融合的LF多肽SEQ ID NO :8至SEQ ID NO :29。在一个替代实施方案中，可用于本文公开的方法和组合物中的融合多肽集合包含至少2个与选自下述的不同靶抗原片段融合的所述LF多肽SEQ ID NO :30至SEQ ID NO :46。在有些实施方案中，CMI应答(即对CMI应答的阳性反应性)的检测会鉴别出受试者具有病状，或处于具有病状的风险中。通过本文公开的方法和组合物可以鉴别出的这类病状的实例包括、但不限于癌症、感染性疾病和自身免疫病。此外，使用本文公开的方法和组合物进行的CMI应答(即对CMI应答的阳性反应性)的检测，也可用于鉴别这样的受试者其可能已经暴露于靶抗原或表达靶抗原的病原体。在有些其中已经将受试者鉴别为具有阳性CMI应答的实施方案中，所述受试者被鉴别为，与被鉴别为具有低或否定的引起CMI 应答的能力的受试者相比，具有或可能具有更好的预后。另一个方面涉及用于监测受试者的目标病状的方法，所述方法包括评估受试者的引起对靶抗原的细胞介导的免疫(CMI)应答的能力，其中所述方法包括(a)用融合多肽温育在试验时间点从受试者收集的生物样品，所述融合多肽包含LF多肽的一部分(该部分缺少LF酶活性，但是足以促进融合多肽跨膜递送给细胞)，所述LF多肽与靶抗原多肽或其片段融合，其中所述靶抗原在受病状影响的组织中表达，且其中所述生物样品包含免疫系统的细胞，所述细胞响应于抗原而释放出至少一种细胞因子；(b)测量在生物样品中释放的至少一种细胞因子的水平；和(c)对比生物样品中的所述细胞因子的水平和相同细胞因子的参照水平，其中如果检测到在试验时间点从受试者得到的生物样品中的细胞因子的水平相对于所述细胞因子的参照水平的增加，则将所述受试者鉴别为，具有引起对靶抗原多肽或其片段的细胞介导的免疫(CMI)应答的能力。在这样的实施方案中，参照细胞因子水平是从一个或多个没有受所述病状影响的受试者得到的至少一个或多个生物样品中的细胞因子水平。或者，参照细胞因子水平是在比试验时间点更早的时间点从受试者得到的生物样品中的细胞因子水平。在受试者被鉴别为具有阳性CMI应答(即引起对靶抗原的CMI应答)的情况下， 本发明包括另一个步骤用合适的治疗方案，治疗被鉴别为具有引起细胞介导的(CMI)应答的能力的受试者。或者，本文公开的方法和组合物可用于指导被鉴别为具有阳性CMI应答的受试者中的适当治疗。例如，从业人员可以评审来自本文公开的CMI试验的细胞因子的水平，如果受试者被鉴别为具有引起细胞介导的(CMI)应答的能力，关于在病状中涉及的该特定的(相对于泛化的)因素做出结论。从业人员然后可以指导用适合涉及的特定因素的治疗方案来治疗受试者。在另一个实施方案中，本文公开的方法和组合物可用于预测受试者的病状的预后，例如，在可以引起细胞介导的(CMI)应答的受试者被鉴别为可能具有更好预后(与被鉴别为具有低或否定的引起CMI应答的能力的受试者相比)的情况下。在另一个实施方案中，本文公开的方法和组合物可用于预测受试者发展病状的风险，例如，被鉴别为具有引起细胞介导的(CMI)应答的能力的受试者，会被鉴别为发展病状的可能性更低(与被鉴别为具有低或否定的引起CMI应答的能力的受试者相比)。在这样的实施方案中，所述病状可以是任意病状，包括但不限于病原性感染、癌症或自身免疫病。在有些实施方案中，本文公开的方法和组合物包含炭疽芽孢杆菌LF多肽的一部分，该部分是SEQ ID NO :3的至少60个羧基端氨基酸或其保守置换变体，包括促进跨膜递送的保守置换变体。或者，可用于本文所述的方法和组合物中的LF多肽部分是SEQ ID NO 3 (在本文中也称作片段幻的至少80个羧基端氨基酸或其保守置换变体，包括促进跨膜递送的保守置换变体，或SEQ ID NO :3(在本文中也称作片段3)的至少104个羧基端氨基酸或其保守置换变体，包括其促进跨膜递送的保守置换变体。在一个实施方案中，LF多肽的一部分包含与SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4相对应的氨基酸序列或其保守置换变体，包括其促进跨膜递送的保守置换变体。在另一个实施方案中，可用于本文公开的方法和组合物中的LF多肽部分不结合炭疽芽孢杆菌PA多肽，例如，所述LFn多肽可以基本上缺少SEQ ID NO 3的氨基酸1_33。在有些实施方案中，与LF多肽(例如，LFn多肽)融合的靶抗原多肽或其片段的长度是至少15个氨基酸。通常，这样的靶抗原多肽或其片段折叠成它的天然构象。在有些实施方案中，靶抗原是多分子多肽复合物的一部分，例如，靶抗原可以是多分子多肽靶抗原的亚基。在靶抗原片段与LF多肽部分融合的有些实施方案中，所述片段可以是完整抗原的一定范围尺寸的片段，包括、但不限于基本上是全长靶抗原的大小的1/2的片段，或基本上是全长靶抗原大小的1/3的片段，或基本上是全长靶抗原大小的1/4的片段，或者小于全长靶抗原大小的1/4。通常，与LF多肽部分融合的靶抗原片段是至少20个氨基酸。可用于本文公开的方法和组合物中的生物样品可以是包含免疫细胞的任意生物样品，包括、但不限于全血样品或血浆或淋巴结生物样品。可用于本文所述的方法中的生物样品包含至少一类免疫细胞，例如免疫细胞，例如，但不限于NK细胞、T-细胞、B-细胞、Th 细胞、Thl细胞、Th2细胞、Tc细胞、基质细胞、内皮细胞、白细胞、淋巴细胞、树突细胞、巨噬细胞、肥大细胞和单核细胞。在具体实施方案中，生物样品包含T-细胞。在给定的实施方案中，生物样品包含这样的细胞其处理和展示递送至细胞的胞质溶胶的抗原。有用的生物样品包含这样的免疫细胞其响应于靶抗原的识别(例如，通过结合免疫细胞上的受体)而释放出至少一种细胞因子。释放的这类细胞因子的实例可以是任意类型的细胞因子，例如但不限于、GM-CSF, IL-I α、IL-I β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、 IL-7, IL-8, IL-10, IL—12、IFN- α、IFN- β、IFN- γ、MIP-I α、MIP-I β、TGF- β , TNF α 禾口 TNF^。在有些实施方案中，在本文公开的方法中测量的细胞因子的水平是T-细胞细胞因子的水平，例如至少一种下述细胞因子的水平IFN-γ、TGF β , TNF β , IL-10、GM-CSF, IL-3、IL-4和IL-5。在具体实施方案中，所述测量的细胞因子是IFN-γ。通过本领域普通技术人员普遍已知的任意方法，例如通过免疫测定、放射免疫测定(RIA)、免疫放射测定 (IRMA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)；酶联免疫斑点测定；CELISA[细胞的酶联免疫吸附测定；RHPA(反向溶血空斑测定)或激酶受体活化测定(KIRA)，可以测量细胞因子的水平，或使用常见的蛋白检测剂(诸如抗体、人源化的抗体、抗体片段、重组抗体、嵌合抗体、适体、 肽或其类似物)来测量细胞因子蛋白表达的水平。在有些实施方案中，可用于本文公开的方法和组合物中的与LF多肽融合的靶抗原多肽或其片段是病原体靶抗原。表达用于本文所述发明中的靶抗原的这类病原体的实例包括、但不限于结核分枝杆菌(TB)、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、HBV、巨细胞病毒、非洲淋巴细胞瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒、人疱疹病毒6、人疱疹病毒7、人疱疹病毒8、 天花病毒、水疱性口炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、 戊型肝炎病毒、鼻病毒、冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、麻疹病毒、多瘤病毒、人乳头瘤病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯萨奇病毒、登革热病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、鲁斯肉瘤病毒、黄热病病毒、埃波拉病毒、马尔堡病毒、拉沙热病毒、东方马脑炎病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、Murray山谷热病毒、西尼罗病毒、立夫特山谷热病毒、甲型轮状病毒、乙型轮状病毒、丙型轮状病毒、Sindbis病毒、人T-细胞白血病病毒 1型、汉坦病毒、风疹病毒、牛疫、鼻病毒、埃可病毒、乳多泡病毒、棘状病毒、虫媒病毒、人免疫缺陷病毒I型或II型和猿免疫缺陷病毒。
在有些实施方案中，与LFn融合的靶抗原多肽或其片段由病原体结核分枝杆菌表达。例如，与LFn融合且可用于本文公开的方法和组合物中的一种这样的靶抗原是TB-特异性的抗原，诸如TB 1 (CFP)多肽或其片段或TB2 (ESAT)多肽或其片段。
本文所述的方法和组合物可用于测定受试者中对靶抗原的CMI应答，所述受试者例如哺乳动物受试者，诸如人受试者。
本发明的另一个方面涉及用于测量来自受试者的生物样品中对靶抗原多肽的细胞介导的免疫(CMI)应答的试剂盒，所述试剂盒包含融合多肽，所述融合多肽包含与靶抗原多肽或其片段融合的LF多肽的一部分，该部分缺少LF酶活性，但是足以促进融合多肽跨膜递送给细胞。
在这样的实施方案中，所述试剂盒可以包含LF多肽的一部分，该部分是或包括 SEQ ID NO :3的至少60个羧基端氨基酸或其保守置换变体，包括其促进或介导跨膜递送的保守置换变体。或者，可用于试剂盒中的LF多肽部分是SEQ ID NO :3(在本文中也称作片段3)的至少80个羧基端氨基酸或至少104个羧基端氨基酸或其保守置换变体，包括其促进或介导跨膜递送的保守置换变体。在一个实施方案中，LF多肽的一部分包含与SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4相对应的氨基酸序列或其保守置换变体，包括其促进或介导跨膜递送的保守置换变体。
通常，本文公开的试剂盒包含融合多肽集合。例如，融合多肽集合可以包含基本上连续的靶抗原片段，它们一起基本上覆盖靶抗原多肽的全长。融合多肽集合可以是任意数目的融合多肽，例如但不限于至少2个或至少2-5个或6-10个或11-15个或16-20个或超过20个融合多肽。在有些实施方案中，试剂盒可以包含与选自下述的不同靶抗原片段融合的至少2个LF多肽的融合多肽集合SEQ ID NO :8至SEQ ID NO :29。在一个替代实施方案中，可用于本文公开的试剂盒中的融合多肽集合包含与至少2个选自下述的不同靶抗原片段融合的炭疽芽孢杆菌LF多肽SEQ ID NO :30至SEQ ID NO :46。
本发明的另一个方面涉及用于测量来自受试者的生物样品中对靶抗原多肽的细胞介导的免疫(CMI)应答的试剂盒，所述试剂盒包含(a)LF多肽的一部分，该部分缺少LF 酶活性，但是足以促进所述融合多肽向细胞的跨膜递送；(b)用于将所述LF多肽部分缀合到靶抗原多肽或其片段上的试剂；和(c)基于抗体的检测工具，其用于检测由生物样品释放的至少一种细胞因子。
本发明的另一个方面涉及用于测量来自受试者的生物样品的对TB抗原多肽的细胞介导的免疫(CMI)应答的试剂盒，所述试剂盒包含(a)与TB-特异性的抗原多肽融合的 LF多肽的一部分，该部分缺少LF酶活性，但是足以促进所述融合多肽向细胞的跨膜递送； 和(b)基于抗体的检测工具，其用于检测由生物样品释放的至少一种细胞因子。
在有些实施方案中，本文公开的试剂盒可以任选地另外包含阳性和/或阴性生物样品对照，其中阳性样品会引起对靶抗原的CMI应答，阴性生物样品会引起可忽略的CMI应答或不引起CMI应答。一种这样的本文公开的试剂盒包含TB-特异性的抗原多肽，它是SEQ ID NO 7的TB 1 (CFP)多肽或其片段，和/或SEQ ID NO 6的TB2 (ESAT)多肽或其片段。 在有些实施方案中，所述试剂盒可以包含靶抗原融合多肽集合，其中所述靶抗原是TBI (SEQ ID NO 7)的片段，诸如选自 SEQ ID N0:30 至 SEQ ID NO :46 的片段，或 TB2 (SEQ ID NO 6)的片段，诸如选自SEQ ID NO 8至SEQ ID NO 30的片段。


图1的图描绘了 PA-介导的Un进入细胞中(经由胞吞作用)，并随后被MHC I类分子呈递。
图2A-B显示了 CMI试验的图示，所述CMI试验在本文中也称作“LF-CMI试验”或 "VTI试验”或“ASACIR TB试剂盒”。图2A显示了本文公开的CMI试验在病原性感染(例如，HBV感染)的最初阶段的应用，其可以鉴别将变成慢性HBV携带者的受试者(即病毒载量保持较高、具有可检测的病毒表面抗原的受试者)和非慢性携带者的受试者(即具有低病毒载量和低病毒表面抗原的受试者)。受试者的辨别能够实现慢性携带者的早期治疗和预防肝病的治疗策略。图2B显示了用于区别对下述受试者的靶抗原的CMI应答的简图慢性携带者受试者，和非慢性携带者受试者。慢性携带者具有针对靶抗原的独特的或特有的细胞因子特性，而非慢性携带者不具有相同的细胞因子特性。
图3A-3B显示了使用海口结核中心(Haikou TB center) 77个样品进行的 QuantiFERON TB Gold(QTG)和ASACIR TB(AT)试剂盒刺激物的对比。图3A显示了在18小时内分别用QTG和AT刺激物刺激的、从海口结核中心得到的77个新鲜的血液样品。使用 QFT E LISA平板，测试了 IFNy水平。QTG和AT之间的匹配率是 90% (精确地，89. 6%)。 图3B的表显示了使用海口结核中心77个样品进行的QuantiFERON TB Gold和ASACIR TB 试剂盒刺激物的对比。
图4的表显示了来自海口结核中心的样品的结果，分别使用QTG和AT刺激物，证实了测试的共77个结核中心病例中的8个表现出不同的应答。
图5A-5C显示了图4所示的8个病例的使用TBI (CFP)和TB2 (ESAT)的蛋白印迹分析。图5A显示了含有TBI、TB2和TB1+TB2蛋白的阳性对照样品的SDS-PAGE。图5B显示了使用在1 100稀释度的第一抗体，血浆样品(在PBS刺激以后)的蛋白印迹分析； 将抗-人-IgG-HRP用作在1 1000稀释度的第二抗体。图5C显示了与图5B所示相同的膜，其中用在1 1000稀释度的抗-his抗体成带(strip)和探测，将抗-小鼠-AP用作在 1 1000稀释度的第二抗体。在每个孔中装载6ug CFP和ESAT (各自)。在GMP环境下生产蛋白。在每个泳道中显示了 M 标志物；泳道1 样品T0602-2，TB Gold阳性(0. 35IU/ ml)，但是LF-CMI 阴性(0. 30IU/ml)；泳道 2 样品 T0604-3，TB Gold 阳性(0. 53IU/ml)，但是 LF-CMI 阴性(0. 22IU/ml)；泳道 3 样品 T0606_2，TB Gold 阴性(-0. 01IU/ml)，但是 LF-CMI 阳性(0. 70IU/ml)；泳道 4 样品 T0613-3, TB Gold 阳性(2. 64IU/ml)，但是 LF-CMI 阴性 (0. 30IU/ml)；泳道 5 样品 T0613-4，TB Gold 阳性(0. 84IU/ml)，但是LF-CMI 阴性(0. 20IU/ ml)；泳道6 样品 T0616-2，TB Gold 阴性(0. 00IU/ml)，但是LF-CMI 阳性(3. 09IU/ml)；泳道 7 样品 T0619-1, TB Gold 阳性(5. 48IU/ml)，但是 LF-CMI 阴性(0. 20IU/ml)；泳道 8 样品 T0620-2,TB Gold 阳性(3. 17IU/ml)，但是LF-CMI 阴性(0. 29IU/ml)；泳道9 样品 T0604-5， TB Gold(0IU/ml)和 LF-CMI 阴性(0. 04IU/ml)；泳道 10 样品 T0604-2，TB Gold(4. 99IU/ ml)禾口 LF-CMI 阳性 QlU/ml)。
图6显示了使用海南省立医院(Hainan Provincial Hospital)病例40个样品进行的QuantiFERON TB Gold(QTB)和ASACIR TB (TB)试剂盒刺激物的对比。在18小时内，分别用QTG和AT刺激物刺激从海南省立医院得到的40个新鲜的血液样品。使用QFT E LISA 平板测试了 IFNy水平。使用QTG刺激物，40个病例中的20个表现为阴性，但是，使用AT 刺激物，全部都是阳性，这通过蛋白印迹分析测得。
图7显示了来自海南省立医院的共40个病例中的20个的表，它显示了分别使用 QTG和AT刺激物的不同应答。
图8A-8B显示了图7所示的20个病例的样品1_10的使用GMP TBI (CFP)和 TB2 (ESAT)的蛋白印迹分析。图8A显示了血浆样品(使用PBS刺激)的蛋白印迹分析，其中在1 100稀释度使用第一抗体；使用抗-人-IgG-HRP作为在1 1000稀释度的第二抗体。 图8B显示了与图8A所示相同的膜，其中用在1 1000稀释度的抗-his抗体成带(strip) 和探测，将抗-小鼠-AP用作在1 1000稀释度的第二抗体。在每个孔中装载6ug CFP 和ESAT(各自)。在GMP环境下生产蛋白。在每个泳道中显示了 M:标志物；泳道1:样品 T0612-6,TB Gold 阴性(0. 01IU/ml)，但是LF-CMI 阳性(2. 23IU/ml)；泳道 2 样品 T0603-7， TB Gold 阴性(0. 17IU/ml)，但是 LF-CMI 阳性(9. llIU/ml)；泳道 3 样品 T0603-10, TB Gold 阴性(-0. 02IU/ml)，但是 LF-CMI 阳性(3. 99IU/ml)；泳道 4 样品 T0604-6, TB Gold 阴性(0. 01IU/ml)，但是 LF-CMI 阳性(0. 74IU/ml)；泳道 5 样品 T0604-7，TB Gold 阴性(-0. 01IU/ml)，但是 LF-CMI 阳性(0. 52IU/ml)；泳道 6 样品 T0604-8, TB Gold 阴性 (0. 03IU/ml)，但是LF-CMI 阳性(1. 50IU/ml)；泳道 7 样品 T0604-9，TB Gold 阴性(0. OlIU/ ml)，但是 LF-CMI 阳性(0. 47IU/ml)；泳道 8 样品 T0604-10, TB Gold 阴性(0. 03IU/ml)， 但是 LF-CMI 阳性(2. 81IU/ml)；泳道 9 样品 T0616-6, TB Gold 阴性(-0. 01IU/ml)，但是 LF-CMI 阳性(4. 08IU/ml)；泳道 10 样品 T0616_7，TB Gold 阴性(0. 06IU/ml)，但是 LF-CMI 阳性(2. 12IU/ml)；泳道 11 样品 T0604-5，TB Gold(0IU/ml)和 LF-CMI 阴性(0. 04IU/ml)； 泳道 12 样品 T0604-2，TB Gold(4. 99IU/ml)和 LF-CMI 阳性 QlU/ml)。
图9A-9B显示了图7所示的20个病例的样品11_20的使用GMP TB1 (CFP)和 TB2 (ESAT)的蛋白印迹分析。图9A显示了血浆样品(使用PBS刺激)的蛋白印迹分析，其中在1 100稀释度使用第一抗体；使用抗-人-IgG-HRP作为在1 1000稀释度的第二抗体。 图9B显示了与图9A所示相同的膜，其中用在1 1000稀释度的抗-his抗体成带(strip) 和探测，将抗-小鼠-AP用作在1 1000稀释度的第二抗体。在每个孔中装载6ug CFP 和ESAT(各自)。在GMP环境下生产蛋白。在每个泳道中显示了 M:标志物；泳道1 样品 T0605-5,TB Gold 阴性(0. 00IU/ml)，但是LF-CMI 阳性(1. 69IU/ml)；泳道 2 样品 T0605-8， TB Gold 阴性(0. 00IU/ml)，但是 LF-CMI 阳性(0. 57IU/ml)；泳道 3 样品 T0605-10，TB Gold 阴性(-0. 01IU/ml)，但是 LF-CMI 阳性(0. 51IU/ml)；泳道 4 样品 T0604-6, TB Gold 阴性(-0. 14IU/ml)，但是 LF-CMI 阳性(0. 73IU/ml)；泳道 5 样品 T0604-7，TB Gold 阴性 (0. 00IU/ml)，但是LF-CMI 阳性(1. 24IU/ml)；泳道 6 样品 T0612-8，TB Gold 阴性(0. OlIU/ ml)，但是 LF-CMI 阳性(1. 76IU/ml)；泳道 7 样品 T0612-11，TB Gold 阴性(0. 0IU/ml)， 但是 LF-CMI 阳性(0. 46IU/ml)；泳道 8 样品 T0612-12，TB Gold 阴性(0. 04IU/ml)，但是 LF-CMI 阳性(4. 49IU/ml)；泳道 9 样品 T0612_13，TB Gold 阴性(0. 01IU/ml)，但是 LF-CMI 阳性(0. 85IU/ml)；泳道 10 样品 T0612_14，TB Gold 阴性(-0. 02IU/ml)，但是 LF-CMI 阳性 (1. 17IU/ml)；泳道 11 样品 T0604-5，TB Gold(0IU/ml)和 LF-CMI 阴性(0. 04IU/ml)；泳道 12 样品 T0604-2，TB Gold(4. 99IU/ml)和 LF-CMI 阳性 QlU/ml)。
图10的简图总结了在CMI试验中执行的步骤，称作“LF-CMI试验”工作。将生物样品放在包含LFn-靶抗原(A、B、C代表不同的LFn-靶抗原多肽)的容器中，并温育足以诱导生物样品中的细胞的CMI应答的时间段，然后分析细胞因子的水平。
图11的表显示了本文所述的CMI试验(在图11中称作ASCIR)的对比。LF-CMI 试验的阳性预测值(PPV)是96. 2% (PPV = 51/(51+2) = 96. 2% )。因而，LF-CMI试验具有非常高的阳性预测值，例如，使用LF-CMI试验检测到53个TB阳性样品，使用TB Gold试验也检测到它们中的51个是阳性的。LF-CMI试验的阴性预测值(NPV)是100% (NPV = 7/ (0+7) = 100% )。因而，LF-CMI试验具有非常高的阴性预测值，例如，使用LF-CMI试验检测到7个TB阴性样品，使用TB Gold试验也检测到它们都是阴性的。
图12A-12C显示了使用TB培养物或TB涂片进行的LF-CMI或VTI试剂盒(例如， ASCHR试验)的对比。图12A显示了使用VTI试剂盒和TB培养物试验进行的阳性鉴别的样品的对比。在测试的21个样品中，使用VTI试剂盒将20个样品鉴别为阳性，而使用TB培养物试剂盒仅将7个鉴别为TB阳性。图12B显示了使用VTI试剂盒和TB涂片试验进行的阳性鉴别的样品的对比。使用TB涂片试剂盒将21个样品鉴别为TB阳性，使用VTI试剂盒也将其中的20个鉴别为阳性，这表明，VTI试剂盒是灵敏的，且与TB涂片试验相关联。图 12C显示了 TB涂片和TB培养物试验的对比。在相同的21个样品中，使用TB涂片试验将所有21个样品鉴别为阳性，而使用TB培养物试验仅将7个鉴别为阳性。在图12A-12B中使用的所有21个样品都来自TB涂片阳性样品。
图13的框图显示了用于评估生物样品中对靶抗原或靶抗原集合的CMI应答的存在的系统的一个实例。
图14的框图显示了在计算机可读介质上的示例性指令，其用于评估生物样品中对靶抗原或靶抗原集合的阳性或阴性CMI应答。
图15显示了共82位患者的TB阳性结果的对比，所述患者来自用皮肤试验或 ASCIR TB试验(VTI试剂盒)测试的密切接触组。使用皮肤试验，90. 的受试者被测试为阳性(++) (45. 1% )或强阳性(+++) (45. 1% )，然而使用ASCIR TB试验，仅18. 3%被测试为阳性(++),25.6%被测试为强阳性(+++)。
图16显示了共149位患者的TB阳性结果的对比，所述患者来自用皮肤试验或 ASCIR TB试验(VTI试剂盒)测试的高危组(在医院工作的受试者)。使用皮肤试验，共 98. 8%的受试者是TB阳性的，其中62. 8%的受试者被测试为阳性(++) (27.1%)或强阳性(+++) (35. 7% )，且76位受试者具有大于强阳性试验。与此相比，使用ASCIR TB试验， 71. 的受试者是阳性的，使用ASCIR TB试验，11位受试者(7. 4% )测试为阳性(++)，20 位受试者(13.4% )测试为强阳性(+++)，60位受试者具有大于强阳性试验。
图17A-17B显示了共166位受试者的TB阳性结果的对比，所述受试者来自用皮肤试验或ASCIR TB试验(VTI试剂盒)测试的大学新生体检。图17A表明，使用皮肤试验， 100%的受试者是TB阳性的，其中79. 9%的受试者被测试为阳性(++) (53.6% )或强阳性 (+++) (25. 3%) 0与此相比，使用ASCIR TB试验，30. 的受试者是阳性的，使用ASCIR TB 试验，30位受试者(18. 1% )被测试为阳性(++)，14位受试者3% )被测试为强阳性 (+++)。图17B表明，61. 3%的接受体检的受试者是皮肤试验阳性的(PPD+)，38. 7%的受测受试者是皮肤试验(PDD)阴性的。
图18的直方图显示了用3个不同试验测试的TB患者的对比涂片试验、培养物阳性试验和ASCIR TB试验。在133位作为TB患者治疗的受试者中，52 (39. 1% )位被涂片试验鉴别为阳性，44(33. 1%)位被培养物试验鉴别为阳性，102(77%)位被本文公开的ASCIR TB试验鉴别为阳性。
具体实施方式
本发明提供了使用体外或离体方案来检测和监测受试者的细胞-介导的免疫应答的试验。
目前可得到的检测CMI应答的实验室试验具有严重缺点，特别是当应用于临床场合的大疫苗效能试验时。这样的缺点包括生产用于基于肽的CMI试验的试剂的成本和困难，以及对专门设备和技术支持的需要。现有的用于检测CMI应答的方法具有限制，诸如仅在检测对靶抗原的小区域的免疫应答时是有效的，即仅可以检测到对在试验中使用的肽的 CMI应答。由于在使比肽更大的靶抗原进入细胞中时遇到的困难，现有的方法通常限于检测对靶抗原肽的CMI应答。也就是说，当前的CMI试验通常不能检测对靶抗原多肽(其大于肽)的CMI应答。
本发明至少部分地基于下述发现，即LF多肽的一部分(诸如LFn多肽或其片段) 可以将融合的靶抗原多肽(诸如完整的全长或非肽靶抗原蛋白)递送进细胞的胞质溶胶中。因此，本发明提供了使用完整的活细胞来测量细胞介导的免疫(CMI)应答的方法，其中将细胞暴露于靶抗原，所述靶抗原结合在LF多肽(诸如LFn多肽)上，其中所述LF多肽将抗原递送至细胞的胞质溶胶。在细胞已经预先对靶抗原致敏的情况下，所述细胞会释放出细胞因子，所述细胞因子指示这种预先的致敏或暴露。这样，本文描述了通过递送完整全长抗原或其非肽部分，测量活的完整细胞对靶抗原的CMI应答的方法和/或检测受试者的目标病状的方法。
因此，且如下面更详细地讨论的，本文所述的方法提供了超过现有的测定CMI应答的方法的优点。例如，本文所述的方法允许更快速地、可靠地和准确地检测完整细胞中对靶抗原的CMI应答，所述靶抗原不限于更大靶抗原的肽。更具体地，且不希望受理论的约束，目前可得到的检测CMI应答的实验室试验具有各种缺点。这样的试验包括，例如，淋巴细胞增殖试验，测量立即的和延迟的超敏反应的皮肤试验，和需要纯化用于试验中的细胞的试验(例如，在抗原刺激之前，从全血样品纯化淋巴细胞或PMBC)。缺点包括，例如，对能够进入细胞的胞质溶胶中的抗原的大小的相当严格的限制，需要裂解细胞才能检测CMI应答。现有的试验在测定向病原体的暴露时倾向于做出广阔的(或属类的)诊断，而不具有对靶抗原的变体的特异性。通常，当前的CMI试验将细胞(在纯化它以后)暴露于靶抗原的肽，后者足够小，能够进入细胞的胞质溶胶中。结果，这样的CMI试验限于检测仅对该肽的CMI应答。通过提供检测对大(和因此，非肽)靶多肽抗原或全长多肽抗原的CMI应答的方法，本发明克服了该限制。通常，使用ELISA或ELISP0T来检测对抗原刺激产生应答的 T-细胞的数目，但是准确度或特异性不足以提供关于所述抗原属于哪个变体的特异性。
以前使用的CMI试验(其使用靶抗原的肽)也可能经常产生不准确的和不可靠的或不一致的结果，诸如过高估计诊断准确度所产生的假阴性。作为一个实例，使用靶抗原的肽的CMI试验不可能表现出对使用的特定肽的CMI应答，因为免疫细胞不可能识别使用的特定肽，尽管受试者以前已经暴露于整个靶抗原。该情况被视作假阴性。相反，在第二种情况下，如果以前暴露于整个靶抗原的免疫细胞产生针对与使用的特定肽相同的靶抗原部分的应答，来自相同靶抗原的不同肽可能导致引起或检测CMI应答。因此，使用靶抗原的肽的 CMI试验在引起或检测对靶抗原的CMI应答时可以产生相反的结果，即分别阳性和阴性CMI 应答，其中靶抗原的一种肽被免疫细胞识别，靶抗原的另一种肽未被免疫细胞识别。本文所述的方法解决了一个、一些或甚至所有这样的缺点，这取决于测量CMI应答所用的确切实施方案。
本发明的一个方面提供了用于测量免疫细胞应答的方法，所述免疫细胞应答例如对靶抗原(诸如来自病原体的靶抗原)的T细胞应答。这样的实施方案可用于开发所有T 细胞依赖性的疫苗或免疫治疗。该策略适用于其中CMI应答在疾病的预防和控制中起重要作用的其它研究领域。
本发明的一个方面涉及测量完整细胞中对靶抗原的细胞介导的免疫应答的方法， 所述方法包括用与靶抗原融合的LF多肽的一部分(诸如LFn多肽或其片段)，温育包含完整细胞的生物样品。在有些实施方案中，所述靶抗原由病原体表达，例如其中所述病原体是病毒，靶抗原可以是在病毒表面上表达的多肽，诸如外壳蛋白或在病毒内部的多肽。与本文所述的方法和组合物特别相关的靶抗原包括由细胞内病原体表达的那些。可以用于本文公开的方法中的一种这样的病原体靶抗原是TBI (CFP)或TB2 (ESAT)或其片段。
在一个具体实施方案中，测量对靶抗原的细胞介导的免疫应答的方法包括用 LFn-融合多肽集合温育包含完整(即活)细胞的生物样品。在这样的一个实施方案中， LFn-融合多肽集合可以包含与靶抗原的多个不同的子部分或片段融合的LFn多肽，并共同地且累积地，LFn-融合多肽的靶抗原片段部分基本上覆盖靶抗原多肽的整个长度。检测对与LFn多肽融合的靶抗原的子部分或片段的CMI应答，具有许多优点。例如，它能够更定性地诊断CMI应答，而不是能够检测对完整的整个靶抗原的CMI应答，使用片段集合能够寻踪至(home in on)靶病原体的特定菌株和/或变体。仅作为示例性的实施例，使用HIV作为示例性的病原体，并使用gag作为示例性的靶抗原，可以使用本文公开的方法来属类地检测CMI应答，其中使用与整个gag多肽靶抗原融合的LFn多肽。如果检测到CMI应答，随后可以如下测定哪个HIV变体产生CMI应答使用LFn融合多肽集合来评估CMI应答，所述 LFn融合多肽包含gag多肽的不同部分，例如，对HIV的不同变体或菌株特异性的gag蛋白的特定片段，从而测定涉及HIV的哪个菌株、变体或亚型(即HIV1、HIV2等)。因此，本文公开的方法允许更准确地且更定性地测量对靶抗原的CMI应答，其清楚水平允许快速地且容易地区别病原性菌株、变体和亚型之间的差异。
另外，测量对LF-多肽集合(例如，本文公开的Un-融合多肽集合)的CMI应答， 可以用于添加CMI应答的另外的清楚度和准确度水平，例如以筛选假阳性或不准确的CMI 应答。例如，如果检测到对与LFn多肽融合的整个全长靶抗原的阳性CMI应答，可以如下检查CMI应答是否是真阳性或假阳性测定对LFn-融合多肽集合的CMI应答，所述LFn-融合多肽集合包含靶抗原的多个片段，所述片段共同地跨靶抗原的基本上整个区域。如果 LFn-融合多肽集合的所有LFn-融合多肽产生阳性CMI反应，对与LFn多肽融合的整个全长靶抗原的阳性CMI反应可能是假阳性，其理论基础是，通常不会针对靶抗原的每个部分产生免疫应答。但是，如果仅仅一些(例如大致约至少约10%，或至少约20%，或至少约30%，或至少约40%，或超过40%但是小于100% ) LFn-融合多肽集合产生阳性CMI反应， 对与LFn多肽融合的整个全长靶抗原的阳性CMI反应可能是真阳性，这基于相同的理论，即通常不会针对靶抗原的每个部分产生免疫应答。
以另一种方式来阐述，并使用TBl作为例证性实施例，如果检测到对LFn融合多肽 (其包含TBl抗原，诸如本文公开的SEQ ID NO 7)的CMI应答，可以如下测定该TBl完整抗原-诱导的CMI应答是否是真阳性(并从而消除它作为假阳性)检测对LFn-融合多肽集合的CMI应答，所述LFn-融合多肽包含TBl部分。例如，这样的LFn-融合多肽集合可以包含TBl靶抗原的多个片段，所述片段共同地跨TBl靶抗原的基本上整个区域。跨TBl的这样的LFn-融合多肽集合的一个实例可以包含与LFn多肽或其片段融合的TBl片段(诸如本文公开的SEQ ID N0:30至SEQ ID NO :46)，以建立17个TB 1片段LFn-融合多肽的集合。如果该集合的所有17个TBl片段Un-融合多肽产生阳性CMI反应，对与LFn多肽融合的SEQ ID NO 7的全长TBl靶抗原的阳性CMI反应可能是假阳性。但是，如果TBl片段LFn-融合多肽集合中的仅仅一些(例如17个TBl片段LFn-融合多肽集合中的2个或 3个或4个或5个或6个或7个或8个或多达15个)产生阳性CMI反应，对与LFn多肽融合的SEQ ID NO :7的全长TBl靶抗原的阳性CMI反应可能是真阳性。基本上覆盖靶抗原的整个长度的融合多肽集合可以是至少2个不同的多肽，最多任意数目的不同的LF多肽-融合多肽，例如，至少2个不同的多肽，或2-5个或5-10个或11-15个或16-20个或更多个不同的Un-融合多肽。
此外，本发明可用作表位作图的高处理量方法。例如，通过测量对Un-融合多肽集合的CMI应答，所述LFn-融合多肽包含靶抗原的多个不同的子部分或片段，可以鉴别靶抗原的哪个子部分或片段产生强CMI应答，并从而绘制引起强CMI应答的靶抗原的表位的图谱。这样的表位作图可用于鉴别用于疫苗开发的靶抗原区域，或者它们在针对靶抗原的高度特异性的且准确的诊断性CMI试验中的应用。
本文所述的方法也可以适合诊断和/或监测涉及不适当的或不充分的免疫功能的疾病或障碍。例如，本文所述的方法可以用于监测或诊断自身免疫病，其中使用自身抗原作为与LF多肽融合的靶抗原。对这样的靶抗原的CMI应答的检测，指示受试者已经产生或正在维持对自身抗原的细胞介导的免疫应答。这类试验受益于不依赖于产生的应答所针对的具体表位的知识。类似的方案可以用于诊断或监测炎性疾病。所述方法也可以适合预测给定的个体是否是治疗疫苗(例如，用于引起针对肿瘤细胞的免疫应答的癌症治疗疫苗) 的候选人。
定义
为了方便，在这里收集了在整个申请(包括说明书、实施例和所附的权利要求书) 中采用的某些术语。除非另外定义，在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。
本文使用的术语“佐剂”表示会增加细胞对靶抗原的抗原应答的任意药剂或实体。
术语“保护抗原”或“PA”在本文中可互换地用于表示炭疽芽孢杆菌外毒素二分蛋白的一部分，其通过细胞受体结合到哺乳动物细胞的表面上。术语“PA”具有它的完整的且有功能的受体结合位点。美国专利5，591，631和5，677，274(通过引用作为整体并入)描述了这样的PA融合蛋白其将PA靶向特定细胞，诸如癌细胞和HIV-感染的细胞，使用靶向的细胞上的受体的配体作为融合配偶体。
本文使用的术语“致死因子”或“LF”泛指二分炭疽芽孢杆菌外毒素的非-PA多肽。野生型的、完整的炭疽芽孢杆菌LF多肽具有在GenBank登录号M29081 (基因ID No 143143)中所述的氨基酸序列，其对应SEQ ID NO :1。SEQ ID NO 1对应这样的LF 所述LF 具有位于它的N-端的残基1-33处的信号肽。换而言之，未成熟的野生型LF对应809氨基酸蛋白，该蛋白包括在N-端处的33氨基酸信号肽。含有以粗体突出显示的信号肽的未成熟的野生型LF的氨基酸序列(SEQ ID NO 1)如下
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未成熟的LF蛋白的切割，会产生长度为776个氨基酸的成熟的野生型LF多肽。成熟的野生型LF多肽(即缺少N-端信号肽)的776个氨基酸多肽序列对应下述的SEQ ID NO 2
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NDQIKFIINS(SEQ ID NO 2)
术语“LF多肽”不仅适用于全长野生型LF (具有或没有信号序列)，而且适用于其片段，所述片段介导融合的或物理结合的多肽向细胞的细胞内递送。术语“LF多肽”也包括 LF的保守置换变体，包括介导这种细胞内递送的保守置换变体。
当提及肽时，术语“置换”表示用氨基酸替换不同的氨基酸部分。置换可以是保守的或非保守的置换，如下文进一步所述。
术语“LFn多肽”表示这样的炭疽芽孢杆菌LF的N-端片段其没有表现出锌金属蛋白酶活性，也不会灭活促分裂原活化的激酶活性，或二者兼有，但是介导融合多肽的细胞内或跨膜递送。因而，Un多肽是LF多肽的子集。预见到本文所述的每个方法和/或试剂盒使用一种或多种LF多肽，所述LF多肽与靶抗原物理结合，例如融合。在本文中定义和描述的Un多肽是优选的。在一个方面，“Un多肽”包括SEQ ID NO :3，其对应288氨基酸未成熟的LFn蛋白；该LFn蛋白是“未成熟的”，因为它包括位于N-端的残基1_33处的信号肽。换而言之，未成熟的LFn对应288氨基酸蛋白，其包括在N-端处的33氨基酸信号肽。 SEQ ID NO 3的未成熟的Un蛋白的信号肽切割，会产生长度为255个氨基酸的成熟的LFn 多肽。应当强调的是，为了本文所述的方法和组合物的目的，LF和/或Un多肽可以包括或缺少信号肽——也就是说，预期信号肽的存在或缺失不会影响LF多肽在本文所述的方法中作为跨膜运输促进剂的活性。含有以粗体突出显示的信号肽的未成熟的LFn的氨基酸序列(SEQ ID NO 3)如下
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成熟的LFn多肽(其缺少N-端信号肽)的多肽序列的长度是255个氨基酸，并对应下述的SEQ ID NO 4
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在“LFn的功能片段”的背景下使用的术语“功能片段”表示这样的LFn多肽的片段其介导、实现或促进跨完整的活细胞的膜的抗原运输。这样的LFn多肽片段的一个实例是Un的104氨基酸C-端片段，其对应下述的SEQ ID NO :5 (该序列也在美国专利申请 10/473190中公开为SEQ ID NO :3，所述美国专利申请通过引用并入本文)
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本文使用的术语“LFn多肽”包括本文所述的每种“未成熟的”LFn和“成熟的”LFn 分子、以及它们的介导、实现或促进物理结合的(例如融合的)多肽跨完整的活细胞的膜的运输的片段、变体(包括保守置换变体)和衍生物。特别地预见到用于本文所述的方法、 组合物和试剂盒中的LFn多肽的其它片段包括这样的片段所述片段包含SEQ ID NO 3的 C-端60、80、90、100或104个氨基酸或其保守置换变体，或任选地基本上由它们组成，所述保守置换变体介导、实现或促进物理结合的(例如融合的)多肽跨活细胞的完整膜的转移。
作为在本文中使用的术语，靶抗原的“片段”的长度是至少15个氨基酸，且可以是，例如，至少16、至少17、至少18、至少19、至少20或至少25个氨基酸或更大。因而，在例如制备靶抗原片段-LF多肽集合的情况下，靶抗原片段的长度是至少15个氨基酸。
术语“细胞毒性的T淋巴细胞”或“CTL”表示诱导靶向的细胞的细胞凋亡的淋巴细胞。经由TCR与在靶细胞表面上的加工过的抗原(Ag)的相互作用，CTL与靶细胞形成抗原特异性的缀合物，导致靶向的细胞的细胞凋亡。凋亡小体被巨噬细胞消除。术语“CTL应答”用于表示由CTL细胞介导的初次免疫应答。
本文使用的术语“细胞介导的免疫”或“CMI”表示这样的免疫应答其不涉及抗体或补体，但是涉及巨噬细胞、天然杀伤细胞(NK)、抗原特异性的细胞毒性的T-淋巴细胞 (T-细胞)的活化以及响应于靶抗原的各种细胞因子的释放。换而言之，CMI表示这样的免疫细胞(诸如T细胞和淋巴细胞)其结合到展示抗原的其它细胞(诸如抗原呈递细胞 (APS))的表面上，并触发应答。所述应答可能涉及其它淋巴细胞和/或任意其它白血细胞 (白细胞)以及细胞因子的释放。因此，细胞-介导的免疫(CMI)是这样的免疫应答其不涉及抗体，但是涉及巨噬细胞和NK-细胞的活化、抗原特异性的细胞毒性的T-淋巴细胞的生产以及响应于抗原的各种细胞因子的释放。细胞免疫通过下述机理保护身体(i)活化抗原特异性的细胞毒性的T-淋巴细胞(CTL)，其能够破坏在它们的表面上展示外来抗原的表位的身体细胞，诸如病毒感染的细胞、具有细胞内细菌的细胞和展示肿瘤抗原的癌细胞；(2)活化巨噬细胞和NK细胞，使它们能够破坏细胞内病原体；和(3)刺激细胞分泌多种细胞因子，所述细胞因子会影响适应性免疫应答和先天性免疫应答所涉及的其它细胞的功能。不希望受理论的约束，且作为背景，将免疫系统分成2个分支体液免疫，它的免疫保护功能存在于体液(无细胞的体液或血清)中；和细胞免疫，它的免疫保护功能与细胞有关。
本文使用的术语“免疫细胞”表示可以响应于直接或间接的抗原刺激而释放出细胞因子的任意细胞。术语“免疫细胞”在本文中包括淋巴细胞，包括天然杀伤(NK)细胞、T-细胞(CD4+和/或CD8+细胞)、B-细胞、巨噬细胞和单核细胞、Th细胞；Thl细胞；Th2 细胞；Tc细胞；基质细胞；内皮细胞；白细胞；树突细胞；巨噬细胞；肥大细胞和单核细胞， 以及能够响应于直接或间接的抗原刺激而生产细胞因子分子的任意其它细胞。通常，免疫细胞是淋巴细胞，例如T-细胞淋巴细胞。
本文使用的术语“细胞因子”与术语“效应分子”互换使用，并表示免疫细胞响应于抗原刺激而释放出的分子。这样的细胞因子的实例包括，但不限于GM-CSF ;IL_1 α ； IL-I β ；IL-2 ；IL-3 ；IL-4 ；IL-5 ；IL-6 ；IL-7 ；IL-8 ；IL-10 ；IL-12 ；IFN-α ； IFN-β ； IFN-Y ；MIP-I α ；MIP-I β ；TGF-β ；TNF α 禾口 TNF3。
本文使用的术语“复合物”表示2个或更多个分子的集合，其中它们通过除了共价相互作用以外的方式在空间上连接；例如，它们可以通过静电相互作用(诸如范德华力等) 来连接。
本文使用的术语“融合蛋白，，表示通过肽键相连的2个或更多个蛋白的重组蛋白。 可以如下生产融合蛋白例如，将编码一种蛋白的核酸序列连接到编码另一种蛋白的核酸序列上，使得它们构成单个开放读码框，该开放读码框可以翻译成包含所有目标蛋白的单个多肽。
术语“转移进细胞”表示，将部分(诸如靶抗原和任选的LFn多肽、LFn同源物或模仿物或它们的变体)从在细胞外的位置跨过质膜移动至完整活细胞的内部。
术语“转导”表示将核酸导入细胞中的任意方法，例如，通过转染、脂转染、电穿孔、 基因枪法、被动吸收、脂质核酸复合物、病毒载体转导、注射、接触裸DNA等。
术语“体内”表示在动物中发生的试验或过程。
术语“离体”表示使用在体外的具有完整膜的活细胞进行的试验，所述活细胞例如外植体、培养的细胞(包括原代细胞和细胞系、转化的细胞系)和提取的组织或细胞(包括血细胞)以及其它。
本文所述的试验也可以表征为“体外”试验，因为它们是在受试者体外的容器中进行。应当理解，在术语“体外”被用于或可能用于本文所述的试验的情况下，CMI试验需要完整的活细胞，包括活的免疫细胞。样品也需要能够加工和展示靶抗原的细胞。尽管CMI试验本身需要完整的活细胞，应当理解，在这样的细胞已经接触LF多肽-靶抗原融合体或复合物以后，通过不一定需要完整细胞的体外方案，可以测量由这些细胞释放的细胞因子的类型和量。
术语“哺乳动物”意图包括包括单个“哺乳动物”和多个“哺乳动物”、且包括但不限于人类；灵长类动物诸如猿、猴、猩猩和黑猩猩；犬科动物诸如狗和狼；猫科动物诸如猫、 狮子和虎；马科动物诸如马、驴和斑马、食物动物诸如牛、猪和绵羊；有蹄动物诸如鹿和长颈鹿；啮齿类动物诸如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；和熊。在有些实施方案中、哺乳动物是人。
本文使用的术语“受试者”表示这样的任意动物其中诊断CMI应答是有用的，例如用于诊断受试者是否具有疾病或病症，或可能发展疾病或病症。所述受试者可以是哺乳动物例如人，或可以是野生动物、驯养动物、商业动物或伴侣动物。尽管在本发明的一个实施方案中，预见到CMI试验适用于在人类中的诊断用途，它也适用于所有脊椎动物，例如哺乳动物(诸如非人灵长类动物(具体地，高等灵长类动物)、绵羊、狗、啮齿动物(例如小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔、牛)以及非哺乳动物(诸如鸡)、两栖动物、爬行动物等。在一个实施方案中，所述受试者是人。在另一个实施方案中，所述受试者是野生动物，例如鸟， 诸如用于诊断禽流感。在有些实施方案中，所述受试者是作为疾病模型的实验动物或动物代用品。所述受试者可以是需要兽医治疗的受试者，包括治疗伴侣动物(诸如狗和猫)和驯养动物(诸如马、矮马、驴、骡、美洲驼、羊驼、猪、牛和绵羊)或动物园动物(诸如灵长类动物、猫科动物、犬科动物、牛科动物和有蹄动物)或家畜动物(诸如猪、牛和绵羊)，其中对病原体的CMI应答的检测可用于预防疾病和/或控制疾病的传播，所述疾病例如SIV、STLU SFV，或在家畜的情况下，口蹄疫和其它这样的疾病。
术语“生物样品”表示生物组织、细胞或流体的样品，其处于健康和/或病理状态， 含有本文所述的免疫细胞以及能够加工和展示细胞内多肽抗原的细胞。这样的样品包括、 但不限于全血、培养的细胞、原代细胞制品、痰、羊水、组织或细针吸活组织检查样品、腹膜液和胸膜液以及其它。在有些实施方案中，生物样品取自人患者，在替代实施方案中，生物样品取自任意哺乳动物诸如啮齿类动物、疾病的动物模型、商业动物、伴侣动物、狗、猫、绵羊、牛和猪等。生物样品可以在必要时预处理用于保藏或储存，如果需要，在适当的缓冲液中稀释或浓缩。但是，样品必须含有活细胞。可以采用许多标准的水性缓冲液中的任一种， 所述缓冲液采用生理PH多种缓冲剂(诸如磷酸盐、Tris等)之一，处于生理pH。在某些情况下，在用于本文公开的试验之前，可以将生物样品储存备用。这样的储存可以是在+4 °C或冷冻，例如在_20°C或_80°C，条件是，使用合适的冷冻保存剂来维持细胞生存(在细胞解冻以后)。
术语“组织”表示类似地专门化的细胞的群或层，所述细胞一起执行某些特殊功能。术语“组织-特异性的”表示来自特定组织的细胞源。术语“组织”意图包括，血液、血液制品诸如血浆和血清、骨、关节、肌肉、平滑肌和器官。
本文使用的术语“病原体”表示在受试者中造成疾病或障碍的生物体或分子。例如，病原体包括、但不限于病毒、真菌、细菌、寄生物和其它传染性的生物体或源自它的分子，以及在分类藻类、真菌、酵母和原生动物等内的分类学上有关的大型生物体。
“癌细胞”表示癌性的、癌前的或转化的细胞，无论是在体内、离体还是在组织培养物中，其具有自发的或诱导的表型变化，所述变化不一定涉及新遗传物质的摄入。尽管转化可以源自转化病毒的感染和新基因组核酸的掺入或外源性核酸的摄入，它也可以自发地产生，或在暴露于致癌物以后产生，由此突变内源基因。转化/癌症与合适的动物宿主(诸如裸鼠)中的下述现象有关例如，形态学变化、细胞的永生化、异常的生长控制、灶性形成、 锚着非依赖性、恶性肿瘤、生长的接触抑制和密度限制的丧失、生长因子或血清非依赖性、 肿瘤特异性的标志物、侵袭力或转移和肿瘤生长(也参见Freshney，Culture of Animal Cells :A Manual of Basic Technique (1994 年第 3 版))。
术语“野生型”分别表示天然存在的、正常的编码蛋白的多核苷酸序列或其一部分、或蛋白序列或其一部分，它通常存在于体内。因此，如本文公开的，Un蛋白的野生型氨基酸序列对应SEQ ID N0:3(具有信号肽)和/或SEQ ID NO 4 (没有信号肽)，其对应致死因子(LF)的N-端片段。
术语“突变体”表示这样的生物体或细胞它的遗传物质具有任何变化，尤其是相对于野生型多核苷酸序列的变化(即、删除、置换、添加或改变)，或相对于野生型蛋白序列的任何变化。术语“变体”与“突变体”互换使用。尽管经常假定遗传物质的变化会导致蛋白的功能的变化，术语“突变体”和“变体”表示野生型蛋白的序列的变化，无论该变化是否改变蛋白的功能(例如，增加、减少、赋予新功能)，或该变化是否对蛋白的功能没有影响(例如，突变或变异是沉默的)。
术语“多肽”和“蛋白”互换地用于表示通过肽键相连的氨基酸残基的聚合物，且对于要求保护的发明的目的，具有至少15个氨基酸的最小长度。寡肽、寡聚体、多聚体等通常表示更长的氨基酸链，且也由通过肽键相连的线性排列的氨基酸组成，无论是生物地、重组地还是合成地生产的，也无论是由天然存在的氨基酸还是由非天然存在的氨基酸组成，都包括在该定义中。该定义包括全长蛋白和其片段。该术语也包括多肽的共翻译的修饰(例如，信号肽切割)和翻译后的修饰，例如，二硫键形成、糖基化、乙酰化、磷酸化、蛋白水解性裂解(例如，由弗林蛋白酶或金属蛋白酶切割)等。此外，本文使用的“多肽”表示这样的蛋白其包括对天然序列的修饰，诸如删除、添加和置换(通常在性质上是保守的，如本领域技术人员已知的)，只要所述蛋白维持希望的活性。这些修饰可以是故意的(如通过定点诱变)，或可以是意外的，诸如通过生产蛋白的宿主的突变，或由PCR扩增或其它重组DNA 方法引起的错误。对于本文所述的方法、试剂盒和组合物，术语“肽”表示肽连接的氨基酸序列，其长度含有至少2个且小于15个氨基酸。
应当理解，蛋白或多肽经常含有除了通常称作20种天然存在氨基酸的20种氨基酸以外的氨基酸，可以修饰给定的多肽中的许多氨基酸(包括末端氨基酸)，无论是通过天然的过程诸如糖基化和其它翻译后修饰，还是通过本领域众所周知的化学修饰技术。可以存在于本发明肽中的已知修饰包括、但不限于乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、多核苷酸或多核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸盐的形成、制剂、Y-羧基化、糖化、糖基化、GPI锚点形成、 羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、转移-RNA介导的氨基酸向蛋白的添加诸如精氨酰化和泛素化。
术语“同源性”、“同一性”和“相似性”表示2个多肽之间或2个最佳比对的核酸分子之间的序列相似性程度。同源性和同一性各自可以如下测定对比每个序列中的位置，所述位置可以为了对比目的而比对。例如，可以基于使用处于默认设置的标准同源性软件，诸如BLAST2.2. 14版。当对比的序列中的等同位置被相同碱基或氨基酸占据时，则所述分子在该位置是同一的；当等同位置被类似氨基酸残基占据时(例如，在空间和/或电子性质方面类似，例如保守氨基酸置换)，则所述分子可以称作在该位置是同源的(相似的)。同源性 /相似性或同一性的百分比表述表示在对比的序列各自共有的位置处类似或同一氨基酸的数目的函数。“无关的”序列与本文公开的序列具有小于40%同一性，尽管优选地小于25% 同一性。
本文使用的术语“同源的”或“同源物”互换使用，且当用于描述多核苷酸或多肽时，表示2个多核苷酸或多肽或其指定的序列在最佳比对和对比时(例如使用BLAST 2. 2. 14版，使用默认参数进行比对(参见本文))在至少70%的核苷酸、通常约75% -99% 和更优选至少约98-99%的核苷酸中是同一的，并具有适当的核苷酸插入或删除或氨基酸插入或删除。本文使用的术语“同系物”或“同源的”也表示关于结构和/或功能的同源性。 也就是说，执行与另一个物种中的给定多肽相同的功能的多肽，可以视作给定多肽的同系物。技术人员可以容易地确定基因或多肽的同系物的测定。
为了序列对比，通常，一个序列作为参照序列，将测试序列与其对比。当使用序列对比算法时，将测试序列和参照序列输入计算机中，如果必要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后，序列对比算法基于指定的程序参数，计算测试序列相对于参照序列的序列同一性百分比。
在必要时或希望时，可以进行对比的序列的最佳比对，例如，通过Smi th和 Waterman的局部同源性算法(Adv. Appl. Math. 2 :482 (1981)，它通过引用并入本文)， 通过 Needleman 和 Wunsch 的同源性比对算法(J. Mol. Biol. 48 :443-53 (1970)，它通过引用并入本文)，通过Pearson和Lipman的搜索相似性方法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:^44-48(1988)，它通过引用并入本文)，通过这些算法的计算机化的执行(例如、在 Wisconsin Genetics 软件包中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA，Genetics Computer Group, 575Science Dr.，Madison, Wis·)，或通过目检(通常参见 Ausubel 等人 (编)，Current Protocols in Molecular Biology,第 4 版，John Wiley and Sons, New York (1999))ο
有用的算法的一个实例是PILEUP。PILEUP采用渐进的逐对序列比对，产生来自一组相关序列的多重序列比对，以显示序列同一性百分比。它也绘出一个树(tree)或枝叉图 (dendogram)，显示用来产生所述比对的成簇关系。PILEUP采用！^ng和Doolittle的渐进比对法的简化方法(J. Mol. Evol. 25 :351-60(1987)，它通过引用并入本文)。所用的方法类似于 Higgins 和 Sharp 描述的方法(Comput. Appl. Biosci. 5 151-53 (1989)，它通过引用并入本文)。该程序可以比对最多达300个序列，每个序列的最大长度为5，000个核苷酸或氨基酸。多重序列对比法从两个最相似的序列的逐对比对开始，产生一组(cluster)两个比对的序列。然后将该组与下一个最相关的序列或下一组比对的序列进行比对。通过简单地延伸两个单独序列的逐对比对，将两组序列进行比对。通过一系列渐进的逐对比对，得到最后的比对。通过指定序列对比区的特定序列及其氨基酸或核苷酸坐标，并且指定该程序的参数，运行该程序。例如，可以将参照序列与其它测试序列对比，采用以下参数，测定序列同一性百分比关系默认间隙加权值(3. 00)、默认间隙长度加权值(0. 10)和加权的末端间隙。
适用于测定序列同一性和序列相似性百分比的算法的另一实例是BLAST算法，其在Altschul等人(J. Mol. Biol. 215 :403-410 (1990)，它通过引用并入本文)中有描述。(也参见 Zhang 等人，Nucleic Acid Res. 26 :3986-90(1998) ；Altschul 等人，Nucleic Acid Res. 25 :3389-402 (1997)，它们通过引用并入本文)。公众可从国家生物技术信息中心互联网网址得到进行BLAST分析的软件。该算法包括，通过在查询序列中鉴别长度为W的短字 (short words)，首先鉴别高计分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字进行比对时，它们或者匹配或者满足某些阳性值的阈值计分Τ。T称为相邻字计分阈值(Altschul等人(1990)，同上)。这些起始的相邻字命中用作种子，用于起始搜寻，以寻找含所述字命中的更长HSP。然后，只要可以增加累积的比对计分，则所述字命中在两个方向上沿每个序列延伸。在以下情况下，每个方向上所述字命中的延伸停止由于来自其最大得到的数值的数量X，累积的比对计分下降；由于一个或多个负计分的残基比对的累积，累积计分转为零或零以下；或达到两个序列之一的末端。BLAST算法的参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用下述默认值字长(W)为11，BL0SUM62计分矩阵(参见HenikofT和 Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 10915-9 (1992)，它通过引用并入本文)比对(B) 为50，期望值(E)为10，M = 5，N = -4，并且对比两条链。
除了计算序列同一性百分比外，BLAST算法也进行两个序列之间相似性的统计学分析(参见，例如，Karlin和Altschul，Proc. Natl.Acad. Sci. USA 90 :5873-77 (1993)，它通过引用并入本文)。BLAST算法提供的相似性的一种度量是最小总和概率(P(N))，这提供偶然发生两个核苷酸序列或氨基酸序列之间匹配的概率的指标。例如，如果在测试氨基酸与参照氨基酸的对比中，最小总和概率小于约0. 1、更通常小于约0. 01、最通常小于约0. 001， 则认为该氨基酸序列与参照氨基酸序列相似。
本文使用的术语“序列同一性”是指，2个多核苷酸或氨基酸序列在对比窗内是同一的(即，在逐个核苷酸或逐个残基的基础上)。术语“序列同一性百分比1Π下计算在对比窗内对比2个最佳比对的序列，测定在两个序列中存在相同核酸碱基(例如、A、T.C、G、U 或I)或氨基酸残基的位置的数目，以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以对比窗中的位置总数(S卩，窗大小)，并将结果乘以100，得到序列同一性百分比。
本文使用的术语“变体”表示这样的多肽或核酸其与天然存在的多肽或核酸相差一个或多个氨基酸或核酸删除、添加、置换或侧链修饰，仍然保留天然存在的分子的一种或多种特定功能或生物活性。氨基酸置换包含这样的改变其中将一个氨基酸替换为不同的天然存在的或非常规的氨基酸残基。这样的置换可以归类为“保守的”，在该情况下，在多肽中包含的氨基酸残基被替换为在极性、侧链功能或大小方面具有类似特性的另一个天然存在的氨基酸。本文所述的变体包括的置换也可以是“非保守的”，其中在肽中存在的氨基酸残基被置换为具有不同性质的氨基酸(例如，用丙氨酸置换带电荷的或疏水的氨基酸)，或者，其中天然存在的氨基酸被置换为非常规氨基酸。当关于多核苷酸或多肽来使用时，术语 “变体”也包括，分别与参照多核苷酸或多肽相比(例如，与野生型多核苷酸或多肽相比)， 一级、二级或三级结构的变异。Un多肽的“变体”表示在结构和功能方面与SEQ ID NO 3 的多肽基本上类似的分子，其中所述功能是介导、实现或促进结合的或融合的多肽跨来自受试者的活细胞的细胞膜的运输的能力。在有些实施方案中，SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 4的变体是本文公开的SEQ ID NO :3或4的片段，诸如SEQ ID NO :5。
在下述情况下，称一个分子与另一个分子“基本上类似”两个分子具有基本上类似的结构(即，通过设定在默认参数的BLASTp比对测得，它们的氨基酸序列具有至少50% 相似性)，且在至少一种有关的功能方面基本上类似(在这里，例如，在介导、实现或促进结合的或融合的多肽跨完整活细胞的膜的运输中，具有至少50%活性)。通过本领域已知的方法，可以测量跨膜运输。为了避免任何混淆，优选的方法是在Kushner等人，2003，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 :6652-6657 中描述的方法。
当提及LFn的变体或LFn的功能衍生物来使用时，术语与由SEQ ID NO 3编码的 LFn蛋白相比“基本上类似”是指，特定主题序列(例如，LFn片段或LFn变体或LFn衍生序列)与由SEQ ID NO :3编码的Un多肽的序列相差相对于SEQ ID NO :3的一个或多个置换、 删除或添加，但是保留由SEQ ID NO :3的Un蛋白表现出的跨膜运输促进活性的至少50%， 且优选更高，例如至少60%、70%、80%、90%或更高(已经公认，LFn不会天然存在——“天然的”或“自然的” LFn序列意图表示，该序列与在本文中命名为LFn的天然存在的LF多肽的部分是相同的)。在测定多核苷酸序列时，所有能够编码基本上类似的氨基酸序列的主题多核苷酸序列，都被视作与参照多核苷酸序列基本上类似，不论密码子序列中的差异。在下述情况下，核苷酸序列与给定的LFn核酸序列“基本上类似”:(a)所述核苷酸序列与天然 1^11序列的编码区杂交，或(b)所述核苷酸序列能够在中等严谨条件下与由SEQ ID N0:1编码的Un的核苷酸序列杂交，并具有与天然Un蛋白类似的生物活性；或(c)作为遗传密码的结果，所述核苷酸序列相对于在(a)或(b)中定义的核苷酸序列是简并的。通常，基本上类似的蛋白与天然蛋白的对应序列具有大于约80%相似性。
变体可以包括保守或非保守的氨基酸变化，如下所述。多核苷酸变化可以导致由参照序列编码的多肽的氨基酸置换、添加、删除、融合和截短。变体也可以包括氨基酸的插入、删除或置换(包括氨基酸和其它分子的插入和置换)，它们通常不发生于作为变体基础的肽序列中，例如但不限于在鸟氨酸的插入，这通常不发生于人蛋白中。“保守氨基酸置换” 源自将一个氨基酸置换为另一个具有类似结构和/或化学性质的氨基酸。提供功能上类似的氨基酸的保守置换表，是本领域众所周知的。例如，下面的6个组各自含有彼此为保守置换的氨基酸1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸⑴；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E) ；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q) ；4)精氨酸(R)、赖氨酸⑷；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸⑴、色氨酸(W)。(也参见Creighton， Proteins, W. H. Freeman and Company(1984).)
基于肽中要置换的氨基酸的位置，例如如果所述氨基酸是在肽的外表上并暴露于溶剂，或在内部且不暴露于溶剂，可以选择保守氨基酸。这样的保守氨基酸置换的选择，属于本领域普通技术人员的技能，且描述在，例如Dordo等人，J.Mol Biol, 1999,217, 721-739，和 Taylor 等人，J. Theor. Biol. 119(1986) ；205-218，和 S. French 和 B. Robson, J.Mol. Evol. 19(1983) 171。因此，可以选择适合在蛋白或肽的外表上的氨基酸(即暴露于溶剂的氨基酸)的保守氨基酸置换。这些置换包括、但不限于下述的用F置换Y，用S或K 置换T，用A置换P，用D或Q置换E，用D或G置换N，用K置换R，用N或A置换G，用S或K 置换T，用N或E置换D，用L或V置换I，用Y置换F，用T或A置换S，用K置换R，用N或 A置换G，用R置换K，用S、K或P置换A。
在替代实施方案中，也可以选择适合在蛋白或肽的内部的氨基酸的保守氨基酸置换。例如，对于在蛋白或肽的内部的氨基酸(即所述氨基酸不暴露于溶剂)，可以使用合适的保守置换。例如，可以使用下述的保守置换其中用F置换Y，用A或S置换T，用L或V 置换I，用Y置换W，用L置换M，用D置换N，用A置换G，用A或S置换T，用N置换D，用L 或V置换I，用Y或L置换F，用A或T置换S，和用S、G、T或V置换A。在有些实施方案中， 在术语“变体”内也包括含有非保守氨基酸置换的LF多肽。Un多肽的变体(例如SEQ ID N0:3或4的变体)意在表示在结构(即，通过使用默认参数的BLASTp分析测得，具有至少50%同源性)和功能(即，在跨膜运输方面，具有SEQ ID NO 3的多肽的有效性的至少 50% )上与SEQ ID NO :3或4的分子基本上类似的任意分子。
本文使用的术语“非保守的”表示用一个氨基酸残基置换具有不同化学性质的不同氨基酸残基。非保守置换的非限制性实例包括用甘氨酸(G)置换天冬氨酸(D)；用赖氨酸(K)置换天冬酰胺(N)；和用精氨酸(R)置换丙氨酸(A)。
本文使用的术语“衍生物”表示已经化学修饰的肽，例如通过泛素化、标记、聚乙二醇化(用聚乙二醇衍生化)或添加其它分子。当一个分子含有通常不是该分子的一部分的额外化学部分时，它也是另一个分子的“衍生物”。这样的部分可以改善分子的溶解度、吸收、生物半衰期等。或者，所述部分会降低分子的毒性，或消除或减弱分子的不希望的副作用等。能够介导这类效应的部分，公开在Remington，s Pharmaceutical Sciences，第18 版，A. R. Gennaro,编，MackPub 1. , Easton, PA(1990)。
当与“衍生物”或“变体”结合使用时，术语“有功能的”表示这样的蛋白分子其生物活性与实体或分子的生物活性基本上类似，且其是所述实体或分子的衍生物或变体。 在该背景下，“基本上类似”是指，所述生物活性(例如，结合的多肽的跨膜运输)是参照物 (例如，对应的野生型多肽)的活性的至少50%，优选至少60%活性，70%活性，80%活性， 90%活性，95%活性，100%活性或甚至更高(即，所述变体或衍生物具有比野生型更大的活性)，例如，110%活性、120%活性或更高。
在本文中使用的术语“插入”或“删除”通常是在约1-5个氨基酸的范围内。考虑到维持功能所允许的变异可以实验地确定，其中合成地生产肽，同时使用重组DNA技术，在序列中系统地产生核苷酸的插入、删除或置换。
术语“特异性地结合”表示，以10微摩尔或更小、优选1微摩尔或更小、更优选 IOOnM或更小、IOnM或更小或InM或更小的Kd进行结合。
“基本上纯的”是指这样的核酸、多肽或其它分子其已经与天然地伴随它的组分分离开。通常，当多肽去除了至少约60 %或至少约70 %、至少约80 %、至少约90 %、至少约 95%或甚至至少约99% (按重量计算)的天然地伴随它的蛋白和天然存在的有机分子时， 多肽基本上是纯的。可以如下得到基本上纯的多肽例如，通过从天然来源提取，通过在通常不表达该蛋白的细胞中表达重组核酸，或通过化学合成。
本文使用的术语“参照水平”表示给定的细胞因子的细胞因子水平，它会提供基线，相对于该基线来测量CMI应答。作为一个例证性实例，可以将细胞因子X的参照水平计算为，来自至少一个阴性对照生物样品的细胞因子X的细胞因子基因和/或蛋白表达的平均水平，所述生物样品例如，从一个或多个尚未预先暴露于靶抗原的受试者得到的生物样品。通常，将参照水平标准化为“0”值，在本文公开的CMI试验中测得的细胞因子水平相对于参照水平的增加，指示阳性CMI应答。参照物可以来自未受给定的病状影响的个体， 或者，来自待测试的相同个体，其中这样的样品在更早的时间采取。参照物也可以是合并的样品，所述样品取自未受目标病状影响的多个个体。在适当时，参照物也可以是给定的细胞因子的固定的阈值水平，大于该阈值水平的值会指示病理状态或病原体的存在。优选地，参照样品来自具有与受测个体类似的特征的个体或个体集合，例如，参照物可以取自具有类似年龄、性别、人种(rave)或种族背景等的个体。在有些实施方案中，也可以使用其它参照水平，例如阳性参照水平可以用作CMI反应的阳性对照。通常，在使用阳性参照水平的情况下，如果在本文公开的CMI试验中测量的细胞因子与相同细胞因子的阳性参照水平的值基本上相同或接近，则它指示阳性CMI应答。
本文使用的术语“减少的”或“减小”或“降低”通常是指，与参照相比统计上显著的量的减少。但是，为了避免疑惑，“减少的”是指，与参照水平相比统计上显著地减少了至少 10%，例如减少了至少20%、至少30%、至少40%、至少50%或至少60%或至少70%或至少80%、至少90%或更多，最多达到且包括100%减少(即与参照样品相比不存在水平)，或与参照水平(作为在本文中定义的该术语)相比在10-100%之间的任何减少。
本文使用的术语“低”通常是指，减少了统计显著的量；为了避免疑惑，“低”是指比参照水平降低了至少10%的统计上显著的值，例如比参照水平低至少20%的值、比参照水平低至少30%的值、比参照水平低至少40%的值、比参照水平低至少50%的值、比参照水平低至少60%的值、比参照水平低至少70%的值、比参照水平低至少80%的值、比参照水平低至少90%的值，最多达到且包括比参照水平低100% (即与参照样品相比不存在水平)。
本文使用的术语“增加的”或“增加”通常是指，增加了统计显著的量；为了避免疑惑，“增加的”是指，与参照水平相比统计上显著地增加了至少10%，包括增加了至少20%、 至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少100 %或更多，包括例如与参照水平(作为在本文中定义的该术语)相比增加至至少2倍、至少3倍、 至少4倍、至少5倍、至少10倍或更多。
本文使用的术语“高”通常是指，与参照水平相比增加了统计显著的量；为了避免疑惑，“高”是指比参照水平高了至少10%的统计上显著的值，例如与参照水平相比高了至少20%、高了至少30%、高了至少40%、高了至少50%、高了至少60%、高了至少70%、高了至少80%、高了至少90%、高了至少100%、为至少2倍高、为至少3倍高、为至少4倍高、 为至少5倍高、为至少10倍高或更多。
本文用于描述核酸分子的术语“重组的”是指，基因组的、cDNA、病毒的、半合成的和/或合成的起源的多核苷酸，因为它的起源或操作，所述多核苷酸不结合在自然界中它与之结合的多核苷酸序列的全部或一部分。关于蛋白或多肽所使用的术语“重组的”是指， 通过重组多核苷酸的表达所生成的多肽。关于宿主细胞所使用的术语“重组的”是指，其中已经导入了重组多核苷酸的宿主细胞。当提及物质(例如，细胞、核酸、蛋白或载体)时，重组也在本文中用于表示，该物质已经通过导入异源物质(例如，细胞、核酸、蛋白或载体)而进行了修饰。
术语“载体”表示这样的核酸分子其能够将其已经连接的异源核酸运输给宿主细胞，或介导所述异源核酸的表达；质粒是被术语“载体”包括的属的一个种。术语“载体”通常表示这样的核酸序列其含有在宿主细胞中复制和/或维持所必需的复制起点和其它实体。能够指导它们可操作地连接的基因和/或核酸序列的表达的载体，在本文中称作“表达载体”。一般而言，有用的表达载体经常是“质粒”的形式，所述质粒是指环状双链DNA环，当处于它们的载体形式时，它们不会结合染色体，且通常包括用于稳定或短暂表达的实体或编码的DNA。在本文公开的方法中可以使用的其它表达载体包括、但不限于质粒、附加体、 细菌人工染色体、酵母人工染色体、噬菌体或病毒载体，且这样的载体可以整合进宿主的基因组中，或自主地在特定细胞中复制。载体可以是DNA或RNA载体。也可以使用本领域技术人员已知的起等效功能的其它形式的表达载体，例如自主复制的染色体外载体或整合进宿主基因组中的载体。优选的载体是能够自主复制和/或表达它们所连接的核酸的那些。
冠词“一个”和“一种”在本文中用于表示一个或超过一个(即，至少一个)该冠词的语法对象。作为实例，“一个元件”是指一个元件或超过一个元件。
本文使用的术语“基本上由……组成”表示给定的实施方案必需的那些要素。该术语允许存在这样的要素所述要素不会实质上影响本发明的实施方案的基本和新颖或功能的特征。
术语“由……组成”表示这样的本文所述的组合物、方法和其各个组分其不含有在实施方案的描述中没有列举的任何要素。
除了在工作实施例中以外，或在另外指出的情况下，在本文中使用的表示成分或反应条件的量的所有数字，应当理解为在所有情况下被术语“约”修饰。当与百分比一起使用时，术语“约”可以表示士 1%。下面的内容进一步详细解释了本发明(包括所述实施例)，但是本发明的范围不限于它们。
应当理解，本发明不限于本文描述的具体方法学、方案和试剂等，且它们可以变化。本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，无意限制本发明的范围，所述范围仅由权利要求书限定。从下面的详细描述、附图和权利要求书中，可以明白本发明的其它特征和优点。
用于测定CMI应答的方法和组合物
本文描述了用于检测对抗原的CMI应答的方法和组合物。所述应答可以指示，例如，受试者的感染或其它抗原暴露。本文描述的方法和组合物特别适用于检测细胞内病原体。也描述了监测个体的产生针对给定靶抗原的CMI应答的能力的方法。所述方案使用从个体得到的生物样品，所述生物样品包括免疫细胞和能够加工和展示递送至它们的胞质溶胶的靶抗原的细胞。通常，从受试者得到这样的生物样品，并用靶抗原-LF多肽融合多肽 (例如，本文所述的LFn融合多肽)温育样品。
不希望受理论的约束，在用来自个体的细胞样品温育以后，LF多肽-靶抗原复合物(例如，Un多肽-靶抗原融合多肽)在LF多肽辅助下进入样品中的细胞的胞质溶胶中， 并作为抗原片段被加工和展示在这些细胞的表面上(与MHC分子相结合)。样品中预敏化的免疫细胞(例如，对任一种展示的靶抗原片段特异性的CD4+或CD8+T细胞)在它们的特异性T细胞受体与展示的靶抗原片段相互作用以后，会释放出一种或多种细胞因子。检测免疫细胞的细胞因子释放，由此提供下述指示或读出个体被表达所述靶抗原的病原体感染，或已经以其它方式暴露于所述靶抗原。
在一个实施方案中，通过差别表达方法，可以测定在本文所述的试验中存在阳性 CMI应答。也就是说，可以使用细胞因子水平与在参照样品中显示的水平的对比。作为本文定义的术语“增加”，给定的细胞因子或细胞因子集合的成员相对于参照的增加，指示阳性应答。
释放的细胞因子的身份和/或相对量可以进一步指示病原体的性质。也就是说， 特定病原体或病症可以产生这样的细胞因子释放特性所述特性是被那些病原体感染或以其它方式暴露或遭受那些病症(例如，自身免疫病)的个体的特征。
在下面的部分中，描述了执行本文所述的方法所需的各种组分和所述方法和组合物的不同方面的考虑。
I. LF 多肽
作为背景且不希望受理论的限制，致死毒素(LF)是2个二分蛋白外毒素(来自炭疽芽孢杆菌的致死毒素(LT)和水肿毒素(ET))之一。LT由保护抗原(PA)和致死因子 (LF)组成，而水肿毒素由PA和水肿因子(EF)组成。这三个组分PA、LF和EF单独都是无毒的。但是，一旦组合，水肿毒素会造成水肿，且LT会通过全身休克造成动物和人的死亡。与它在形成两种毒素中的关键作用相一致，已经将PA鉴别为针对炭疽的疫苗中的保护性组分。现在假设炭疽毒素作用的分子机制如下PA是通过细胞受体结合到哺乳动物细胞表面上的735-氨基酸多肽。一旦结合，PA会被细胞蛋白酶的蛋白水解性裂解活化成63-kDa分子，该分子能够在靶向的细胞的质膜中形成环形七聚体(图1) (Milne等人，(1994) J. Biol, Chem. 269, 20607-20612，Petosa，等人，(1997) Nature (London) 385，833-838)。PA 七聚体然后结合EF或LF，它们通过胞吞作用内化。在内体酸化以后，PA使EF或LF能够进入胞质溶胶中，推测是借助于七聚体形成的孔。在胞质溶胶内，EF起腺苷酸环化酶的作用(Leppla， S. H. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79，3162-3166)，将 ATP 转化成 cAMP。异常升高的 cAMP水平会扰乱细胞的代谢。
炭疽致死因子或LF是天然地生成的且具有MAPKK蛋白酶活性的蛋白。LF的删除分析表明，PA结合域位于LFn的氨基端内，且突变研究证实，PA结合域位于SEQ ID NO 1的LF 多肽的氨基酸:34-2 区域内和SEQ ID NO :2的LF多肽的氨基酸34-288区域内(Arora等 A, ]. Biol. Chem. 268 :33343341(1993) ；Milne，等人，(1995)Mol. Microbiol. 15，661-66)。
LF在胞质溶胶中的作用会造成宿主细胞的死亡，其机理尚不很清楚。LF会诱导许多淋巴因子的过量生产(Klimpel，等人，(1994)Mol. Microbiol. 13，1093-1100)，促成宿主动物的致死性全身休克。最近的研究也证实，LF具有2种酶活性它可以起锌金属蛋白酶的作用(Duesbery，等人，(1998)kience 280，734-737)，且它会灭活促分裂原活化的蛋白激酶(Harma，等人，.(1994) Mol. Med. 1,7-18)。尽管尚不清楚LF的这两种酶活性如何关联， 二者都是LF毒性所必需的。以前已经报道，炭疽毒素B部分可以用于递送表位，后者又会在有PA存在下引起免疫系统的抗体应答(W0 97/23236)。
LF是一种796氨基酸多肽，两种酶活性的功能结构域位于SEQ IDNO 1的氨基酸383和796之间。当与PA混合并添加给培养的巨噬细胞时，或当注射进动物中时，没有该催化结构域的N-端截短的LF完全丧失任何毒性效应。但是，它确实仍然有效地结合PA。Un的PA结合域存在于SEQ ID NO :2的残基；34_288内(Milne，等人，(1995)Mol. Microbiol. 15,661-66)。
83kDa PA多肽在它的羧基端结合细胞表面受体，在这里它被蛋白酶(例如，弗林蛋白酶、梭菌蛋白酶或胰蛋白酶)特异性地切割。该酶切割会释放出20kDa氨基端PA片段，而63kDa羧基端PA片段保持结合在细胞表面受体上。63kDa片段也称作“加工过的保护抗原”。加工过的PA含有在它的羧基端的细胞表面受体结合位点和在它的新氨基端的致死因子结合位点(参见，例如，Singh等人，J.Biol. Chem. 264 :19103 19107(1989))。加工过的PA可以通过体外、离体或体内酶切割或作为重组蛋白来生产。本文使用的术语PA是指具有致死因子结合位点的PA分子，例如，重组PA，天然存在的PA，含有致死因子结合位点的PA的功能等效物以及含有致死因子结合位点的PA融合蛋白。
II.包含LF多肽和靶抗原的组合物
发明人已经确信，致死因子(LF)的片段可以将融合的外源性的靶抗原递送至完整细胞的胞质溶胶。具体地，发明人以前已经证实，在没有PA存在下，与LFn或其片段物理地结合或融合的抗原，可以用于将抗原递送至完整活细胞的胞质溶胶，并引起针对该融合抗原的CTL应答。
本文所述的方法和试剂盒采用LF多肽来将靶抗原递送至来自受试者的细胞的胞质溶胶。涉及的LF多肽组合物通常包含LF多肽和靶抗原，其中LF多肽(例如，LFn)与靶抗原融合。或者，所述LF多肽可以以某些方式与靶抗原络合或结合，例如，形成LFn:靶抗原复合物。在有些实施方案中，所述组合物包含LF多肽靶抗原复合物，其中LF多肽(例如，Un)通过范德华力或其它非共价相互作用与靶抗原直接结合。在替代实施方案中，所述组合物包含LF多肽靶抗原复合物，其中LF多肽(例如，LFn多肽)与靶抗原间接结合，例如通过LFn多肽与至少一个第三部分的相互作用，且靶抗原与所述相同第三部分(其与LFn 多肽相互作用)相互作用。这样的相互作用可以是技术人员已知的任意非共价结合，包括， 但不限于范德华力、亲水相互作用、疏水相互作用和其它非共价相互作用。在有些实施方案中，至少1个或至少2个或至少3个或至少4个或更多个第三实体可以用于使LFn多肽与靶抗原结合。例如，LF多肽-靶抗原复合物可以包括这样的组合物其包含LFn:部分 靶抗原复合物或Lfn:部分部分靶抗原复合物、Lfn:部分部分部分靶抗原复合物等。在有些实施方案中，LP多肽所结合的部分(例如，LFn)可以与靶抗原所结合的部分相同或不同，且所有部分可以在复合物内是相同的，或在复合物内是不同的。
A. LFn
如上面所讨论的，“LFn多肽”包括由SEQ ID NO 3和4表示的LF多肽片段，以及保留将结合的或融合的多肽靶抗原递送至完整细胞(优选活细胞)的胞质溶胶的功能的重组LFn和功能性LFn等效物、片段和变体。术语“LFn多肽”因此包括功能性LFn同源物诸如多态变体、等位基因、突变体和密切相关的物种间变体，它们与LFn具有至少约60%氨基酸序列同一性，且具有将融合的多肽靶抗原递送至细胞的胞质溶胶的功能(使用本文所述的试验测得)。在具体实施方案中，所述LFn多肽与本文公开的SEQ ID NO :3和SEQ ID NO 4的Un基本上相同。在有些实施方案中，通过在美国专利申请10/473，190(它通过引用并入本文)中公开的方法和试验，可以测定起将多肽靶抗原递送至完整细胞的功能的LFn的有些功能性多态变体、等位基因、突变体和密切相关的物种间变体。
在有些实施方案中，LFn模仿物可用于本文所述的组合物和方法中。“LFn模仿物” 表示起LFn的功能将靶抗原递送至细胞的胞质溶胶以诱导针对该抗原的CMI应答的化合物或分子，例如，肽、多肽或小化学分子。Un模仿物因而包括Un同源物。Un模仿物也包括保留LFn的将融合的或结合的多肽抗原递送至细胞的胞质溶胶的功能的小Un肽，及其保守置换变体，以及保留LFn的将融合的或结合的多肽抗原递送至细胞的胞质溶胶的能力的截短形式的Un。如下测试LFn模仿物使用在本文中和在美国专利申请10/473，190(其通过引用整体并入本文)的实施例中公开的对靶抗原的CMI应答的测定法，例如，对递送的靶抗原的CTL应答的诱导。当测试Un模仿物时，Un通常用作靶抗原向细胞的递送的阳性对照。
发明人已经发现，至少约250个氨基酸或更小、或至少约150个氨基酸或更小、或至少约104个氨基酸或更小的LFn片段能够将融合的靶抗原递送给细胞，且可用于本文的 CMI应答的方法和组合物中。
在有些实施方案中，本文所述的LFn多肽包含PA的非功能性结合位点，因而是不会产生与PA的功能性结合的LFn突变体。这样的突变体包括、但不限于在一个或多个与PA相互作用的关键残基处改变的突变体，诸如在一个或多个下述残基中的突变Y22 ； L188 ；D187 ；Υ226 ；L235 ；Η229 (参见 Lacy 等人，JBC, 2002 ；277 ；3006-3010) ；D106A ；Υ108Κ ；E135K ；D136K ；N140A 和 K143A (参见 Melnyk 等人，JBC，2006 ；281 ； 1630-1635 和 Cunningham 等人，PNAS，2002 ；99 ；70497052，它们通过引用整体并入本文)。
B.靶抗原
用于本文所述的组合物和方法中的抗原可以是任意靶抗原，包括、但不限于病原性肽、毒素、类毒素、它们的亚基或它们的组合(例如，霍乱毒素、破伤风类毒素)。
可以与LF多肽或LFn多肽融合的靶抗原可以是与传染病或癌症或免疫病有关的任意抗原。在有些实施方案中，与LF多肽融合的靶抗原可以是由多种传染物(包括病原体、 病毒、细菌、真菌或寄生物)中的任一种表达的抗原。
如本文所讨论的，完整的(即整个的或全部的)靶抗原可以与LF多肽融合。在该背景下，“完整”是指，靶抗原是与在自然界中存在的抗原多肽相同的全长靶抗原。这与仅递送靶抗原的小部分或肽形成直接对比。通过向细胞递送完整靶抗原，LF多肽能够实现或促进针对完整靶抗原的整个范围的表位(而不是仅单个或选择的几个肽表位)的CMI应答的检测。因此，本文所述的方法和组合物会提供用于检测CMI应答的试验，所述试验比使用基于肽的靶抗原更灵敏，且具有更高的特异性，因为当使用整个靶抗原来测定CMI应答时，更可能检测到基本上针对完整抗原的任意表位产生的应答。
在有些实施方案中，为了避免与本文所述的方法提供的增加的灵敏度有关的假阳性，也可以将完整靶抗原分成整个靶抗原的片段或部分，例如，至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个或更多个靶抗原片段，这取决于完整靶抗原蛋白的大小。整个靶抗原的这些片段可以用作治疗控制，以滤出针对与LF多肽融合的整个靶抗原的阳性CMI应答的假阳性。仅作为一个实例，通过评估与LFn (它们是整个靶抗原的片段)融合的靶抗原集合的 CMI应答，可以证实针对与LFn融合的整个靶抗原的阳性CMI应答。如果1个或2个片段 (但是并非所有片段)产生阳性应答，则证实真实的CMI应答。如果检测到所有片段的阳性 CMI应答，则针对与LFn融合的整个靶抗原的阳性CMI应答可能是假阳性。
在有些实施方案中，可以将完整靶抗原分成许多部分(这取决于起始靶抗原的大小)，用作亚靶抗原集合。通常，在整个靶抗原是多聚体多肽的情况下，可以将整个靶蛋白分成亚基和/或结构域，它们可以各自单独地与LF多肽(例如，LFn多肽)融合，以建立靶抗原的LF多肽-融合多肽集合，它们可以用于本文公开的试验方法和组合物中。或者，可以将完整靶抗原分成整个靶抗原的片段或部分，例如，至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个、或至少6个、或至少7个、或至少8个、或至少约9个、或至少约10个、或至少约 11个、或至少约12个、或至少约13个、或至少约15个、或至少约20个、或至少约25个、或超过25个片段，且每个片段单独地与LF多肽融合，以建立靶抗原的LF多肽-融合多肽集合，它们可以用于本文公开的试验方法和组合物中。
全长靶抗原多肽的片段化或分隔可以是全长靶抗原多肽的均等分隔，或者，在有些实施方案中，所述片段化是不对称的或不等的。作为一个非限制性实例，在将靶抗原分成2个重叠片段的情况下，可以将靶抗原分成大致相同(相等)大小的片段，或者，一个片段可以是整个靶抗原的约45%，且另一个片段可以是约65%。作为其它非限制性实例，可以将整个靶抗原分成不同大小的片段的组合，例如，在将靶抗原分成2个片段的情况下，可以将片段分成整个靶抗原的约40 %和约70 %、或约45 %和约65 %、或约35 %和约75 %、或约25%和约85%。包括全长完整靶抗原的重叠片段的任意组合，用于制备靶抗原的重叠LFn-融合多肽的集合。仅作为一个例证性实施例，在将靶抗原分成5部分的情况下，可以均等地(即每个重叠片段是靶抗原的整个全长的约21-25% )或不均等地(即可以将靶抗原分成下述5个重叠片段片段1是全长靶抗原大小的约25%、片段2是约5%、片段3是约 35 %、片段4是约10 %且片段5是约25 %，条件是，每个片段与至少1个其它片段重叠)分隔所述部分。
通常，含有靶抗原片段的LFn-融合体集合基本上涵盖了整个(或完整)靶抗原多肽的整个长度。因此，本文描述了一种用于检测对靶抗原集合的CMI应答的方法，所述靶抗原是靶抗原的重叠蛋白或重叠多肽，而不是靶抗原的重叠肽。由于与LFn融合的片段是整个靶抗原的重叠蛋白(相对于重叠肽)，它们可以用于鉴别整个靶抗原的那些多肽片段引起CMI应答。与在CMI试验中使用单独的肽(未融合LFn)相比，可以更快速地且更廉价地生产与LFn融合的靶抗原的重叠蛋白片段，并具有增加的稳定性，从而与使用肽的其它CMI 试验相比，显著降低本文公开的试验的成本。此外，使用本文所述的LF多肽融合体，可以导入比简单的肽更大的多肽。在构象对于表位识别而言是重要的情况下，更大的片段会提供胜过肽片段的益处。
如本文所讨论的，使用与LFn融合的靶抗原的重叠蛋白，会增加CMI应答的特异性。例如，本文公开的CMI试验能够区别已经针对病原体免疫的受试者和被病原体感染或已经暴露于病原体的受试者之间的差异。在另一个实施例中，本文公开的CMI试验可以区别T细胞靶物。因此，本文公开的诊断方法和CMI试验会提供简单的、廉价的且快速的检测对靶抗原的CMI应答和/或检测受病状(诸如病原体感染)影响的受试者的方法。
本领域普通技术人员可以将整个靶抗原分成靶抗原的重叠蛋白，它们可以与LFn 融合，以建立靶抗原的LFn-融合多肽集合。仅作为示例性的实施例，可以将包含SEQ ID NO :7的TB-特异性的靶抗原TB 1 (CFP也称作培养物滤液-10或CFP-10)分成，例如至少 17个片段，诸如在表1中所示的SEQ ID NO 30-46的那些，以制备17种不同的LFn-融合多肽的集合，每种Un-融合多肽包含与LFn融合的不同的、但是重叠的TB-特异性的靶抗原TBI (CFP)片段。培养物滤液蛋白(CFP-10) (Genbank AAC83445)是一种来自结核分枝杆菌的IOkDaUOO氨基酸残基蛋白片段。它也称作L45抗原同源蛋白(LHP)。其氨基酸序列是
MAEMKTDAATLAQEAGNFERISGDLKTQIDQVESTAGSLQGQffRGAAGTAAQAAVVRFQEAANKQK
QELDEISTNIRQAGVQYSRADEEQQQALSSQMGF(SEQ. ID. NO. 7)。
在另一个实施例中，可以将包含SEQ ID NO :6的TB-特异性的靶抗原TB2 (ESAT，也称作“早期分泌的抗原靶物-6多肽”或“ESAT-6” )分成，例如至少23个片段，诸如在表1 中所示的SEQ ID NO 8-29的那些，以制备23种不同的LFn-融合多肽的集合，每种LFn-融合多肽包含与Un融合的不同的、但是重叠的TB-特异性的靶抗原TB2(ESAT)片段。早期分泌的抗原靶物(ESAT-6)是一种来自结核分枝杆菌的95个氨基酸残基的蛋白片段。其氨基酸序列是
MTEQQWNFAGIEAAASAIQGNVTSIHSLLDEGKQSLTKLAAAWGGSGSEAYQGVQQKWDATATELN
NALQNLARTISEAGQAMASTEGNVTGMFA(SEQ. ID. NO. 6)。
在有些实施方案中，整个靶抗原的片段是全长靶抗原大小的基本上约一半，或全长靶抗原大小的基本上约1/3，或全长靶抗原大小的基本上约1/4，或小于全长靶抗原大小的基本上1/4。在所有情况下，全长完整靶抗原的片段应当与整个靶抗原的至少1个(但是优选地超过1个)其它片段重叠。作为一个实例，17种不同的LFn-融合多肽的集合包含TBI (CFP)多肽的不同片段，每个片段与至少2个或3个其它片段重叠。重叠量可以随片段的大小和全长靶抗原已经分成的片段的数目而变化。片段之间的典型的重叠量可以是约 10%、或约20%或约30%或约40%或约50%或约60%或约70%或约80%或更多，或在约 10%至约80%之间的任意重叠。作为一个实例，对于表1所示的TBI (CFP)靶抗原多肽的每种不同片段，每种片段中的大约73%与每个邻近的片段重叠(即每个片段与在它前面和在它后面的片段重叠约73%)。
表1.整个TB-特异性的靶抗原TB-I (CFP)和TB_2 (ESAT)的片段
权利要求
1.一种测量受试者中对靶抗原的细胞介导的免疫应答(CMI)的方法，所述方法包括下述步骤a.用至少一种融合多肽温育来自所述受试者的生物样品，所述融合多肽包含LF多肽的一部分，该部分缺少LF酶活性，但是足以促进所述融合多肽向细胞的跨膜递送，所述部分与靶抗原多肽或其片段融合，其中所述生物样品包含免疫系统的细胞，所述细胞响应于抗原而释放出至少一种细胞因子；b.测量在所述生物样品中释放的至少一种细胞因子的水平；和c.对比所述生物样品中所述细胞因子的水平和相同细胞因子的参照水平，其中来自受试者的所述生物样品中所述细胞因子的水平相对于细胞因子参照水平的增加，指示对靶抗原的细胞介导的免疫应答(CMI)。
2.一种检测受试者的目标病状的方法，所述方法包括下述步骤a.用至少一种融合多肽温育来自所述受试者的生物样品，所述融合多肽包含LF多肽的一部分，该部分缺少LF酶活性，但是足以促进所述融合多肽向细胞的跨膜递送，所述部分与靶抗原多肽或其片段融合，其中所述靶抗原在受该病状影响的组织中表达，且其中所述生物样品包含免疫系统的细胞，所述细胞响应于抗原而释放出至少一种细胞因子；b.测量在所述生物样品中释放的至少一种细胞因子的水平；和c.对比所述生物样品中所述细胞因子的水平和相同细胞因子的参照水平，其中来自受试者的所述生物样品中所述细胞因子的水平相对于细胞因子参照水平的增加，会将受试者鉴别为具有所述病状，或具有增加的遭受所述病状的风险。
3.一种测量受试者中对靶抗原的细胞介导的免疫应答(CMI)的方法，所述方法包括下述步骤a.用至少一种靶抗原温育来自所述受试者的生物样品，其中所述生物样品包含免疫系统的细胞，所述细胞在被靶抗原刺激以后释放出至少一种细胞因子；b.测量在所述生物样品中释放的细胞因子的存在或水平，其中细胞因子的存在或水平指示对靶抗原的细胞介导的免疫应答(CMI)在来自受试者的生物样品中的存在；其中所述改进包括，在温育步骤(a)中，用与LF多肽的一部分融合的至少一种靶抗原多肽或其片段温育生物样品，所述部分缺少LF酶活性，但是足以促进所述融合多肤向细胞的跨膜递送。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述LF多肽部分包含SEQID NO 3的至少60个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置换变体。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述LF多肽部分包含SEQID NO 3的至少80个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置换变体。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述LF多肽部分包含SEQID NO 3的至少104个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置换变体。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述LF多肽部分包含与SEQID N0:3相对应的氨基酸序列或其促进跨膜递送的保守置换变体。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述LF多肽部分不结合炭疽芽孢杆菌 PA多肽。
9.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述LF多肽部分基本上缺少SEQID NO 3的氨基酸1-33。
10.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述LF多肽部分由SEQID NO 4或其促进跨膜递送的保守置换变体组成。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述靶抗原多肽或其片段的长度是至少15个氨基酸。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述靶抗原多肽或其片段折叠成它的天然构象。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述靶抗原多肽或其片段是多分子多肽复合物的一部分。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述靶抗原多肽是多分子多肽靶抗原的亚基多肽。
15.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述靶抗原多肽的片段基本上是全长靶抗原的大小的1/2。
16.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述靶抗原多肽的片段基本上是全长靶抗原大小的1/3。
17.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述靶抗原多肽的片段基本上是全长靶抗原大小的1/4。
18.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述靶抗原多肽的片段小于全长靶抗原大小的1/4，且其中所述片段的长度是至少15个氨基酸。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述生物样品是全血样品。
20.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述生物样品是血浆或淋巴结生物样
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞选自下述的一种或多种NK细胞、T-细胞、B-细胞、Th细胞、Th 1细胞、Th2细胞、Tc细胞、基质细胞、内皮细胞、 白细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、树突细胞、巨噬细胞、肥大细胞和单核细胞。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是T-细胞。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述细胞因子选自GM-CSF、IL-Iα、 IL-I β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IFN- α、IFN- β、IFN- γ、 MIP-I α、MIP-I β、TGF- β , TNF α 禾口 TNF β。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述细胞因子是选自下述的T-细胞细胞因子:IFN-y ,TGF^ , TNF β , IL-10、GM-CSF、IL-3, IL-4 和 IL-5。
25.如权利要求I-M中任一项所述的方法，其中所述细胞因子是IFN-γ。
26.如权利要求2所述的方法，其中所述目标病状是病原性感染。
27.如权利要求2所述的方法，其中所述目标病状是癌症。
28.如权利要求2所述的方法，其中所述目标病状是自身免疫病。
29.如权利要求1- 中任一项所述的方法，其中所述靶抗原多肽或其片段是病原体的抗原。
30.如权利要求2或四中任一项所述的方法，其中所述病原体选自结核分枝杆菌 (TB)、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、HBV、巨细胞病毒、非洲淋巴细胞瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒、人疱疹病毒6、人疱疹病毒7、人疱疹病毒8、天花病毒、水疱性口炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、鼻病毒、冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒.麻疹病毒、多瘤病毒、人乳头瘤病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯萨奇病毒、登革热病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、鲁斯肉瘤病毒、黄热病病毒、埃波拉病毒、马尔堡病毒、拉沙热病毒、东方马脑炎病毒、日本脑炎病毒、 圣路易斯脑炎病毒、Murray山谷热病毒、西尼罗病毒、立夫特山谷热病毒、甲型轮状病毒、乙型轮状病毒、丙型轮状病毒、Sindbis病毒、人T-细胞白血病病毒1型、汉坦病毒、风疹病毒和猿免疫缺陷病毒。
31.如权利要求2或四中任一项所述的方法，其中所述病原体是结核分枝杆菌。
32.如权利要求1力6或四-31中任一项所述的方法，其中所述靶抗原多肽是TB-特异性的抗原。
33.如权利要求146或四-32中任一项所述的方法，其中所述靶抗原多肽是包含SEQ ID NO 7的TBI (CFP)多肽或其片段。
34.如权利要求1-26- 或32中任一项所述的方法，其中所述靶抗原多肽是包含SEQ ID NO 6的TB2 (ESAT)多肽或其片段。
35.如权利要求1-34中任一项所述的方法，其中在蛋白表达水平测量所述细胞因子。
36.如权利要求1-35中任一项所述的方法，其中使用抗体、人源化的抗体、抗体片段、 重组抗体、嵌合抗体、适体、肽或其类似物，测量所述细胞因子。
37.如权利要求1-35中任一项所述的方法，其中使用选自下述的方法，测量所述细胞因子免疫测定、放射免疫测定(RIA)、免疫放射测定(IRMA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)； 酶联免疫斑点测定；CELISA (细胞的酶联免疫吸附测定)；RHPA (反向溶血空斑测定)或激酶受体活化测定(KIRA)。
38.如权利要求1-37中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物受试者。
39.如权利要求1-38中任一项所述的方法，其中所述受试者是人受试者。
40.如权利要求34所述的方法，其中所述靶抗原多肽的片段选自SEQID NO :8至SEQ ID NO 丨9。
41.如权利要求33所述的方法，其中所述靶抗原多肽的片段选自SEQID NO :30至SEQ ID NO :46。
42.如权利要求1-39中任一项所述的方法，其中所述温育包括用融合多肽集合温育所述生物样品，所述融合多肽集合包含与靶抗原多肽或其片段融合的LFn多肽，其中所述融合多肽集合包含靶抗原多肽或其基本上覆盖靶抗原多肽的整个全长的片段。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述融合多肽集合包含多个与靶抗原多肽或其片段融合的LFn多肽，其中所述靶抗原多肽或其片段是重叠的和/或邻近的靶抗原多肽片段， 其基本上覆盖靶抗原多肽的整个全长。
44.如权利要求42或43中任一项所述的方法，其中所述融合多肽集合是至少2种融合多肽。
45.如权利要求42或43中任一项所述的方法，其中所述融合多肽集合是2-5种融合多肽。
46.如权利要求42或43中任一项所述的方法，其中所述融合多肽集合是6-10种融合多肽。
47.如权利要求42或43中任一项所述的方法，其中所述融合多肽集合是11-15种融合多肽。
48.如权利要求42或43中任一项所述的方法，其中所述融合多肽集合是16-20种或更多种融合多肽。
49.如权利要求42-48中任一项所述的方法，其中所述融合多肽集合包含至少2种所述 LF多肽，所述LF多肽与选自下述的不同靶抗原片段融合SEQ ID NO :8至SEQ ID NO :29。
50.如权利要求42-48中任一项所述的方法，其中所述融合多肽集合包含至少2种所述LF多肽，所述LF多肽与选自下述的不同靶抗原片段融合SEQ ID NO 30至SEQ ID NO 46。
51.如权利要求1或3中任一项所述的方法，其中CMI应答将受试者鉴别为具有病状或处于具有病状的危险中。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述病状选自病理学感染；癌症；传染病；和自身免疫病。
53.如权利要求1或3中任一项所述的方法，其中CMI应答会将受试者鉴别为可能已经暴露于所述靶抗原或表达所述靶抗原的病原体。
54.如权利要求1或3中任一项所述的方法，其中CMI应答将受试者鉴别为，与被鉴别为具有低或否定的引起CMI应答的能力的受试者相比，其具有或可能具有更好的预后。
55.一种用于监测受试者的目标病状的方法，所述方法包括评估受试者的引起对靶抗原的细胞介导的免疫(CMI)应答的能力，其中所述方法包括a.用多肽温育在试验时间点从受试者收集的生物样品，所述多肽包含LF多肽的一部分，该部分缺少LF酶活性，但是足以促进所述融合多肽向细胞的跨膜递送，所述多肽与靶抗原多肽或其片段融合，其中所述靶抗原在受所述病状影响的组织中表达，且其中所述生物样品包含免疫系统的细胞，所述细胞响应于抗原而释放出至少一种细胞因子；b.测量在所述生物样品中释放的至少一种细胞因子的水平；和c.对比所述生物样品中所述细胞因子的水平和相同细胞因子的参照水平，其中如果检测到在试验时间点从受试者得到的所述生物样品中的所述细胞因子的水平相对于所述细胞因子的参照水平的增加，则将所述受试者鉴别为，具有引起对所述靶抗原多肽或其片段的细胞介导的免疫(CMI)应答的能力。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述参照细胞因子水平是从没有受所述病状影响的受试者得到的至少一个或多个生物样品中的细胞因子水平。
57.如权利要求55或56中任一项所述的方法，其中所述参照细胞因子水平是在比所述试验时间点更早的时间点从受试者得到的生物样品中的细胞因子水平。
58.如权利要求55所述的方法，所述方法另外包括用合适的治疗方案，治疗被鉴别为具有引起细胞介导的(CMI)应答的能力的受试者。
59.如权利要求55所述的方法，所述方法另外包括指导被鉴别为具有引起细胞介导的(CMI)应答的能力的受试者的治疗，其中从业人员评审细胞因子的水平，如果受试者被鉴别为具有引起细胞介导的(CMI)应答的能力，则从业人员指导用合适的治疗方案治疗受试者。
60.如权利要求55所述的方法，所述方法另外包括预测受试者的病状的预后，其中如果受试者被鉴别为具有引起细胞介导的(CMI)应答的能力，则将所述受试者鉴别为，与被鉴别为具有低或否定的引起CMI应答的能力的受试者相比，可能具有更好预后。
61.如权利要求55所述的方法，所述方法另外包括预测受试者发展病状的风险，其中如果受试者被鉴别为具有引起细胞介导的(CMI)应答的能力，将所述受试者鉴别为，与被鉴别为具有低或否定的引起CMI应答的能力的受试者相比，其发展病状的可能性更低。
62.如权利要求55-61中任一项所述的方法，其中所述目标病状是病原性感染。
63.如权利要求55-61中任一项所述的方法，其中所述目标病状是癌症。
64.如权利要求55-61中任一项所述的方法，其中所述目标病状是自身免疫病。
65.如权利要求55-64中任一项所述的方法，其中所述LF多肽部分包含SEQID NO 3 的至少80个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置换变体。
66.如权利要求55-65中任一项所述的方法，其中所述LF多肽部分包含SEQID NO 3 的至少80个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置换变体。
67.如权利要求55-66中任一项所述的方法，其中所述LF多肽部分包含SEQID NO 3 的至少104个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置换变体。
68.如权利要求55-67中任一项所述的方法，其中所述LF多肽部分包含与SEQID NO 3相对应的氨基酸序列或其促进跨膜递送的保守置换变体。
69.如权利要求55-68中任一项所述的方法，其中所述LF多肽部分不结合炭疽芽孢杆菌PA多肽。
70.如权利要求55-69中任一项所述的方法，其中所述LF多肽部分基本上缺少SEQID NO 3的氨基酸1-33。
71.如权利要求55-70中任一项所述的方法，其中所述LF多肽部分由SEQID NO :4或其促进跨膜递送的保守置换变体组成。
72.如权利要求55-71中任一项所述的方法，其中所述靶抗原多肽或其片段的长度是至少15个氨基酸。
73.如权利要求55-72中任一项所述的方法，其中所述靶抗原多肽或其片段折叠成它的天然构象。
74.如权利要求55-73中任一项所述的方法，其中所述靶抗原是多分子多肽复合物的一部分。
75.如权利要求55-74中任一项所述的方法，其中所述靶抗原多肽的片段是多分子多肽靶抗原的亚基多肽。
76.如权利要求55-75中任一项所述的方法，其中所述靶抗原多肽的片段基本上是全长靶抗原的大小的1/2。
77.如权利要求55-75中任一项所述的方法，其中所述靶抗原多肽的片段基本上是全长靶抗原大小的1/3。
78.如权利要求55-75中任一项所述的方法，其中所述靶抗原多肽的片段基本上是全长靶抗原大小的1/4。
79.如权利要求55-75中任一项所述的方法，其中所述靶抗原多肽的片段小于全长靶抗原大小的1/4，且其中靶抗原的非肽片段是至少20个氨基酸。
80.如权利要求55-79中任一项所述的方法，其中所述生物样品是全血样品。
81.如权利要求55-80中任一项所述的方法，其中所述生物样品是血浆或淋巴结生物样品。
82.如权利要求55-81中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞选自下述的一种或多种NK细胞、T-细胞、B-细胞、Th细胞、Thl细胞、Th2细胞、Tc细胞、基质细胞、内皮细胞、 白细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、树突细胞、巨噬细胞、肥大细胞和单核细胞。
83.如权利要求55-82中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是T-细胞。
84.如权利要求55-83中任一项所述的方法，其中所述细胞因子选自GM-CSF、IL-la、 IL-I β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IFN- α、IFN- β、IFN_g、 MIP-I α、MIP-I β、TGF- β , TNF α 禾口 TNF β。
85.如权利要求55-84中任一项所述的方法，其中所述细胞因子是选自下述的T-细胞细胞因子:IFN-g、TGF3、TNF3、IL-10、GM-CSF、IL-3, IL-4 和 IL-5。
86.如权利要求55-85中任一项所述的方法，其中所述细胞因子是IFN-g。
87.如权利要求55-86中任一项所述的方法，其中所述靶抗原多肽或其片段是病原体的抗原。
88.如权利要求87所述的方法，其中所述病原体选自结核分枝杆菌(TB)、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、HBV、巨细胞病毒、非洲淋巴细胞瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒、人疱疹病毒6、人疱疹病毒7、人疱疹病毒8、天花病毒、水疱性口炎病毒、甲型肝炎病毒、 乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、鼻病毒、冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒.麻疹病毒、多瘤病毒、人乳头瘤病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯萨奇病毒、登革热病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、鲁斯肉瘤病毒、黄热病病毒、埃波拉病毒、马尔堡病毒、拉沙热病毒、东方马脑炎病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、Murray山谷热病毒、西尼罗病毒、立夫特山谷热病毒、甲型轮状病毒、乙型轮状病毒、 丙型轮状病毒、Sindbis病毒、人T-细胞白血病病毒1型、汉坦病毒、风疹病毒和猿免疫缺陷病毒。
89.如权利要求87所述的方法，其中所述病原体是结核分枝杆菌。
90.如权利要求55-62或65-87中任一项所述的方法，其中所述靶抗原是TB-特异性的抗原。
91.如权利要求55-62或65-87中任一项所述的方法，其中所述靶抗原是TBI(CFP)多肽或其片段。
92.如权利要求55-62或65-87中任一项所述的方法，其中所述靶抗原是TB2(ESAT)多肽或其片段。
93.如权利要求55-92中任一项所述的方法，其中在蛋白表达水平测量所述细胞因子。
94.如权利要求1-83中任一项所述的方法，其中使用抗体、人源化的抗体、抗体片段、 重组抗体、嵌合抗体、适体、肽或其类似物，测量所述细胞因子。
95.如权利要求55-94中任一项所述的方法，其中使用选自下述的方法，测量所述细胞因子免疫测定、放射免疫测定(RIA)、免疫放射测定(IRMA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)； 酶联免疫斑点测定；CELISA[细胞的酶联免疫吸附测定；RHPA (反向溶血空斑测定)或激酶受体活化测定(KIRA)。
96.如权利要求55-95中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物受试者。
97.如权利要求55-96中任一项所述的方法，其中所述受试者是人受试者。
98.一种测量来自受试者的生物样品中对靶抗原多肽的细胞介导的免疫(CMI)应答的试剂盒，所述试剂盒包含融合多肽，所述融合多肽包含与靶抗原多肽或其片段融合的LF多肽的一部分，该部分缺少LF酶活性，但是足以促进所述融合多肽向细胞的跨膜递送。
99.如权利要求98所述的试剂盒，其中所述LF多肽部分包含SEQID NO 3的至少60 个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置换变体。
100.如权利要求98或99中任一项所述的试剂盒，其中所述LFn多肽部分包含SEQID NO 3的至少80个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置换变体。
101.如权利要求98-100中任一项所述的试剂盒，其中所述LFn多肽部分包含SEQID NO 3的至少104个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置换变体。
102.如权利要求98-101中任一项所述的试剂盒，其中所述Un多肽部分包含与SEQID NO 3相对应的氨基酸序列或其促进跨膜递送的保守置换变体。
103.如权利要求98-102中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含所述融合多肽集合，其中所述融合多肽集合包含基本上连续的靶抗原片段，所述片段一起基本上覆盖靶抗原多肽的全长。
104.如权利要求103所述的试剂盒，其中所述融合多肽集合是至少2种融合多肽。
105.如权利要求103所述的试剂盒，其中所述融合多肽集合是2-5种融合多肽。
106.如权利要求103所述的试剂盒，其中所述融合多肽集合是6-10种融合多肽。
107.如权利要求103所述的试剂盒，其中所述融合多肽集合是11-15种融合多肽。
108.如权利要求103所述的试剂盒，其中所述融合多肽集合是16-20种或更多种融合多肽。
109.如权利要求103所述的试剂盒，其中所述融合多肽集合包含至少2种所述融合多肽，所述融合多肽包含不同的靶抗原多肽片段，所述片段选自SEQ ID NO :8至SEQ ID NO 29。
110.如权利要求103所述的试剂盒，其中所述融合多肽集合包含至少2种所述融合多肽，所述融合多肽包含不同的靶抗原多肽片段，所述片段选自SEQ ID NO :30至SEQ ID NO 46。
111.一种用于测量来自受试者的生物样品中对靶抗原多肽的细胞介导的免疫(CMI) 应答的试剂盒，所述试剂盒包含a.LF多肽的一部分，该部分缺少LF酶活性，但是足以促进所述融合多肽向细胞的跨膜递送；b.用于将所述LF多肽部分缀合到靶抗原多肽或其片段上的试剂；和c.基于抗体的检测工具，其用于检测由生物样品释放的至少一种细胞因子。
112.一种用于测量来自受试者的生物样品对TB抗原多肽的细胞介导的免疫(CMI)应答的试剂盒，所述试剂盒包含a与TB-特异性的抗原多肽融合的LF多肽的一部分，该部分缺少LF酶活性，但是足以促进所述融合多肽向细胞的跨膜递送；和b基于抗体的检测工具，其用于检测由生物样品释放的至少一种细胞因子。
113.如权利要求98-112中任一项所述的试剂盒，其任选地另外包含阳性和阴性生物样品对照，其中阳性样品会引起对靶抗原的CMI应答，且阴性生物样品不引起CMI应答。
114.如权利要求112所述的试剂盒，其中所述TB-特异性的抗原多肽是SEQID NO 7 的TBI (CFP)多肽或其片段。
115.如权利要求112所述的试剂盒，其中所述靶抗原多肽是SEQIDNO :6的TB2 (ESAT) 多肽或其片段。
116.如权利要求98、106或112中任一项所述的试剂盒，其中所述靶抗原多肽的片段选自SEQ ID NO 8 至 SEQ ID NO :29。
117.如权利要求98、106或112中任一项所述的试剂盒，其中所述靶抗原多肽的片段选自SEQ ID NO 30 至 SEQ ID NO :46。
全文摘要
描述了用于检测或监测个体的产生对靶抗原的细胞介导的免疫应答的能力的组合物和方法。所述方法部分地依赖于致死因子(LF)多肽与靶抗原的物理结合，例如，融合。LF多肽部分(包括，例如，LFn多肽部分)起转运因子的作用，将靶抗原(包括全长靶多肽)递送至来自个体的完整活免疫细胞的胞质溶胶。测量来自个体的免疫细胞的细胞因子应答，会提供细胞介导的免疫应答的读出。所述的方法和组合物会提供诊断以及预后信息，且可以引导治疗的方向。
文档编号G01N33/50GK102549425SQ201080038639
公开日2012年7月4日 申请日期2010年6月11日 优先权日2009年6月12日
发明者H·郭, N·托斯简, W·郑, 吕亦晨 申请人:疫苗技术公司